骨形成蛋白4对人视网膜微血管内皮细胞糖酵解水平的影响

目的观察骨形成蛋白4 (BMP4)对人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)中糖酵解水平的影响。方法实验研究。将体外培养的hRMEC分为正常组、4-羟基壬烯醛(HNE)组(4-HNE组)、4-HNE+BMP4处理组(BMP4组)。4-HNE组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE;BMP4组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE刺激6 h后, 再加入100 ng/ml重组人BMP4。采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;噻唑蓝比色法检测4-HNE对细胞生存力的影响;细胞划痕实验、Transwell小室法测定4-HNE对细胞迁移能力的影响。采用实时定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测正常组、4-HNE组细胞中BMP4、SMAD同源物9 (SMAD9) mRNA、蛋白相对表达量。采用Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解代谢水平。组间比较采用单因素方差分析。结果正常组、4-HNE组、BMP4组hRMEC内ROS水平分别为21±1、815±5、810±7。与正常组比较, 4-HNE组、BMP4组ROS水平显著...     

艾塞那肽对4-羟基壬烯醛诱导人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的抑制作用

目的　观察艾塞那肽（exendin-4,EX4）对4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞氧化应激损伤的抑制作用。方法　体外培养人RPE细胞（ARPE-19）,采用CCK-8法检测不同浓度EX-4处理后细胞增殖情况;利用倒置显微镜观察对照组、EX4处理组、4-HNE组和4-HNE+EX4处理组细胞形态变化;利用荧光显微镜观察各组细胞的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）生成;运用流式细胞仪检测各组RPE细胞内ROS含量变化;化学比色法检测细胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量变化。结果　100.0 nmol·L^-1 EX4对RPE细胞具有较强的保护作用,在此浓度下对10 μmol·L^-1 4-HNE引起的氧化应激损伤具有较强的抑制作用（P<0.05）。荧光显微镜观察发现,与对照组相比,4-HNE组亮绿色高荧光信号明显增强;与4-HNE组相比,4-HNE+EX4处理组荧光信号强度明显减弱,细胞内ROS含量明显减少。流式细胞仪检测也发现,与对照组相比,4-HNE组细胞内ROS含量升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与4-HNE组比较,4-HNE+EX4处理组细胞内ROS含量明显降低（P<0.05）。4-HNE组SOD含量明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）;与4-HNE组比较,4-HNE+EX4处理组SOD含量明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,4-HNE组MDA含量明显升高（P<0.01）;4-HNE+EX4处理组MDA含量较4-HNE组明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论　EX4对4-HNE诱导人RPE细胞的氧化应激损伤具有保护作用,对老年性黄斑变性的治疗具有一定的潜在价值。     

骨形成蛋白4靶向调控SMAD9表达影响Müller细胞迁移和活性氧产生

目的观察并初步探讨骨形成蛋白4(BMP4)靶向调控SMAD9表达对Müller细胞迁移、活性氧(ROS)生成以及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养的Müller细胞分为正常对照组、BMP4组、BMP4+空载质粒组(BMP4+NC组)、BMP4+SMAD9小干扰质粒组(BMP4+siSMAD9)。BMP4组、BMP4+NC组、BMP4+siSMAD9组细胞培养基加入100 ng/ml BMP4诱导细胞24 h。其后, BMP4+NC组转染空载质粒;BMP4+siSMAD9组转染SMAD9小干扰质粒48 h。细胞划痕实验测定BMP4对Müller细胞迁移的影响;流式细胞仪检测BMP4对Müller细胞内ROS生成的影响;蛋白质免疫印迹法(Western blots)、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测Müller细胞内谷氨酰胺合成酶(GS)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)蛋白、mRNA相对表达量;免疫荧光检测Müller细胞内VEGF的表达。多组间比较采用单因素方差分析。结果细胞划痕实验检测结果显示, BMP4+ siSMAD9组细胞迁移率较BMP4组、BMP4+NC...     

糖尿病小鼠视网膜p21活化激酶4表达上调及其对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响

目的观察p21活化激酶4(PAK4)对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响。方法实验研究, 分为体内动物实验和体外细胞实验两部分。体内动物实验:健康C57BL/6J雄性小鼠12只, 随机分为正常对照组、糖尿病组, 每组各6只小鼠。糖尿病组小鼠经链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型。建模后8周, 采用蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜PAK4表达情况。体外细胞实验:人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)分为常规培养细胞组(N组)、空载体组(Vector组)、PAK4过表达组(PAK4组)。各组加入150 μg/ml糖基化终末产物诱导细胞。细胞划痕实验检测各组hRMEC内细胞迁移情况;流式细胞仪检测各组白细胞粘附于hRMEC数量。Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定细胞内线粒体基础呼吸、三磷酸腺苷(ATP)生成、最大呼吸与备用呼吸能力。两组间比较采用t检验;三组间比较采用单因素方差分析。结果体内动物实验:与正常对照组小鼠比较, 糖尿病组小鼠视网膜中PAK4 mRNA、蛋白相对表达量显著升高, 差异均有统计学意义(t=25.372、22.41...     

干扰素基因刺激蛋白抑制剂改善视网膜血管内皮细胞白细胞粘附及糖酵解水平

目的观察氧化应激条件下干扰素基因刺激蛋白(STING)抑制剂对人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)的影响。方法实验研究。体内动物实验:将雄性健康C57BL/6J小鼠48只随机分为野生型小鼠组(WT组)、糖尿病(DM)组, 每组各24只。DM组小鼠经链脲佐菌素诱导建立DM模型。建模成功后, DM组再分为DM+二甲基亚砜(DMSO)组、DM+C176组, 每组各12只小鼠。DM+DMSO组小鼠按50 mg/kg的剂量腹腔注射DMSO;DM+C176组小鼠按50 mg/kg的剂量腹腔注射STING抑制剂C176共750 nmol。建模后4周, 采用免疫组织化学染色、蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测WT组、DM组小鼠视网膜STING表达情况;白细胞粘附实验检测WT组、DM+DMSO组、DM+C176组小鼠体内白细胞粘附于hRMEC数量。体外细胞实验:将hRMEC随机分为常规培养细胞组(N组)、DMSO组(加入DMSO干预)、C176组(加入C176干预)。各组加入150 μg/ml糖基化终末产物诱导细胞, 体外白细胞粘附实验联合4’’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测白细胞粘附于...     

二甲双胍抑制糖尿病视网膜血管内皮细胞中核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3炎症小体活化和细胞焦亡

目的观察二甲双胍(Met)对糖尿病(DM)微环境下人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)中核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体及细胞焦亡的影响。方法实验研究, 分为体内动物实验和体外细胞实验进行。体内动物实验:健康C57BL/6J雄性小鼠9只, 随机分为DM组、正常对照组、DM+Met处理组(DM+Met组), 每组各3只小鼠。DM组、DM+Met组小鼠经链脲佐菌素诱导建立DM模型;DM+Met组给予Met 400 mg/(kg·d)干预。建模后8周, 免疫组织化学染色观察正常对照组、DM组、DM+Met组小鼠视网膜NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D(GSDMD)、cleaved-半胱天冬酶1(Caspase-1)的表达。体外细胞实验:hRMEC分为常规培养细胞组(N组)、晚期糖基化终末产物(AGE)组、AGE+Met组。AGE组、AGE+Met组加入150 μg/ml AGE诱导细胞, AGE+Met组另加入2.0 mmol/L Met处理细胞。流式细胞仪检测各组细胞焦亡情况;2’’, 7’’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测各组细胞中活性氧(R...     

mTOR-siRNA转染人晶状体上皮细胞对PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白p70S6K及4EBP1表达的影响

目的　研究mTOR-siRNA转染人晶状体上皮细胞系B3(human lens epithelial line B3,HLEB3)后,对PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白p70S6K及4EBP1表达的影响,并与雷帕霉素的作用作对比。方法　HLEB3分为mTOR-siRNA组（培养基加入Lipo2000和mTOR-siRNA）、control-siRNA组（培养基加入Lipo2000和control-siRNA）、Lipo2000组（培养基加入Lipo2000）、雷帕霉素组（培养基加入雷帕霉素）和空白对照组,于转染24 h、48 h、72 h后观察各组细胞的形态和密度;Western blot法检测各时间点各组细胞p70S6K及4EBP1蛋白的表达情况。结果　mTOR-siRNA组随着转染时间延长,HLEB3细胞分布稀疏、形态不规则,部分细胞贴壁不良。转染24 h、48 h、72 h时,mTOR-siRNA组细胞密度均较其他四组低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。转染24 h后,各组细胞4EBP1蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）,但与空白对照组相比,mTOR-siRNA组及雷帕霉素组p70S6K蛋白表达均下降（均为P<0.05）;转染48 h、72 h后,与空白对照组相比,mTOR-siRNA组及雷帕霉素组4EBP1及P70S6K蛋白表达均下降（均为P<0.05）,而control-siRNA组、Lipo2000组4EBP1、P70S6K蛋白表达与空白对照组相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　mTOR-siRNA及雷帕霉素均可影响HLEB3的增殖及生长活性,并抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白p70S6K和4EBP1的表达,且mTOR-siRNA的早期作用较雷帕霉素强。     

骨形态发生蛋白-6对转化生长因子-β2所致视网膜色素上皮细胞迁移的影响

目的　探讨骨形态发生蛋白-6（BMP-6）对转化生长因子-β2(TGF-β2)所致视网膜色素上皮（RPE）细胞迁移的影响。方法　RPE细胞常规培养后,用5 μg·L^-1 TGF-β2处理48 h,Western blot检测细胞中BMP-6蛋白水平的变化,Transwell法检测细胞迁移能力变化。随后,筛选BMP-6 siRNA抑制率最高的片段用于后续实验,构建BMP-6过表达质粒并进行鉴定后用于后续实验,RPE细胞随机分组,即（1）对照组:加入正常培养基培养48 h;（2）TGF-β2组:培养基中加入5 μg·L^-1 TGF-β2培养48 h;（3）BMP-6 siRNA组:转染BMP-6-homo-1087后培养48 h;（4）BMP-6过表达组:转染BMP-6过表达质粒后培养48 h;(5)TGF-β2+BMP-6过表达组:转染BMP-6过表达质粒24 h后,加入5 μg·L^-1TGF-β2继续培养48 h。Transwell法检测细胞迁移数的变化,倒置显微镜观察细胞形态的变化。结果　TGF-β2组迁移细胞数为（122.00±5.57）个,与对照组［（63.67±4.04）个］相比差异有统计学意义（P=0.000）。TGF-β2组BMP-6蛋白表达水平为0.41±0.13,与对照组（0.70±0.08）相比差异具有统计学意义（P=0.031）。BMP-6 siRNA组迁移细胞数为（115.67±1.53）个,与对照组［（57.00±7.00）个］相比差异具有统计学意义（P=0.000）。BMP-6过表达组迁移细胞数为(44.33±5.51)个,与对照组［（60.00±6.25）个］相比差异无统计学意义（P=0.076）。TGF-β2 +BMP-6过表达组迁移细胞数为(90.33±3.51)个,与TGF-β2组［(112.00±9.64)个］相比差异具有统计学意义（P=0.016）。结论　BMP-6可以阻止TGF-β2所致的RPE细胞的迁移,为增生性玻璃体视网膜病变的防治提供新的视角。     

H2O2对体外培养视网膜色素上皮细胞中BMP-6及其相关受体的影响

目的　观察氧化应激对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的损伤作用以及对骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-6及其相关受体的影响。方法　RPE细胞随机分为对照组:正常培养的RPE细胞；H₂O₂组:加入200 μmol·L^-1 H₂O₂处理的RPE细胞；实验组:加入200 μmol·L^-1 H₂O₂和0.1 ng·L^-1 BMP-6的RPE细胞。采用活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒运用流式细胞仪检测对照组与H₂O₂组RPE细胞内ROS的变化，运用PCR及Western blot法检查对照组与H₂O₂组BMP-6基因及蛋白水平的变化；TUNEL染色法观察三组细胞凋亡的变化，并运用PCR及Western blot法观察三组BMP受体及其共受体尤文素(Hemojuvelin，HJV）的变化。结果　H₂O₂组ROS水平（99.25±0.28）%较对照组（70.55±7.71）%明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；H₂O₂组相对于对照组BMP-6 mRNA水平及BMP-6蛋白水平均降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；H₂O₂组的TUNEL染色阳性细胞数显著高于对照组（P<0.05），而实验组TUNEL染色阳性细胞数明显减少，与H₂O₂组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，H₂O₂组BMP三种相关受体的BMPR1A、BMPR1B及HJV的表达水平显著降低，而实验组三种受体表达水平较H₂O₂组显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05)。结论　H₂O₂导致RPE细胞ROS增加，氧化应激可在基因及蛋白水平抑制BMP-6的表达；BMP-6可减轻氧化应激引起的细胞凋亡，且可能是通过激活其相关受体起作用的，这为探索年龄相关性黄斑变性的发病机制提供了一定的理论基础。     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

辛伐他汀抑制缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞HIF-1α和VEGF的表达水平

目的:探讨缺氧条件下辛伐他汀(Sim)对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE-19)细胞的影响及其可能机制.方法:将体外培养的人RPE-19细胞随机分为三组:对照组、缺氧组(培养基中CoCl2的最终浓度为125μmol/L)和Sim处理组(在含有125μmol/L CoCl2的RPE-19细胞培养基中加入3μmol/L ...     

高糖诱导的视网膜新生血管形成中NLRP3炎症小体与自噬的关系研究

目的　探讨在高糖诱导的视网膜新生血管形成过程中,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体与自噬之间的关系。方法　根据不同干预方式将人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells,HRMEC）随机分为三组:高糖组、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）＋高糖组、CY-09+高糖组。高糖组在M199培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理48 h;3-MA+高糖组和CY-09+高糖组分别先用5 mmol·L^-1的3-MA和10 mmol·L^-1的CY-09处理2 h,然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理48 h。分别采用MTT、Transwell及Matrigel法检测细胞活力、细胞迁移和管腔形成情况,比较三组细胞活力、细胞迁移数和管腔形成数;采用Western blot法检测三组细胞NLRP3炎症小体信号通路的关键蛋白NLRP3、凋亡相关颗粒样蛋白（ASC）、Caspase-1及自噬标志性蛋白LC3-II、LC3-I、Beclin-1的表达并对比;采用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染细胞观察自噬流的情况。结果　高糖组、3-MA+高糖组、CY-09+高糖组HRMEC细胞活力分别为（153.56±1.46）%、（115.33±3.26）%和（116.10±1.66）%,细胞迁移数分别为（117.33±7.23）个、（70.00±2.00）个和（71.67±2.52）个,细胞管腔形成数分别为（88.33±2.08）个、（61.33±1.53）个和（62.00±3.00）个。与高糖组相比,3-MA+高糖组及CY-09+高糖组HRMEC的细胞活力、细胞迁移数和管腔形成数均明显减少（均为P<0.001）,而3-MA+高糖组与CY-09+高糖组间差异均无统计学意义（均为P>0.05)。与高糖组相比,3-MA+高糖组及CY-09+高糖组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1、Beclin-1的蛋白相对表达量和LC3-II/LC3-I比值均明显降低（均为P<0.05）,细胞内自噬流明显减弱。结论　抑制NLRP3炎症小体与自噬均可有效抑制高糖诱导的视网膜新生血管形成,且二者在其中可能发挥相互正向调控的作用。     

15羟二十四碳四烯酸对缺氧视网膜微血管内皮细胞增生的抑制作用及其机制

背景 缺氧导致的视网膜新生血管性疾病已成为主要的致盲疾病,目前临床上缺乏有效的化学治疗方法,因此,研究其发病的分子机制从而指导临床用药十分关键. 目的 探讨15羟二十四碳四烯酸（15-HETE）对缺氧条件下培养的视网膜微血管内皮细胞（RMVECs）增生、凋亡的影响及其作用通路. 方法 分离C57BL/6J小鼠的RMVECs并用细胞除杂法进行培养,用间接免疫组织化学及免疫荧光检测法鉴定培养的细胞对内皮细胞的特征性标志物Ⅷ因子相关抗原的反应.将生长良好的细胞分为常氧组和缺氧组,后者以终浓度为125 μmol/L的CoCl2处理细胞建立缺氧模型.各组细胞换无血清含内皮细胞生长添加剂（ECGS）和高糖的DMEM培养基继续培养48 h,再按照培养基中加入15-HETE浓度的不同（终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0μmol/L）分别将常氧组和缺氧组细胞亚分为4个组.各组细胞分别用15-HETE处理48 h,然后用MTT法检测各组细胞的增生值（吸光度,A值）,并计算15-HETE的抑制率;分别采用逆转录PCR（RT-RCR）法及Western blot法检测各组RMVECs中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、bcl-2和caspase-3 mRNA及其蛋白的相对表达量. 结果 间接免疫组织化学法检测结果显示,培养的细胞对Ⅷ因子相关抗原呈阳性表达,细胞阳性率为（94.38±4.25）％.常氧培养条件下不同浓度15-HETE培养组RMVECs增生值（A值）的差异无统计学意义（F=0.283,P=0.837）,但缺氧培养条件下不同浓度15-HETE培养组RMVECs增生值的差异有统计学意义（F=702.582,P＜0.001）,其中缺氧＋1.0 μmol/L 15-HETE处理组、缺氧＋5.0 μmol/L 15-HETE处理组RMVECs增生值明显低于单纯缺氧培养组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.0.1、1.0、5.0μmol/L 15-HETE处理组对RMVECs的抑制率分别为（1.09±0.31）％、（21.09±3.53）％和（49.86±4.15）％,随着15-HETE浓度的增加,抑制率逐渐升高.常氧条件下各组bcl-2、c     

HXO-RB44细胞上清液对ARPE-19细胞内VEGF表达的影响

目的探讨HXO-RB44细胞上清液对人视网膜色素上皮（RPE）细胞系ARPE-19细胞内血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响及其相关机制。方法分别利用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基及MEM培养基对HXO-RB44细胞及ARPE-19细胞进行培养,在ARPE-19细胞内加入100μL HXO-RB44细胞上清液,分别干预0、4、8、12、24 h,利用RT-PCR、免疫荧光细胞化学、Western blot等方法,检测不同浓度的MLT干预后24 h ARPE-19细胞内VEGF mRNA及蛋白的表达情况。结果HXO-RB44细胞上清液加入后的不同时间点,VEGF mRNA的表达差异有统计学意义（F=195.072,P=0.000）。随着HXO-RB44细胞上清液作用时间的延长,ARPE-19细胞内VEGF mRNA表达逐渐增高（P〈0.01）。HXO-RB44细胞上清液加入后4、8、12、24 h,ARPE-19细胞内VEGF蛋白表达显著增加（F=160.687,P=0.000）,其表达与ARPE-19细胞内VEGF mRNA表达方式相同（P〈0.05）。随着HXO-RB44细胞上清液作用时间的延长,ARPE-19细胞内绿荧光蛋白强度逐渐增加。结论HXO-RB44细胞上清液能促进ARPE-19细胞内VEGF的表达。     

槲皮素对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导损伤的视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

目的　探讨槲皮素对N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）诱导的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）损伤的保护作用及其机制。方法　将小鼠RGC随机分为对照组,NMDA组,NMDA+1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1槲皮素处理组,槲皮素处理组,NMDA+槲皮素+茴香霉素（anisomycin,ANISO）处理组,NMDA+槲皮素+P79350处理组。NMDA组细胞加入100 μmol·L^-1的NMDA作用24 h,NMDA+1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1槲皮素处理组则在NMDA作用前分别加入相应浓度槲皮素预处理2 h,槲皮素处理组只加入10 μmol·L^-1槲皮素处理,NMDA+槲皮素+ANISO处理组和NMDA+槲皮素+P79350处理组在NMDA和槲皮素处理后分别加入25 μg·L^-1的ANISO和50 μmol·L^-1的P79350处理。随后利用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）试剂盒检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清液中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和一氧化氮（nitric oxide,NO）水平,RT-PCR检测细胞中神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）mRNA表达,Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和p-JNK蛋白表达水平,Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3活性。结果　与对照组比较,NMDA组细胞活性、SOD、Bcl-2 mRNA表达水平降低,LDH,ROS,MDA,NO,iNOS mRNA、nNOS mRNA、Bax mRNA和蛋白表达水平,Caspase-3活性,p-JNK蛋白表达水平,p-p38 MAPK蛋白表达水平,细胞凋亡率均升高（均为P<0.05）。相比于NMDA组,NMDA+槲皮素处理组则提高细胞活性和SOD水平,上调Bcl-2 mRNA和蛋白表达,降低LDH、ROS、MDA和NO,下调iNOS mRNA、nNOS mRNA、Bax mRNA和蛋白,p-JNK蛋白以及p-p38 MAPK蛋白表达,并降低Caspase-3活性和细胞凋亡率（均为P<0.05）。ANISO和P79350抵消槲皮素的作用。结论　槲皮素通过JNK/p38 MAPK信号通路防止NMDA诱导的RGC损伤。     

姜黄素对高浓度葡萄糖培养的RF/6A细胞活力的影响

目的:探讨姜黄素对高浓度葡萄糖培养的猴脉络膜-视网膜内皮细胞（rhesus choroidoretinal endothelial cell,RF/6A）活力的影响及其机制。方法:RF/6A分4组培养（n=6）:对照组;高浓度葡萄糖组（培养基添加30mmol/L葡萄糖）;姜黄素组（培养基添加30μmol/L姜黄素）;姜黄素-葡萄糖组（培养基添加30mmol/L葡萄糖及30μmol/L姜黄素）。以噻唑蓝比色法（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）检测培养1,3,5d后各组细胞活力的变化;试剂盒检测分组5d后各组细胞丙二醛（malonaldehyde,MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性;Western-blot检测分组5d后各组增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）及抑癌基因p27蛋白（protein 27,p27）表达。结果:与对照组相比,高浓度葡萄糖组RF/6A活性明显降低,MDA含量增加,SOD活力降低,PCNA表达下调,p27表达上调（P＜0.01）;而姜黄素组及姜黄素-葡萄糖组RF/6A活力、MDA含量、SOD活力、PCNA与p27的表达均无明显变化（P＞0.05）。结论:姜黄素维持高浓度葡萄糖培养的RF/6A活力,可能与姜黄素抑制高浓度葡萄糖诱发的氧化应激,恢复RF/6A的PCNA及p27蛋白表达有关。     

短发夹RNA对人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

目的探讨针对人血管内皮生长因子（VEGF）的短发夹RNA（shRNA）在体外对视网膜色素上皮（RUE）细胞VEGF表达的影响。方法用酶辅助显微分离法分离人RPE细胞,并用细胞角蛋白和S-100进行免疫组化鉴定。设计针对人VEGF的短发夹RNA（shRNAs,P1,P2）,P3为阴性对照即不含特异性shRNA,P1、P2退火后双链DNA连接到质粒pSilencer 4．1-CMV的BamHⅠ和Hjnd Ⅲ双酶切位点。转化细菌后,提取的质粒用EcoRⅠ和SamⅠ进行酶切鉴定。实验分5组,第1组：RPE细胞中在含有100μmol／LCoCl2,10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养30h;第2组：在常规含有10％FBS的DMEM培养基中培养30h;第3、4、5组：分别P1、P2、P3转染细胞24h后在含有100μmoL／LCoCl2的10％FBS的DMEM培养基中培养30h;用免疫印迹法检测各组细胞VEGF表达水平。结果培养的细胞用细胞角蛋白和S-100免疫组化染色阳性。提取的质粒经酶切后片断相对分子质量分别为3300和1600,说明质粒成功地提取和纯化。VEGF表达水平1组明显高于2、3、4组（均P〈0．001）。乏氧（2组与1组比）可以明显增加RPE细胞中VEGF的表达。3、4组（P1和P2）对VEGF表达抑制分别为65．9％和52．4％。5组与1组比差异无统计学意义（P=0．147）。各组间β肌动蛋白表达量差异无统计学意义。结论针对人VEGF的特异性shRNA可以明显降低人RPE细胞VEGF的表达,为RNA干扰治疗新生血管性眼病,尤其是脉络膜新生血管奠定了基础。     

南珠水解液对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨南珠水解液对过氧化氢（H₂O₂）诱导的人晶状体上皮细胞（HLEC）氧化应激损伤的保护作用。方法　培养HLEC细胞株HLEB3,在培养液中加入不同浓度南珠水解液,培养24 h和48 h分别检测细胞增殖水平,并据此选择后续实验中南珠水解液浓度。培养HLE-B3细胞,分成3组:正常对照组;氧化损伤组,加入H₂O₂至终浓度为300 μmol·L^-1;南珠水解液处理组,加入H₂O₂至终浓度为300 μmol·L^-1,加入南珠水解液至终浓度为200 mg·L^-1。3组细胞使用流式细胞术检测细胞凋亡率,利用电镜观察细胞形态差异;利用生化检测试剂盒检测3组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物岐化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量。结果　3组细胞增殖法检测结果显示,南珠水解液处理HLE-B3细胞24 h后,对其活性无抑制作用;50 mg·L^-1、100 mg·L^-1、200 mg·L^-1南珠水解液处理后细胞存活率分别为（128.68±12.35）%、（158.43±11.71）%和（164.16±24.46）%,48 h后能显著提高其增殖水平,与正常对照组［（100.00±9.78）%］比较,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组细胞凋亡率为（4.527±0.321）%;氧化损伤组为（11.460±0.633）%;南珠水解液处理组细胞凋亡率降至（8.877±0.193）%,与氧化损伤组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。电镜下观察结果显示,H₂O₂氧化损伤可以诱导HLE-B3细胞形态改变,损伤程度最高;南珠水解液处理后,细胞形态轻微改变。氧化损伤组细胞内GSH-Px、SOD含量均降低,MDA含量升高,与正常对照组相比差异均具有统计学意义（均为P<0.05);南珠水解液处理组GSH-Px、SOD含量均升高,MDA含量下降,与氧化损伤组相比差异均具有统计学意义（均为P<0.05)。结论　南珠水解液能够促进HLEC生长,抑制细胞凋亡,能够提升HLEC中GSH-Px、SOD活性,降低MDA含量,对H₂O₂诱导的HLEC氧化损伤具有保护作用。     

青蒿素对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激损伤的抑制作用

目的　探讨青蒿素对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化应激损伤的抑制作用。方法　将ARPE-19细胞接种于96孔板，每孔7×10³个细胞，细胞贴壁后分别加入不同浓度青蒿素，筛选对细胞增殖有效的最佳药物浓度。将APRE-19细胞分成4组。对照组:不做特殊处理；过氧化氢组:加入100 μmol·L^-1过氧化氢作用细胞24 h；青蒿素组:加入青蒿素30 μmol·L^-1，作用细胞24 h；青蒿素预保护组:加入30 μmol·L^-1青蒿素预保护细胞24 h后加入100 μmol·L^-1 过氧化氢作用24 h。利用MTT法筛选青蒿素对ARPE-19细胞作用的最佳药物浓度；通过Hoechst33342染色及线粒体膜电位观测细胞凋亡情况；检测细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量和活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）阳性细胞数；Western blot法检测相关蛋白表达水平。结果　MTT法检测发现，30 μmol·L^-1的青蒿素对细胞增殖作用最强 （均为P<0.01）。青蒿素预保护组与过氧化氢组相比，细胞增殖率升高，凋亡细胞数显著减少，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。线粒体膜电位染色显示，青蒿素预保护组与过氧化氢组相比绿色染色减少，红色染色增多，说明青蒿素预保护组凋亡细胞数减少。与对照组相比，青蒿素组ARPE-19细胞中SOD含量显著增加（P<0.05）；与过氧化氢组相比，青蒿素预保护组细胞内SOD含量明显增高（P<0.05），说明青蒿素能增加细胞内抗氧化物质，减少细胞凋亡。与对照组相比，青蒿素组ROS阳性细胞减少（P<0.05）；与过氧化氢组相比，青蒿素预保护组ROS阳性细胞亦明显减少（P<0.05），说明青蒿素可减少过氧化氢诱导的活性氧物质积聚。通过Western blot检测发现，青蒿素能促进ARPE-19细胞内AKT的磷酸化，过氧化氢组ARPE-19细胞内Caspase-3、PARP、 Keap1相对表达升高，Bcl-2、Nrf2、HO-1降低；青蒿素预保护组ARPE-19细胞内Caspase-3、PARP、 Keap1相对表达降低，Bcl-2、Nrf2、HO-1升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　青蒿素通过调节Nrf2/keap1信号通路来减小过氧化氢诱导的ARPE-19细胞的氧化应激损伤。     

茶多酚对高糖条件下大鼠晶状体上皮细胞线粒体活性氧的影响

目的:探讨茶多酚对高糖条件下大鼠晶状体上皮细胞线粒体活性氧的影响。方法:体外培养大鼠晶状体上皮细胞,加入不同浓度的葡萄糖,加入不同浓度茶多酚进行干预,共聚焦显微镜检测各条件下大鼠晶状体上皮细胞线粒体活性氧量的变化,分析高糖及茶多酚干预对细胞线粒体活性氧表达的影响。结果:培养基中葡萄糖两种浓度(L1和L2组),大鼠晶状体上皮细胞(L)MTR、DCF荧光强度/μm2细胞面积L1组L2组比较,P<0.05。在30mmol/L葡萄糖浓度培养基中加入0.1μmol/L和0.3μmol/L浓度的茶多酚,大鼠晶状体上皮细胞死亡率CDR(%)及线粒体膜电位MMP(FI)L3组与L4组比较,P>0.05。L2组L3组及L2组与L4组比较P<0.05。结论:高糖条件下培养的大鼠晶状体上皮细胞线粒体活性氧产生增多,而应用茶多酚干预后细胞线粒体活性氧产生减少,细胞死亡率降低。