基于水凝胶的内皮细胞三维培养

目的研究可注射温度敏感性水凝胶的生物相容性,探讨其做为三维培养材料的可行性。方法将人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞接种于水凝胶,体外共同培养后进行形态结构观察,用MTT法检测ECV304细胞增殖活性,AO／EB试剂盒观察细胞凋亡,NO试剂盒测量细胞分泌NO等功能。结果ECV304细胞在水凝胶中生长及功能均比较理想。AO／EB双重染色有少量黄色荧光,显示仅有少量细胞凋亡。细胞在水凝胶中培养后上清液体中分泌的NO浓度与二维培养组之间差异显著性无统计学意义（P=0．948）。结论可注射温度敏感性水凝胶生物相容性好,是一种良好的三维培养材料,可作为种子细胞的载体应用于组织工程中。     

人脐静脉内皮细胞与表面改性的PHBHHx膜的体外相容性

目的 评价人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在含有不同组分中药涂层、碱处理前后的3-羟基丁酸和3-羟基已酸共聚酯（PHBHHx）膜上的生长状况,为研究PHBHHx膜与内皮细胞的生物相容性提供实验依据。 方法 用Baudine改良法分离培养人脐静脉内皮细胞,并用免疫组织化学方法鉴定;将已传至第3代人脐静脉内皮细胞接种于材料表面,培养8、12、24h,用扫描电镜观察人脐静脉内皮细胞在不同表面上黏附形态的变化,同时用细胞免疫荧光标记法比较其在不同膜上的分布情况,最后用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞的活力。 结果 成功分离出人脐静脉内皮细胞,Ⅷ 因子及血管内皮细胞受体Ⅱ(FLK-1)染色阳性;人脐静脉内皮细胞培养结果表明,细胞在各组材料表面均呈良好生长,并大量增殖。MTT分析结果显示,碱处理的PHBHHx膜及添加5%、10%中药涂层的材料对人脐静脉内皮细胞的体外生长、增殖有促进作用;扫描电镜和荧光显微镜下可见,碱处理的PHBHHx膜及添加5%、10%中药涂层的材料表面的人脐静脉内皮细胞活力旺盛、形态饱满、分布均匀。 结论 经表面改性处理的、且加入5%、10%中药涂层的PHBHHx膜,具有良好的人脐静脉内皮细胞相容性,在体外细胞培养的环境下,有利于细胞的生长、贴附和增殖。     

α-硫辛酸对氧化低密度脂蛋白致内皮细胞损伤的保护作用

目的:探讨α-硫辛酸(LA)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致内皮细胞损伤的保护作用。方法:内皮细胞ECV304随机分为:空白对照组(ECV304)、LA对照组(ECV304+LA)、ox-LDL组(ECV304+ox-LDL)、LA处理组(ECV304+ox-LDL+LA),以0.1g/L浓度的ox-LDL刺激细胞,并加入0.5g/L的LA,孵育24h后,收集培养液,测定乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量。结果:LA处理组较ox-LDL组LDH和MDA含量明显降低,两者差异有显著性(P<0.05)。结论:LA对ox-LDL导致的内皮细胞损伤有保护作用。     

槲皮素对氧化高密度脂蛋白致内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究槲皮素(Que)对含氧化高密度脂蛋白(oxHDL)血浆致人内皮细胞株(ECV304)损伤的保护作用。方法:常规培养ECV304细胞被分成5组:对照组(ECV304+HDL)、oxHDL组(ECV304+ox-HDL)、Que大剂量处理组(ECV304+oxHDL+80μmol/LQue)、Que中剂量处理组(ECV304+oxHDL+60μmol/LQue)及Que小剂量处理组(ECV304+oxHDL+40μmol/LQue),培养24h后平行检测各组ECV304形态、细胞内脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量、细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果:中、大剂量组ECV304形态较oxHDL组有明显改善,更接近于对照组;与oxHDL组相比,中、大剂量Que处理组ECV304培养液中LDH活性及MDA含量明显降低(P<0.01),而小剂量Que处理组结果无显著差异(P>0.05)。结论:Que对oxHDL致ECV304损伤有保护作用。     

人体内皮细胞系细胞株ECV304细胞低氧模型的制备

目的 研究人体内皮细胞系细胞株(ECV304)细胞低氧模型的建立条件及其形态学特点.方法 培养ECV304细胞,将培养箱内通入5%CO:-95%N2混合气体(氧分压为18.3 mmHg)并培养ECV304细胞12h、24h,使用MTT法、酸脱氢酶试剂盒(LDH)活力测定及细胞骨架染色对低氧细胞模型鉴定.结果 与正常对照...     

壳聚糖-镁膜与PCI2细胞在体外的生物相容性

目的 研究壳聚糖镁膜与PC12细胞体外生物相容性,初步探讨壳聚糖/镁复合物作为组织工程材料的可行性.方法 合成壳聚糖-镁膜,应用扫描电镜观察复合膜的表面形态,并用X线能谱仪分析壳聚糖-镁复合膜中镁的含量;在体外将复合膜与PC12细胞共培养,用MTT方法 检测细胞活力.光镜及扫描电镜观察PC12细胞在材料上的形态学变化.结果单纯壳聚糖(CS)与壳聚糖镁膜(CM)组相比,前者表面较为光滑致密,而复合膜中可见均匀排列的小孔;络合物中镁元素的含量与投入的硫酸镁量呈一定的剂量依赖.形态学观察表明,PC12细胞在CM上生长良好,至7 d时,可见微绒毛丰富并有较长突起,部分细胞之间形成突触状结构;MTT检测结果表明,培养5 d后实验组细胞活力超过对照组(P<0.05).结论 壳聚糖/镁膜与PC12细胞在体外有良好的生物相容性.     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用,探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8,以Greiss法测定NO,RT-PCR检测组织因子(TF)mRNA,Westernblot检测TF蛋白表达。结果显示,α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α,但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TF mRNA,而α-MSH抑制这种上调作用,并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α-MSH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

壳聚糖-镁膜与PC12细胞在体外的生物相容性

目的 研究壳聚糖镁膜与PC12细胞体外生物相容性，初步探讨壳聚糖/镁复合物作为组织工程材料的可行性。方法 合成壳聚糖-镁膜，应用扫描电镜观察复合膜的表面形态，并用X线能谱仪分析壳聚糖-镁复合膜中镁的含量；在体外将复合膜与PC12细胞共培养，用MTT方法检测细胞活力。光镜及扫描电镜观察PC12细胞在材料上的形态学变化。结果 单纯壳聚糖(CS)与壳聚糖镁膜(CM)组相比，前者表面较为光滑致密，而复合膜中可见均匀排列的小孔；络合物中镁元素的含量与投入的硫酸镁量呈一定的剂量依赖。形态学观察表明，PC12细胞在CM上生长良好，至7d时，可见微绒毛丰富并有较长突起，部分细胞之间形成突触状结构；MTT检测结果表明，培养5d后实验组细胞活力超过对照组（p<0.05）。结论 壳聚糖/镁膜与PC12细胞在体外有良好的生物相容性。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞与U937细胞黏附作用的影响

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞黏附作用的影响,以探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。以U937细胞与ECV304细胞相互黏附作为实验模型,观察LPS或TNF-α刺激ECV304细胞,以及α-MSH干预后,对U937细胞黏附于ECV304细胞的影响。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞,以FACS检测ICAM-1,RT-PCR检测骨桥蛋白(OPN)mRNA,Westernblot检测OPN蛋白表达。结果显示,LPS或TNF-α处理ECV304细胞可增加ECV304细胞与U937细胞的黏附,而α-MSH降低这种黏附作用。α-MSH抑制ECV304细胞表达ICAM-1和OPN蛋白;LPS或TNF-α刺激后,ECV304细胞表达OPN mRNA上调,而α-MSH能抑制LPS或TNF-α的上调作用。这些结果提示,α-MSH可通过降低ICAM-1和OPN的表达抑制炎症时血管内皮细胞与白细胞的黏附。     

胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学观察

目的 探讨胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学特征。方法 利用电镜技术观察血管内皮细胞Ecv304和C6胶质瘤细胞共培养(混合共培养、Transwell共培养、Transwell膜两面共培养)后的内皮细胞的孔窗、内皮细胞之间的连接及内皮细胞与肿瘤细胞的相互关系、瘤细胞的“血管周足”等的形态学特征；并与4例人脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障进行比较。结果 电镜下发现ECV304细胞经与C6细胞按3种不同方式共培养汇合后均为无孔窗型内皮细胞，细胞间出现紧密连接；Transwell共培养的膜上C6细胞未见伸出伪足突向膜的微孔；经膜两面共培养的瘤细胞则可通过Transwell的微孔突向内皮细胞侧，但瘤细胞未伸出伪足包绕内皮细胞或突入内皮细胞间隙，瘤细胞的“血管周足”不完整，后两者与脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障的形态特征相类似。结论 在体外经Transwell膜两面共培养的ECV304和C6胶质瘤细胞的系统可在一定程度模拟体内的血瘤屏障的形态学特征。     

Physical properties and biocompatibility of cellulose/soy protein isolate membranes coagulated from acetic aqueous solution

A series of cellulose/soy protein isolate (SPI) membranes was prepared from cellulose and SPI solution by casting and coagulation from 5 wt% acetic acid and 5 wt% sulphuric acid aqueous solution, respectively. The structure and properties of the membranes were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction, scanning electron microscopy and tensile testing. The effects of SPI content (W(SPI)) and the coagulants on the structure and properties of the membranes were investigated. The membranes exhibited porous structure. The pore size in the surfaces and cross-sections of the membranes increased with an increase of W(SPI) regardless of the coagulants. The membranes containing 10 wt% W(SPI) showed higher tensile strength and elongation at break than other membranes. The membranes with the same W(SPI) coagulated from acetic acid solution exhibited higher values of tensile strength, elongation at break and pore size in the surfaces and cross-sections than those corresponding membranes coagulated from sulphuric acid. The biocompatibility of the acetic acid-coagulated membranes was preliminarily evaluated by cell culture and in vivo implantation experiments. The results revealed that human umbilical vein endothelial cells (ECV304) grew well on this biomaterial. In comparison with the pure cellulose membrane, because of the incorporation of SPI and the resultant alteration of microstructure, the SPI-modified membranes showed an improved in vivo biocompatibility and biodegradability in the implantation experiments. These cellulose/SPI membranes warrant further explorations in biomedical fields.     

Physical properties and biocompatibility of cellulose/soy protein isolate membranes coagulated from acetic aqueous solution

A series of cellulose/soy protein isolate (SPI) membranes was prepared from cellulose and SPI solution by casting and coagulation from 5 wt% acetic acid and 5 wt% sulphuric acid aqueous solution, respectively. The structure and properties of the membranes were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction, scanning electron microscopy and tensile testing. The effects of SPI content (W _SPI) and the coagulants on the structure and properties of the membranes were investigated. The membranes exhibited porous structure. The pore size in the surfaces and cross-sections of the membranes increased with an increase of W _SPI regardless of the coagulants. The membranes containing 10 wt% W _SPI showed higher tensile strength and elongation at break than other membranes. The membranes with the same W _SPI coagulated from acetic acid solution exhibited higher values of tensile strength, elongation at break and pore size in the surfaces and cross-sections than those corresponding membranes coagulated from sulphuric acid. The biocompatibility of the acetic acid-coagulated membranes was preliminarily evaluated by cell culture and in vivo implantation experiments. The results revealed that human umbilical vein endothelial cells (ECV304) grew well on this biomaterial. In comparison with the pure cellulose membrane, because of the incorporation of SPI and the resultant alteration of microstructure, the SPI-modified membranes showed an improved in vivo biocompatibility and biodegradability in the implantation experiments. These cellulose/SPI membranes warrant further explorations in biomedical fields.     

当归对高糖所致内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究高糖培养液对体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304的影响及当归注射液对高糖培养环境中内皮细胞功能的保护作用。方法:在RPMI1640培养液中培养内皮细胞后,分成对照组、高糖培养组、高糖+当归组、当归组,培养48h后观察各组内皮细胞形态、检测培养液中一氧化氮(NO)浓度和ECV304细胞增殖活性。结果:高糖培养ECV304细胞有肿胀现象,且数量减少;当归干预后,ECV304细胞形态与对照组相似,且数量增多。高糖培养的ECV304细胞增殖活性和NO浓度较高糖+当归组显著减少(P<0.05),而当归组与对照组无统计学差异(P>0.05)。结论:当归注射液可以预防高糖培养对内皮细胞增殖及分泌NO功能的损害,从而对糖尿病患者的血管损害可能起到一定的保护作用。     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304整合素β1内化中的作用

目的:探讨ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304内化整合素β1中的作用和机制。方法:构建pAAV-ICAP1α及其突变体pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体,转染ECV304。ECV304分为ICAP1α组、T38A组、I138A组、绿色荧光蛋白(GFP)组和未转染组,用NHS-SS-Biotin标记整合素β1,并利用生物素-亲和素系统以及Westernblot检测整合素β1内化情况。结果:各组细胞转染的质粒均稳定表达;Westernblot检测ICAP1α组、T38A组、I138A组、GFP组、未转染组内化的整合素β1相对光密度值分别为1.07±0.04、0.68±0.06、0.70±0.02、0.87±0.06、0.88±0.04;与GFP组和未转染组比较,ICAP1α组整合素β1内化明显增多(P<0.05);与GFP组、未转染组和ICAP1α组比较,T38A组和I138A组整合素β1内化明显减少(P<0.05),GFP组与未转染组无差别(P>0.05)。结论:转染ICAP1α后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化增加,而转染T38A和I138A后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化减少;ICAP1α可能通过第38位的苏氨酸残基(38Tyr)和第138位的异亮氨酸残基(138Ile)调控整合素β1的内化。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响

目的研究柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB3)感染ECV304细胞后,血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesionmolecule,VCAM-1)的表达变化及海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响。方法采用MTT法检测不同浓度的海洋放线菌素X2作用病毒后的抑制情况;采用RT-PCR和FCM分别测定CVB3感染的ECV304细胞在海洋放线菌素X2作用前后不同时间点的VCAM-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3的SI为63.88。正常状态下ECV304细胞基本无VCAM-1 mRNA表达,CVB3感染ECV304细胞促进VCAM-1 mRNA表达,感染12 h达到最高峰,6～54 h时VCAM-1 mRNA水平,与细胞对照组相比CVB3感染组差异有统计学意义(P<0.05)。CVB3感染ECV304细胞后,VCAM-1蛋白表达在12～48 h显著高于正常ECV304细胞对照组(P<0.05)。海洋放线菌素X2干预后,于12～54 h降低ECV304细胞VCAM-1 mRNA的水平,12～24 h降低VCAM-1蛋白的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3具有抗病毒作用,并可下调CVB3诱导的ECV304细胞VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表达。     

血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响

目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响。方法①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量。结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24h、48h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、5.64%)(P<0.05)。②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8h、24h、48h释放PDGF的量(1593、2625、2175ng/L)明显高于正常孕妇组(235、405、133.5ng/L)差异显著(P<0.01)。③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24h、48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3266、2360ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05)。结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放。