转化生长因子β3重组腺病毒载体转染退变髓核细胞后的增殖活性

背景：通过基因干扰促进某些基因的表达,调控细胞生物学活性刺激有利于椎间盘组织再生的基质合成来达到治疗目的。 目的：构建含有转化生长因子β3的腺病毒表达载体,观察其对退变髓核细胞增殖的影响。 方法：制作椎间盘突变模型,从而获取原代退变椎间盘髓核细胞,提取总RNA,调取转化生长因子β3cDNA克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,采用pAdEasy系统进行细菌内同源重组得到含目的基因的腺病毒载体,脂质体转染293A细胞进行包装并扩增病毒。 结果与结论：成功构建有较强感染能力的含转化生长因子β3基因重组腺病毒表达载体,滴度达1010 pfu/L,MTT法检测表明Ad-TGF-β3可改善退变髓核细胞生物学特性,为研究转化生长因子β3的作用机制及将其用于椎间盘退变的基因治疗提供实验和理论依据。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。 目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。 方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达。 结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×10¹¹ pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

人雌激素β受体RNAi反转录病毒载体在人成骨样MG63细胞中的表达

背景：目前已有较多关于雌激素α受体基因如何参与骨代谢的研究,而对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究则相对较少。 目的：构建人雌激素β受体RNAi反转录病毒表达载体,并通过病毒介导其在人成骨样MG63细胞中表达。 方法：根据GeneBank数据库提供的雌激素β受体基因核苷酸序列,选择设计3条针对人雌激素β受体干扰靶序列,并与pRNAT-H1.4/ Retro质粒定向连接,构建真核表达载体pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。将pRNAT-H1.4/Retro-雌激素β受体-shRNA经脂质体转染至293细胞包装成反转录病毒。将包装好的反转录病毒,以空白及非特异性shRNA作为对照,感染人成骨样MG63细胞株。 结果与结论：3个连接了雌激素β受体-shRNA的重组质粒经酶切鉴定分析证实目的序列己插入到预计位点,符合设计要求,测序鉴定表明重组质粒中含有针对雌激素β受体基因目的序列,表明重组质粒构建成功。并经脂质体转染至293细胞后成功包装成反转录病毒。反转录病毒载体能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞株,感染效率为70%左右。包装后的3种雌激素β受体-shRNA反转录病毒均能高效、稳定的感染人成骨样MG63细胞,并显著抑制雌激素β受体的表达。其中以雌激素β受体-shRNA3为最佳的干扰序列。     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。 目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA和蛋白进行检测。 结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR和Western blot结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

Effect of recombinant adeno-associated virus transforming growth factor-beta 1 on the infection activity of bone marrow mesenchymal stem cells

背景：目前常用基因载体具有一定缺陷性,无法直接在体内应用。应用腺相关病毒作为转化生长因子β1载体促进软骨修复的研究报道较少。 目的：构建重组转化生长因子β1腺相关病毒,测定病毒滴度,并测定重组病毒对骨髓基质干细胞的感染活性。 方法：PCR方法扩增转化生长因子β1基因,构建重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞包装重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白。应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度并鉴定。并感染体外培养的兔骨髓基质干细胞,检测重组病毒感染骨髓基质干细胞的效率及活性。 结果与结论：转化生长因子β1扩增产物测序结果正确,重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白双酶切后可见位于1.3 Kb附近转化生长因子β1条带。收获病毒滴度5.2×1011 v.g/mL。鉴定重组病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白包装成功。重组病毒感染骨髓基质干细胞后可于荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白的表达,感染效率达42%。结果证实,成功构建重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,能够高效感染兔骨髓基质干细胞。     

血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。 目的：构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。 方法：将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn Ⅰ/Xba Ⅰ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV- VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。 结果与结论：酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。     

人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测*

背景：前期试验显示单个病毒载体介导的多基因共表达系统能够显著提高椎间盘退变转基因疗效。 目的：构建人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒。 方法：应用全基因合成技术,以“自剪切多肽2A”串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒Lenti-TGF-β3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因mRNA和蛋白质表达水平。 结果与结论：RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了3种目的基因,并于转染后48 h左右达到峰值,“2A”结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%。说明成功构建了携带人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因的慢病毒多表达质粒。     

绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建与鉴定携带绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因的重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP。方法将hVEGF165基因进行扩增,并同源重组入表达质粒pAV-MCMV-HA-P2A-GFP,转化入DH5a感受态细胞,得到的转化子经菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定和测序鉴定后,通过Ad Max腺病毒包装系统转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。包装后镜下观察HEK293细胞,测定腺病毒滴度,Western blot检测重组腺病毒的表达。结果成功构建了重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,重组腺病毒转染的HEK293细胞出现了明显的细胞病变效应;获得重组腺病毒的滴度为1.106×10~8 IFU/mL;Western blot检测重组腺病毒表达在23 000左右。结论成功获得重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,为进一步研究基因治疗脓毒症/感染性休克奠定了实验基础。     

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系

背景：版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。 目的：观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。 方法：利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。 结果与结论：建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达10³拷贝/µL,线性范围达10³~10⁹拷贝/µL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。     

重组hFGF-10腺病毒促进角质形成细胞增殖

目的： 构建重组人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）腺病毒，并观察其对角质形成细胞增殖的影响，为探索新的皮肤组织工程种子细胞的来源奠定基础。方法: 用PCR方法扩增得到人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）基因片段，与穿梭载体pAdTrack-CMV连接，获得的重组质粒pAdTrack-CMV-hFGF-10经Pme I线性化后，通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-hFGF-10，经酶切鉴定后转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中包装并扩增腺病毒。用重组腺病毒感染HaCat细胞，Western blotting检测培养上清中的重组hFGF-10。MTT法检测重组腺病毒对角质形成细胞增殖的影响。结果: 成功构建了含hFGF-10基因的重组腺病毒，可高效感染HaCat细胞，培养上清与hFGF-10抗体呈阳性反应。重组腺病毒对角质形成细胞的增殖具有促进作用。结论: 制备出的重组腺病毒感染HaCat细胞后分泌表达hFGF-10，并可促进HaCat细胞的增殖。     

人微小RNA-133a(miR-133a)重组腺病毒的构建和鉴定

目的: 构建人miR-133a重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)中的表达。方法: 从人基因组DNA中扩增包含miR-133a的PCR产物，并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经pmeⅠ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒rAd-mir-133a。将rAd-mir-133a在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-133a的重组腺病毒。将重组腺病毒感染hMSCs，利用RT-PCR和实时定量PCR分别检测初级miR-133a和成熟miR-133a的表达。结果: 限制性内切酶分析和DNA测序结果显示，重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-133a构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-133a。rAd-miR-133a感染的hMSCs中初级miR-133a转录子和成熟miR-133a表达显著增强。结论: 成功构建了人miR-133a 重组腺病毒，并在hMSCs中高效表达出miR-133a，为进行miR-133a的功能研究创造条件。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒的构建与鉴定

BACKGROUND:Bone morphogenetic protein 2 plays a key role in inducing osteogenesis. It involves in a series of bioprocess, including cell proliferation, determining the differentiation direction of germ line and cell death.  OBJECTIVE: To construct and identify the recombinant adenovirus vectors encoding human bone morphogenetic protein 2 gene by using AdMax system. METHODS:First, human bone morphogenetic protein 2 gene sequencing was amplified by PCR from human cDNA template and then cloned. Second, the recombinant shuttle plasmid was constructed and transformed into Escherichia coli competent cells DH5α. After the positive colonies were identified by colonies PCR and sequencing, the expression vectors were amplified and extracted. Next, the adenovirus expression vectors with target gene and the helper packaging plasmid carrying a majority of adenovirus genes were co-transfeced into 293 cells for virus packaging and amplification. Finally, target genes were detected by PCR, and target protein was detected by Western blot method, as well as infectious titer of the recombinant adenovirus was detected by end point dilution method. RESULTS AND CONCLUSION:Gene fragment of a length of 1 223 bp human bone morphogenetic protein 2 was obtained by PCR. The expression vectors constructed by homologous recombination techniques were identified by PCR cloning and sequencing; the results were correct. After virus packaging and amplification in 293 cells were identified by Western blot and PCR methods, the virus titer of recombinant adenovirus was 5×1013 pfu/L. These results suggest that the recombinant adenovirus vectors carrying human bone morphogenetic protein 2 gene have been constructed successfully.     

携带HSP70-HBsAg嵌合基因复制缺陷型重组腺病毒的制备

目的 构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白70(HSPT0)嵌合基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.方法扩增结核分枝杆菌HSP70基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBsAg上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠埃希菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBsAg-HSP70嵌合基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装.体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达.结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBsAg-HSP70.重组质粒pAd-HBsAg-HSP70导入293细胞,经包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBsAg-HSP70,其病毒滴度达2×1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论成功构建表达HBsAg-HSP70复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.     

可调控性鼠TGF-β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的:构建和表达可调控性鼠TGF-β1重组腺病毒载体。方法:采用常规分子生物学方法, 从刀豆A刺激的小鼠脾细胞抽提总RNA, 克隆鼠TGF-β1基因;经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接, 鉴定后在HEK293细胞包装。获得高滴度病毒后, 取上清采用ELISA方法鉴定目的基因的表达。结果:TGF-β1重组腺病毒经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定, 与预期结果一致;病毒感染细胞的上清液经ELISA检测, TGF-β1的表达量为(91.16±3.70)ng/L。结论:构建的可调控性鼠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达, 为进一步的研究和应用奠定了基础。     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

HBsAg腺病毒疫苗载体的构建及293细胞中的包装表达

目的：HBsAg与腺病毒骨架载体质粒构建，在293细胞中包装表达重组腺病毒颗粒，建立HBsAg腺病霉疫苗。方法：以pEcob-6为模板，PCR扩增目的基因HBsAg，腺病毒穿梭载体PAd-track-cmv与HBsAg重组为PAd-track-cmv-HBs穿梭质粒；腺病毒骨架载体质粒PAd-Easy-1再与PAd-track-emv-HBs同源重组为PAd-Easy-1-HBs质粒；用脂质体介导的转染法将PAd-Easy-1-HBs转染到293细胞，包装成重组腺病毒颗粒。酶联免疫吸附法测定细胞上清中HBsAg的表达，建立HBsAg腺病毒疫苗。结果：PAd-Easy-1-HBs转染到293细胞中，合成荧光蛋白，荧光显微镜下细胞发绿色荧光。再次感染293细胞，90％以上的细胞脱落。细胞上清液中也测定出有HBsAg的表达。结论：HBsAg腺病毒疫苗载体构建成功，并能在293细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒，为免疫动物实验提供条件。     

pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。