Role of CXCR7 in angiogenesis involving SDF-1-mediated endothelial cells

[目的]探讨CXCR7在SDF-1诱导内皮细胞参与血管生成中的作用.[方法]用Western blot和流式细胞仪检测脐静脉内皮细胞(humanUmbilical vein endothelial cells,HUVECs)中CXCR7和CXCR4的表达;利用小分子拮抗剂分别阻断CXCR4或CXCR7,然后通过MMTT、Transwell小室法及三维基质胶血管样结构形成实验分别考察CXCR7和CXCR4对SDF-1诱导HUVECs增殖、迁移及管样结构形成能力的影响.[结果]HUVECs细胞中同时高表达CXCR4和CXCR7;CXCR7的拮抗剂显著抑制SDF-1诱导HUVECs的增殖(P＜0.01);而SDF-1诱导HUVECs迁移却被CXCR4的拮抗剂阻止(P＜0.01);CXCR7和CXCR4的拮抗剂均显著阻止SDF-1诱导HUVECs形成血管样结构(P＜0.01).[结论]CXCR7和CXCR4在SDF-1诱导HUVECs参与血管生成的过程中均起着不可或缺却又不尽一致的作用,SDF-1诱导HUVECs的增殖主要通过CXCR7发挥作用,而CXCR4主要参与SDF-1诱导HUVECs的迁移,两者共同参与SDF-1诱导HUVECs形成管样结构的调节.     

SDF-1对内皮祖细胞增殖迁移的影响及AMD3100对其的干预

目的 探讨基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)对小鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖迁移的影响及AMD3100对其的干预效应.方法 分别用不同浓度的SDF-1α刺激EPCs,观察SDF-1α的促增殖效应再用不同浓度的AMD3100干预5 ng/ml SDF-1α的促增殖效应及单用AMD3100与EPCs孵育,观察AMD3100对EPCs增殖的影响.MTT比色法检测EPCs的增殖情况.用1、10 ng/ml SDF-1α诱导EPCs迁移,或先用10ng/ml AMD3100与EPCs孵育,再做SDF-1α诱导的/无SDF-1α诱导的迁移实验.用改良的Boyden小室测定EPCs迁移能力.结果 SDF-1α剂量依赖性增强EPCs增殖能力,10 ng/ml AMD3100即完全阻断5 ng/ml SDF-1α的促进EPCs增殖效应,单用AMD3100孵育可抑制EPCs增殖,与阴性对照组比较差异显著(P＜0.01);单用AMD3100孵育抑制EPCs迁移,与阴性对照组比较差异显著(P＜0.01).结论 SDF-1α可增强EPCs增殖迁移能力,AMD3100可完全阻断其促增殖和诱导迁移效应,单用AMD3100抑制EPCs增殖迁移.     

CXCR7在SDF-1介导内皮细胞参与血管形成中的作用

目的探讨CXCR7在SDF-1诱导内皮细胞参与血管生成中的作用。方法用Western blot和流式细胞仪检测脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中CXCR7和CXCR4的表达;利用小分子拮抗剂分别阻断CXCR4或CXCR7,然后通过MTT、Transwell小室法及三维基质胶血管样结构形成实验分别考察CXCR7和CXCR4对SDF-1诱导HUVECs增殖、迁移及管样结构形成能力的影响。结果 HUVECs细胞中同时高表达CXCR4和CXCR7;CXCR7的拮抗剂显著抑制SDF-1诱导HUVECs的增殖(P<0.01);而SDF-1诱导HUVECs迁移却被CXCR4的拮抗剂阻止(P<0.01);CXCR7和CXCR4的拮抗剂均显著阻止SDF-1诱导HUVECs形成血管样结构(P<0.01)。结论 CXCR7和CXCR4在SDF-1诱导HUVECs参与血管生成的过程中均起着不可或缺却又不尽一致的作用,SDF-1诱导HUVECs的增殖主要通过CXCR7发挥作用,而CXCR4主要参与SDF-1诱导HUVECs的迁移,两者共同参与SDF-1诱导HUVECs形成管样结构的调节。     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。     

CXCR7表达增强促进内皮祖细胞血管生成能力

目的：考察提高CXCR7表达能否提高内皮祖细胞（EPCs）血管生成能力。方法：利用高表达CXCR7的腺病毒转染至人脐带血来源的EPCs,建立CXCR7high-EPCs工程化细胞。比较CXCR7high-EPCs与对照组EPCs在无血清条件下存活、黏附、经基质细胞衍生因子-1（SDF-1）诱导的跨内皮迁移、管样结构形成以及一氧化氮（NO）生成能力。结果：高表达CXCR7能显著增强EPCs在无血清条件下细胞存活能力、黏附功能、SDF-1诱导的跨内皮迁移、管样结构形成以及EPCs生成NO的能力,并且与SDF-1有协同作用。结论：提高CXCR7在人脐带血来源的EPCs中表达能够增强其血管生成能力,这为临床治疗血管性疾病提供新思路。     

血管内皮生长因子通过缝隙连接蛋白43调节内皮祖细胞增殖迁移

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial groth factor,VEGF)是否通过缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)调控内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖迁移.方法 分离培养原代大鼠脾源性EPCs,不同浓度VEPF(0、10、50 ng/mL)刺激细胞,Western blot检测Cx43的表达.实验分3组:对照组、VEGF组、VEGF+siCx43组.荧光漂白恢复实验(fluorescence redistribution afterphotobleaching,FRAP)分别检测3 min内各组选定细胞荧光强度变化情况.CCK-8检测干扰Cx43蛋白表达对EPCs增殖的影响;Transwell小室迁移实验检测干扰Cx43蛋白表达对EPCs迁移的影响.结果 (1) VEGF促进EPCs中Cx43的表达(P＜0.05),且有浓度依赖性.(2)与对照组相比,VEGF组缝隙连接功能明显增强(P＜0.05);与VEGF组相比,VEGF+siCx43组缝隙连接功能明显降低(P＜0.05).(3)与对照组相比,VEGF组促进EPCs增殖及迁移,差异有统计学意义(P＜0.05);与VEGF组相比,VEGF+ siCx43组EPCs增殖及迁移活性明显降低(P＜0.05).结论 VEGF可以通过上调EPCs中Cx43的表达,引起缝隙连接功能增强,从而促进内皮祖细胞的增殖及迁移.     

恩格列净通过调控AMPK/eNOS信号通路改善ox-LDL诱导的内皮祖细胞功能障碍

目的 研究恩格列净(EMP)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮祖细胞(EPCs)损伤的保护作用及机制。方法 通过密度梯度离心法提取、分离并培养小鼠骨髓来源的的EPCs。采用Dil标记乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)联合FITC标记荆豆凝集素-1（FITC-UEA-1）双摄取法鉴定。将EPCs分为正常对照组,ox-LDL组以及ox-LDL联合不同浓度恩格列净实验组。CCK-8检测细胞活力,Transwell检测细胞迁移,FITC-Annexin V/PI检测细胞凋亡,ELISA检测细胞上清液中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)含量;流式细胞术检测一氧化氮(NO)的合成情况。Western blot检测AMPK、p-AMPK、eNOS、p-eNOS的蛋白表达。结果 提取的EPCs诱导培养至第7天经鉴定为小鼠骨髓EPCs。与对照组比较,ox-LDL组细胞活力降低,迁移细胞减少,凋亡增加,VEGF、SDF-1α含量降低,NO合成减少（P＜0.05）;与ox-LDL组相比,不同浓度恩格列净组细胞活力有所提高,迁移细胞增多,凋亡减少,VEGF、SDF-1α含量升高,NO合成增加（P＜0.05）。ox-LDL处理可明显抑制AMPK及eNOS磷酸化（P＜0.05）,恩格列净处理可以改善AMPK及eNOS磷酸化水平（P＜0.05）,而AMPK抑制剂Compound C可使恩格列净改善EPCs功能活性的作用受到明显的抑制（P＜0.05）。结论 恩格列净可改善ox-LDL诱导的EPCs功能障碍,其机制与调控AMPK/eNOS信号通路有关     

小鼠EPCs和RAW264.7细胞株体外联合培养体系的建立

目的 体外建立小鼠血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)和破骨细胞前体细胞RAW264.7细胞株共培养体系.方法 EPCs和RAW264.7细胞株共培养为实验组,加了等量细胞培养液但没有加入EPCs的细胞作为对照组.利用分离式培养小室进行细胞联合培养,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测细胞的增殖,通过检测光密度值绘制共培养过程中RAW264.7细胞生长曲线;逆转录PCR检测共培养1、3、5、7d后RAW264.7细胞VEGFR-2和CXCR4 mRNA的表达;TRAP染色检测破骨细胞活性.结果 和EPCs细胞联合培养能加快RAW264.7细胞的增殖速率,和RAW264.7单独生长比较,共培养3、5、7d后,2组的光密度值差异有显著性(P＜0.01);共培养促进RAW264.7细胞分化为破骨细胞.结论 在体外联合培养体系中,EPCs具有促进宿主破骨细胞前体细胞增殖与分化的作用.     

同型半胱氨酸对大鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的： 验证同型半胱氨酸（Hcy）是否具有促进大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）去分化的作用。 方法： SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定,取4～7代细胞用于实验。VSMCs分为对照组、100 μmol/L Hcy干预组、500 μmol/L Hcy干预组、1 000 μmol/L Hcy干预组共4组。MTT法测各组VSMCs的增殖情况;划痕法和Transwell法检测各组VSMCs的迁移情况;ICC法检测各组VSMCs的细胞形态;Western blot法检测各组VSMCs中SM-actin、SM-MHC、Calponin、骨桥蛋白（OPN）的表达情况。 结果： 相比于对照组,Hcy组VSMCs增殖迁移增加;细胞形态变圆;SM-MCH和Calponin表达减少（ P＜0.01〉;OPN表达增加（ P＜0.01）,Hcy的这一作用与浓度呈正相关。 结论：Hcy可以促进VSMCs去分化,这可能是其促进VSMCs增殖和迁移的机制之一。     

转录因子Ets差异基因5在血管平滑肌细胞表型转化中的作用

目的 探讨转录因子Ets差异基因5(ETV5)在血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用.方法 分别采用ETV5过表达腺病毒载体(Ad-ETV5组)和绿色荧光蛋白(GFP)过表达腺病毒载体(Ad-GFP组)转染VSMC.人ETV5特异性小干扰RNA[血小板源性生长因子(PDGF)-BB+ siRNAETV5组]及其随机阴性序列(PDGF-BB+siRNAdacfsdmbk组)分别转染VSMC后采用PDGF-BB诱导VSMC表型转化.分别采用实时定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测各组细胞中VSMC表型标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和肌球蛋白重链11 (MYH11) mRNA和蛋白的表达水平.分别采用平板划痕实验和CCK-8试剂盒检测各组VSMC的迁移和增殖活性.结果 与Ad-GFP组相比,Ad-ETV5组VSMC中α-SM和MYH11 mRNA和蛋白的表达均降低(P＜0.05),迁移和增殖活性均升高(P＜0.05).与PDGF-BB+ siRNAdscvmble组相比,PDGF-BB+ siRNAETv5组VSMC中α-SMA和MYH11 mRNA和蛋白的表达均升高(P＜0.05),而迁移和增殖活性降低(P＜0.05).结论 ETV5参与了VSMC的表型转化.     

过表达Periostin蛋白对内皮前体细胞功能影响的实验研究

目的构建Periostin蛋白过表达慢病毒载体, 并检测其对内皮前体细胞(EPCs)功能的影响。方法从小鼠骨髓中获取EPCs, 并进行鉴定。采用Oligos设计获得目的基因, 构建慢病毒载体LV5/Periostin。慢病毒感染EPCs, 荧光显微镜下观察被感染细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况, Western blotting检测Periostin蛋白表达情况。CCK-8法和流式细胞计数检测被感染细胞的增殖和凋亡情况, 划痕法和Transwell小室法检测被感染细胞迁移和侵袭能力的改变情况。结果被重组慢病毒感染的EPCs明显表达GFP; 过表达慢病毒组细胞增殖活性较阴性对照组低, 而凋亡细胞较阴性对照组多(P < 0.05);过表达慢病毒组细胞的迁移率较空白对照组细胞高, 侵袭细胞数目较多(P < 0.05)。结论可以从小鼠骨髓中成功分离和培养EPCs, 过表达Periostin蛋白会降低EPCs体外增殖的活性, 促进其凋亡; 但会增加EPCs的体外迁移和侵袭能力。     

LncRNA LOC100506123对胰腺癌细胞增殖及迁移的影响

目的 探讨长链非编码RNA (long non-coding RNA,LncRNA) LOC100506123对胰腺癌细胞增殖及迁移的影响.方法 采用实时定量PCR (qRT-PCR)技术检测胰腺癌组织及细胞系(AsPC-1、BxPC-3、Panc-1、CFPAC-1,以正常胰腺导管上皮细胞HPDE为对照)中LOC 100506123的表达情况.并通过siRNA技术下调LOC 100506123表达,构建siRNA经Lipofectamine 2000TM脂质体转染细胞(对照组为siR-NC,实验组为siR-1、siR-2),采用CCK-8、Transwell小室实验分别检测胰腺癌细胞增殖和转移能力.结果 ①LncRNA LOC100506123在胰腺癌组织及细胞系中表达显著升高(P＜0.05).②下调LOC 100506123表达,胰腺癌细胞的增殖及迁移能力显著降低(P＜0.05).结论 高表达的LncRNALOC100506123能促进胰腺癌细胞的增殖及迁移.     

基质细胞衍生因子-1通过促进C-kit表达提高小鼠心肌干细胞增殖和迁移能力的研究

目的：探讨基质细胞衍生因子-1（ SDF-1）提高小鼠心肌干细胞（ CSCs ）增殖和迁移能力的机制。方法：从小鼠心肌中分离、培养出CSCs ,并用免疫磁珠法筛选出c-kit （＋） CSCs ,用流式细胞仪检测CSCs表面标志：干细胞因子受体c-kit、干细胞抗原Sca-1。用SDF-1及SDF-1特异性拮抗剂AMD3100干预c-kit（＋） CSCs,qPCR及Western blotting检测c-kit的mRNA和蛋白表达,用CCK-8试剂盒及transwell趋化实验检测细胞增殖和迁移能力。结果：分离、培养出的细胞经免疫磁珠筛选后,流式细胞仪检测c-kit和Sca-1表达均大于80％。 SDF-1干预后, qPCR和Western blotting 结果显示c-kit mRNA 和蛋白表达均增高, CCK-8及transwell趋化实验结果显示SDF-1干预后细胞的增殖及迁移能力明显提高,并且可以被AMD3100拮抗。结论：SDF-1通过促进c-kit表达提高c-kit（＋） CSCs的增殖及迁移能力。     

N-cadherin对视网膜色素上皮细胞增殖及迁移侵袭的影响

【目的】为了明确神经钙黏蛋白（N-cadherin）在糖尿病视网膜病变上皮-间质转化中的作用,探讨N-cadherin对视网膜色素上皮细胞增殖、迁移及侵袭力的影响及作用机制。【方法】分别采用Ad-N-cadherin（Ad-N-cad）、Ad-si N-cadherin（si N-cad）及Ad-GFP、Ad-si Control（si Con）对照腺病毒处理细胞以过表达或沉默N-cadherin,采取葡萄糖（25mmol/L）处理视网膜色素上皮细胞以模拟高糖状态,使用CCK8试剂检测细胞增殖情况,Transwell小室检测细胞的垂直迁移能力及侵袭能力。【结果】Transwell迁移和侵袭实验结果表明,过表达N-cadherin使迁移至Transwell小室下室的细胞数增加,差异有统计学意义（P<0.05）;高糖处理使迁移和侵袭至小室下室的细胞数增加,而干扰N-cadherin的表达可抑制高糖诱导的迁移或侵袭（P<0.05）。CCK8结果显示,干扰N-cadherin可以抑制高糖引起的细胞增殖（P<0.05）。【结论】N-cadherin可促进细胞迁移,干扰N-cadherin可以抑制高糖诱导的细胞增殖、迁移和侵袭。     

回阳生肌膏抗小鼠骨髓内皮祖细胞功能损伤的研究

目的观察回阳生肌膏对过氧化氢(H₂O₂)诱导的小鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)功能损伤的影响。方法通过密度梯度离心法联合差速贴壁法提取、分离、培养小鼠骨髓EPCs,观察细胞形态及采用FITC标记的荆豆凝集素-1联合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)双摄取法鉴定EPCs。制备回阳生肌膏水提取物,采用细胞增殖/毒性试剂盒(CCK-8)筛选出最大无毒质量浓度(C)。针对回阳生肌膏水提取物进行化学成分定性分析。以0.12 mL/L H₂O₂刺激EPCs模拟糖尿病足溃疡氧化应激状态建立模型,将细胞密度调整至5×10⁸ L^-1,分别种于培养板,5孔为1组。将细胞分为空白对照组,模型组,回阳生肌膏高、中、低剂量组。空白对照组与模型组不予干预,各给药组分别予回阳生肌膏水提取物高剂量(C)、中剂量(C/2)、低剂量(C/4)。采用CCK-8法、Transwell实验、小管形成实验分别检测细胞的增殖、迁移、小管形成功能,酶联免疫吸附测定(ELISA)及硝酸还...     

基质细胞衍生因子1对人牙髓干细胞增殖、迁移和成牙本质能力的影响

目的：对比基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）和粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）对人牙髓干细胞（dental pulp stem cell, DPSC）的体外增殖、迁移和成牙本质能力的影响。方法：分别在培养基中加入100 μg/L SDF-1或100 μg/L G-CSF,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8)和集落形成实验（colony-forming unit,CFU）检测SDF-1和G-CSF对DPSC增殖的影响;采用划痕实验和Transwell迁移实验检测两者对DPSC迁移能力的影响;对DPSC进行成牙本质诱导,通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、测定ALP活性、茜素红染色和real-time RT-PCR检测成牙本质相关基因的表达,以检测两者对DPSC体外成牙本质能力的影响。结果：SDF-1和G-CSF能够轻度提高DPSC的增殖及集落形成能力,但差异无统计学意义。加入SDF-1或G-CSF的实验组划痕汇合速率明显高于对照组（P<0.01）,但两种因子间差异无统计学意义。Transwell迁移实验中,对照组每视野的迁移细胞数量为(5.0±1.4)个,SDF-1组每视野的迁移细胞数量为(24.3±6.8)个,G-CSF组每视野的迁移细胞数量为(11.8±3.3)个,各组间差异有统计学意义（P<0.05）。经成牙本质诱导后,实验组细胞ALP染色加深,ALP活性上升,矿化结节形成数量增加,成牙本质相关基因的表达均显著高于对照组。结论：SDF 1对DPSC的增殖能力影响不显著,但能明显提高DPSC的迁移能力和成牙本质分化能力,效果优于G-CSF。     

自杀基因修饰内皮祖细胞对肝细胞癌体外作用的效应

目的：研究自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染的小鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）联合酶前体药物5-氟胞嘧啶（5-FC）对小鼠肝癌细胞株H22的体外抗增殖作用。方法：分离普通小鼠骨髓源性EPCs,培养鉴定,Polybrene技术转染含CD基因的慢病毒载体重组体plenti6．3-EGFP-CD至EPCs,Western blotting检测目的蛋白的表达。利用Transwell小室共培养体系,用转染CD基因的EPCs处理H22细胞。 CCK-8法检测H22细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：成功转染CD基因至EPCs;CCK-8法检测显示随着5-FC浓度增加,细胞增殖逐渐下降,5-FC浓度达100 mg· L-1时,肿瘤细胞增殖抑制率达到（54．74±5．38）％（P＜0．05）,细胞平均凋亡率为（48．71±4．62）％（P＜0．05）。结论：CD基因修饰的EPCs 联合5-FC体外可明显抑制肝癌H22细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。