Foxg1抑制肝癌细胞血管形成及其机制

目的 通过干扰和过表达肝癌细胞中的Foxg1,探讨Foxg1对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)血管生成能力的影响及其机制.方法 实验分为Hep3B干扰组、Hep3B对照组、Huh7过表达组和Huh7对照组,提取各组细胞条件培养基(conditional medium,CM);通过Transwell实验、管腔形成实验观察各组CM对HUVEC的迁移及管腔形成的影响;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot检测血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)在各组肝癌细胞中的mRNA及蛋白水平,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组CM内VEGFA浓度;采用Western blot检测4组肝癌细胞AKT1、p-AKT1的蛋白水平.结果 Hep3B干扰组较Hep3B对照组CM的作用下,HUVEC细胞的迁移数显著增多(P＜0.01),Huh7过表达组较Huh7对照组CM的作用下,HUVEC细胞迁移数显著减少(P＜0.01);Hep3B干扰组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数多于Hep3B对照组CM(P＜0.01),而Huh7过表达组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数少于Huh7对照组CM(P＜0.01);Hep3B干扰组较Hep3B对照组VEGFA水平上调,Huh7过表达组较Huh7对照组VEGFA水平下调;Hep3B干扰组CM较Hep3B对照组CM的VEGFA水平上调,Huh7过表达组CM较Huh7对照组CM的VEGFA水平下调(P＜0.01);Hep3B干扰组较Hep3B对照组AKT1磷酸化水平升高,Huh7过表达组较Huh7对照组AKT1磷酸化水平降低.结论 Foxg1抑制肝癌血管生成的过程可能是通过抑制PI3K/Akt通路的激活下调VEGFA的表达来实现的.     

MiR-30c通过靶向KRAS抑制肝癌细胞系生长侵袭能力的体外研究

目的 探讨MiR-30c对肝癌细胞生长和侵袭的影响.方法 采用脂质体Lipofectamine 2000将MiR-30c模拟物组和MiR-30c模拟物组阴性对照转染至肝癌细胞Huh7,qRT-PCR检测转染效果,细胞免疫荧光、Western blot检测转染后目的蛋白的表达,Transwell、划痕实验检测细胞迁移侵袭能力、MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期分布的改变.结果 成功构建稳定过表达MiR-30c的肝癌细胞亚系Huh7-MiR30c,荧光定量PCR结果显示MiR-30c表达量明显上调,过表达MiR-30c后Huh7细胞的侵袭和增殖能力均受到明显抑制;抑制MiR-30c能明显抑制KRAS蛋白和减低p-ERK蛋白表达水平,对ERK蛋白水平无明显影响.结论 抑制MiR-30c表达可能通过调控RAS/MAPK/ERK通路抑制肝癌细胞Huh7增殖和侵袭.     

端粒酶逆转录酶线粒体转位促进肝癌细胞干性及耐药的研究

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,hTERT)线粒体转位对肝癌细胞干性及耐药的影响.方法 采用大剂量顺铂(CDDP)冲击、间歇诱导的方法诱导肝癌细胞HepG2、Huh7耐药,构建耐药细胞株HepG2/CDDP、Huh7/CDDP,CCK-8检测细胞耐药能力;Western blot检测细胞线粒体hTERT表达情况;激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位;流式细胞术检测耐药细胞干性相关蛋白CD133、EpCAM表达情况;克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Western blot检测耐药细胞干性相关因子OCT-4蛋白表达水平变化.结果 与亲本细胞HepG2[耐药指数(7.69±0.86)μg/mL及Huh7 (7.18±0.35) μg/mL]相比,耐药细胞株对CDDP耐药指数明显增加[HepG2 (41.16±0.42) μg/mL,Huh7 (33.48±0.33)μg/mL,P＜0.01],经顺铂(CDDP)诱导耐药细胞线粒体hTERT表达显著升高,线粒体膜电位增强,CD133+细胞比例[HepG2 (1.44±0.41),HepG2/CDDP (23.15±1.55),P＜0.01]及EpCAM+细胞比例[HepG2 (0.85 ±0.10),HepG2/CDDP (3.96 ±0.10),P＜0.01]增加,克隆形成能力增强,干性相关因子OCT4蛋白表达水平增加.结论 经顺铂诱导的肝癌耐药细胞线粒体hTERT转位显著增加,且具有明显的肿瘤干细胞特征.     

Expression of cancer stem cell-associated markers in liver cancer cell lines HepG2 and Hep3B

目的 富集培养肝癌干细胞,研究肝癌干细胞相关标志物CD90、CD133、八聚体4(Oct4)和ATP结合盒转运蛋白ABCG2在肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达,并初步分析其意义.方法 使用流式细胞仪从肝癌细胞(检测HepG2、Hep3B两种细胞系)中分选肝癌干细胞并行无血清成球培养.设肝癌细胞组为对照组.单细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力.分别给予肝癌细胞及肝癌下细胞阿霉素处理,MTT法测阿霉素处理后各组细胞的存活率,Real-time PCR及Western blot分别检测各组细胞CD90、CD133、Oct4和ABCG2 mRNA及蛋白水平的表达.结果 肝癌干细胞单个细胞增殖能力强于肝癌细胞,克隆形成分析显示培养第14天克隆形成率Hep3B细胞组低于Hep3B CSCs组[8/27(30％)vs 12/23(52％),P＜0.05 ];HepG2细胞组克隆形成率也低于HepG2CSCs组[7/38(18％)vs 9/26(35％),P＜0.05].用阿霉素处理肝癌细胞及肝癌干细胞48 h后,MTT法测定结果显示肝癌干细胞组细胞活性显著高于对照组(P ＜0.05):HepG2细胞组细胞活性为(38.17 ±6.92)％、HepG2CSCs组为(69.88±5.43)％;Hep3B细胞组(50.16±4.89)％,Hep3B CSCs组为(78.53±7.86)％.Real-time PCR结果显示肝癌干细胞组中CD90、CD133、Oct4及ABCG2基因mRNA表达较亲代细胞组显著上调(P＜0.05).Western blot结果显示肝癌干细胞组Oct4及ABCG2蛋白水平显著上调,与亲代细胞组间表达差异有显著性(P＜0.05).结论 肝癌干细胞相关标志CD90、CD133、Oct4及ABCG2均高表达于肝癌干细胞,并且Oct4及ABCG2基因的高表达有可能与肝癌干细胞耐药性相关.     

下调Tim-3对肝癌干细胞自我更新能力及 Wnt信号通路的影响

目的 探讨Tim-3对肝癌干细胞(liver cancer stem cells, LCSCs) 自我更新能力及Wnt信号通路的影响。方法培养人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721及正常干细胞系L02,流式细胞仪分选Nanog阳性(+)的肝癌干细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Tim-3在3个细胞系中的mRNA表达水平及在肝癌干细胞中的mRNA表达水平;HepG2肝癌干细胞转染Tim-3 siRNA,荧光显微镜和光学显微镜检测转染率,Western blot法检测转染后Tim-3蛋白水平;qRT-PCR检测转染前后Tim-3、Wnt3、β-catenin的mRNA表达水平;细胞克隆形成试验和细胞成球试验检测转染前后HepG2肝癌干细胞的自我更新能力的变化。结果 qRT-PCR检测Tim-3在肝癌细胞系HepG2、SMMC7721中的 mRNA表达显著高于正常肝细胞L02(P＜0.05);Tim-3在HepG2肝癌干细胞的表达明显高于肝癌细胞(P＜0.05);在SMMC7721肝癌干细胞与肝癌细胞比较Tim-3 mRNA表达有低趋势;经荧光镜和光学显微镜观察,Tim-3 siRNA转染细胞良好;Western blot法结果表明,Tim-3蛋白水平在siRNA-451组细胞中的表达显著低于siRNA-750、siRNA-NC、未转染细胞(P＜0.05);转染后HepG2干细胞Tim-3、Wnt3、β-catenin 的mRNA表达水平均显著下降;克隆形成实验和细胞球形成实验显示转染Tim-3 siRNA后,细胞的克隆形成能力和细胞球生长能力均显著降低(P＜0.05)。结论 下调Tim-3表达水平后,可通过抑制Wnt信号通路,最终减弱肝癌干细胞的自我更新能力。     

香叶醇对人肝癌细胞株Huh7增殖及TGF-b1/Smad 2信号通路影响研究

目的:探讨香叶醇对肝癌细胞株Huh7增殖及TGF-b1/Smad 2信号通路的影响.方法:不同浓度香叶醇干预体外培养肝癌细胞株Huh7不同时间.MTT检测香叶醇对Huh7细胞生长情况的影响,流式细胞术检测细胞周期的变化情况,RT-PCR和Western blot分别检测细胞内TGF-b1和Smad 2 mRNA和蛋白表达水平的变化情况.结果:MTT结果显示香叶醇显著抑制了肝癌细胞的生长.流式细胞结果表明香叶醇明显降低了肝癌细胞S期含量而增加了G0/G1期含量.而TGF-b1和其下游因子Smad2的mRNA和蛋白水平的表达也明显受到香叶醇的抑制,且这种抑制作用呈浓度一时间依赖性.结论:香叶醇可能够通过阻断TGF-b1/Smad 2信号通路抑制肝癌细胞生长.     

慢病毒介导的TSPY1对肝癌SMMC7721和Huh7细胞系增殖的影响

目的：观察转染睾丸特异性蛋白1（ TSPY1）慢病毒表达载体对肝癌细胞SMMC7721和Huh7细胞系增殖能力的影响。方法构建特异性的TSPY1慢病毒过表达载体稳定转染至SMMC7721和Huh7肝癌细胞系,采用荧光定量PCR和蛋白印迹技术检测TSPY1 mRNA和蛋白的表达情况,Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测转染后细胞的增殖情况。结果在转染过表达TSPY1慢病毒的SMMC7721和 Huh7细胞中, TSPY1 mRNA和蛋白的表达均明显上调（ P＜0.01）。 CCK-8细胞增殖实验发现,过表达TSPY1组SMMC7721和Huh7细胞的增殖能力比对照组增强。结论 TSPY1慢病毒表达载体可明显上调TSPY1 mRNA和蛋白表达,并能够促进肝癌SMMC7721和Huh7细胞的增殖。     

miR-148b-3p通过调节脂代谢基因对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨miR-148b-3p通过调节脂代谢基因对肝癌细胞增殖、转移及侵袭能力等恶性生物学行为的影响。方法 通过癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库寻找miR-148b-3p、肝癌及脂代谢三者的交集基因,筛选miR-148b-3p治疗肝癌的潜在靶点基因;采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-148b-3p在正常肝脏细胞LO2和肝癌细胞Huh7、Hep1中的表达水平,选取miR-148b-3p表达量最低的细胞Huh7作为研究对象;Huh7肝癌细胞分为对照组(转染miR-148b-3p NC)和实验组(转染miR-148b-3p mimics),CCK8实验和克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验、以及油红O染色分别检测两组肝癌细胞的增值、迁移、侵袭能力及脂滴形成情况,采用RT-PCR和Western blot检测交集基因及脂肪生成指标基因FASN、PPAR-γ及SCD1的mRNA和蛋白表达水平。结果 miR-148b-3p在Huh7细胞中mRNA相对表达量显著低于Hep1细胞(P<0.01)和LO2细胞(P<0.001);与对照组相比,实验组H...     

Establishment and biological characteristics of sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cell lines

[目的]建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,并研究其耐药细胞的生物学特性.[方法]通过药物敏感性实验CCK8法测定索拉菲尼的半数抑制浓度IC50值;采用体外间歇诱导法,使用PLC/PRF/5和Huh7各自IC50值作为筛选浓度,建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株模型;Real time-PCR检测5种耐药基因(GST-π、LRP、MDR1、MRP、TopoⅡ)在耐药组和对照组中的表达差异;Western blot检测MAPK信号通路中关键信号因子细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)ERK1/2在不同组别细胞中的磷酸化水平差异.[结果]所筛选的PLC/PRF/5和Huh7耐药组细胞与对照组细胞相比较,其细胞生存率有显著性提高(P＜0.05);5种耐药基因中MDR1的表达有显著性上调(P＜0.05);索拉菲尼作用靶点的下游信号因子ERK1/2的磷酸化水平上调.[结论]成功地在体外建立索拉菲尼诱导的PLC/PRF/5和Huh7耐药细胞株,其耐药机制可能与ERK1/2的磷酸化水平上调导致耐药基因MDR1高表达有关.     

PEP-1介导的重组肝细胞核因子4α蛋白转导对肝癌细胞的抑制作用

目的 利用细胞穿膜肽PEP-1介导重组肝细胞核因子4α（HNF4α）蛋白进入肝癌细胞,并明确外源融合蛋白P-HNF4α对肝癌细胞的作用。方法 构建表达质粒pET28a-P-HNF4α,优化原核表达体系的诱导条件,经大量表达、亲和层析纯化以及浓缩、透析后获得纯度较高的带有细胞穿膜肽PEP-1的融合蛋白P-HNF4α;P-HNF4α转导人肝癌细胞,Western blot检测其穿膜效率,核浆分离和细胞免疫荧光检测P-HNF4α的亚细胞定位,Real-time PCR检测肝癌细胞基因表达,CCK-8法检测肝癌细胞的增殖,细胞划痕实验以及小室侵袭实验检测P-HNF4α对肝癌细胞转移能力的影响。结果 细胞穿膜肽PEP-1成功介导融合蛋白P-HNF4α进入Huh7细胞并定位于细胞核;P-HNF4α蛋白可促进Huh7细胞肝功能基因的表达,抑制干细胞相关基因的表达,并显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论 P-HNF4α可诱导肝癌细胞向成熟肝细胞分化,降低肝癌细胞的恶性程度,提示利用P-HNF4α转导肝癌细胞是诱导分化治疗肝癌的潜在手段。     

依他尼酸联合顺铂化疗促肺癌A549细胞凋亡的作用及机制研究

目的 探讨依他尼酸(ethacrynic acid,EA)杀伤肺癌A549细胞球的作用及机制研究.方法 无血清培养基中培养A549细胞球,应用Western blot检测CD133、SOX2、EpCAM和ABCG2的蛋白表达水平.应用l、2、5、10、20 mg/mL的浓度顺铂(cisplatin,DDP)分别处理A549及细胞球48 h,用MTT检测48 h内细胞的存活率.应用比色法检测10、50、100、200 μmol/L EA对A549细胞球中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性的抑制作用.应用流式细胞术、Western blot、Real-time-PCR、相差显微镜观察检测200 μmol/L EA处理A549细胞球前后ROS水平、细胞成球能力、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白以及β-catenin启动子活性的变化情况.应用β-catenin腺病毒感染A549细胞球后,再用200 μmol/L EA的处理A549细胞球,利用Real-time PCR和Western blot检测β-catenin S、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的变化,并用MTT检测A549细胞球增殖的抑制作用.结果 成功培养出悬浮的A549细胞球,其高表达肿瘤干细胞标志物CD133、SOX2、EpCAM以及耐药相关蛋白ABCG2,并可耐受不同浓度DDP的杀伤作用.200 μmol/L EA处理A549细胞球后ROS水平明显升高,而GST活性、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的表达、β-catenin的启动子活性、A549细胞球的成球能力显著下降,并且200 μmol/L EA联合5 mg/mL DDP可增强对抑制A549细胞球增殖的作用和增加细胞凋亡的水平(P＜0.05).过表达β-catenin后,200 μmol/L EA对β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的抑制作用较空载体组显著减弱.此外,过表达β-catenin可显著缓解200 μmol/L EA联合5 mg/mLDDP对A549细胞球的增殖抑制作用.结论 EA通过抑制GST活性和β-catenin水平,发挥抑制A549细胞球增殖和干性,促进其凋亡的作用.EA可望成为治疗肺癌及肺癌干细胞的药物.     

苦参碱通过调控β-catenin信号通路抑制肝癌细胞干性

目的探讨苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖活性、细胞干性、β-catenin转录活性以及AKT/GSK3β/β-catenin信号 通路的影响。方法应用MTT法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验检测0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对 人肝癌HepG2 和Huh7 细胞的克隆形成能力,荧光定量PCR分析0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌 HepG2 和Huh7 细胞干性基因CD90、EpCAM（上皮细胞粘附分子）和CD133 mRNA的表达水平,双荧光素酶报告基因检测 0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌HepG2 和Huh7 细胞内β-catenin 转录活性,Western blotting 检测 0 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞内AKT（蛋白激酶B）、GSK-3β和β-catenin及其相应磷酸化 蛋白的表达水平。结果MTT实验结果显示,苦参碱呈时间-浓度依赖性地抑制肝癌HepG2 和Huh7 细胞的增殖,处理24、 48、72 h 对HepG2 细胞的半数抑制浓度依次为2369、1565、909.1 μg/mL,对Huh7 细胞的半数抑制浓度依次为1355、781.8、 612.8 μg/mL。苦参碱浓度依赖性地抑制肝癌细胞的克隆形成能力,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制HepG2细胞的 克隆形成能力（P<0.01,P<0.001）,200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞的克隆形成能力（P<0.05,P<0.01, P<0.001）。苦参碱能够显著肝癌细胞内CD90、EpCAM和CD133 等干细胞标志物mRNA的表达,其中400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱能够显著抑制HepG2细胞中CD90（P<0.01,P<0.001）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01,P<0.01）mRNA的表 达,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞中CD90（P<0.01,P<0.01）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01, P<0.01）mRNA的表达。同时400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱显著抑制HepG2细胞（P<0.001,P<0.001）和Huh7细胞（P<0.01,P<0.001） 内β-catenin的转录活性。研究结果显示400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著降低HepG2和Huh7细胞内β-catenin和磷酸化 的AKT和GSK-3β蛋白水平,增加β-catenin的磷酸化水平。结论苦参碱可抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖、克隆形成以及 肝癌干性基因CD90、EpCAM和CD133的表达,其机制可能与抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路,从而降低β-catenin的转录 活性有关。     

维拉帕米通过下调硫氧还蛋白互作蛋白的表达抑制丙型肝炎病毒感染

目的 探讨抗高血压药维拉帕米是否可通过下调宿主硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达而抑制丙型肝炎病毒(HCV)的感染.方法 用不同浓度梯度的维拉帕米处理人肝癌细胞系Huh7.5.1,用qPCR和蛋白质印迹法检测TXNIP的表达.用维拉帕米处理Huh7.5.1细胞,同时加入细胞培养产生的HCV (HCVcc),48 h后检测HCVcc感染情况.用TXNIP siRNA转染Huh7.5.1细胞,检测下调TXNIP表达后,维拉帕米对HCVcc感染的影响;用TXNIP启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因表达质粒(pTXNIP-EGFP)转染Huh7.5.1细胞,分析维拉帕米对TXNIP启动子转录活性的影响.结果 与对照孔相比,维拉帕米(100、200、400 μmol/L)可下调Huh7.5.1细胞中TXNIP的表达,并呈现浓度依赖性(P＜0.05);并可抑制HCVcc对Huh7.5.1细胞的感染,且浓度越高抑制作用越明显(P＜0.05).进一步研究结果显示,与对照组相比,维拉帕米能够抑制pTXNIP-EGFP转染细胞中EGFP的表达水平(P＜0.05).结论 维拉帕米可下调TXNIP的表达从而抑制HCV感染,这可能是通过抑制TXNIP启动子的转录活性来实现的.     

穿心莲内酯对人肾细胞癌786-0细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的：研究穿心莲内酯（Andro）对肾细胞癌（RCC）786-0细胞的增殖、迁移和克隆形成能力的抑制作用及诱导其程序性凋亡的作用,并探讨其相关作用机制。方法：取对数生长期786-0细胞,加入不同浓度（5、10、20、40和80 μmol·L^-1） Andro作为实验组,以0 μmol·L^-1 Andro组作为空白对照组,MTS法检测各组细胞增殖率。取对数生长期786-0细胞,加入不同浓度（0.50、1.25和2.50 μmol·L^-1） Andro作为实验组,以0 μmol·L^-1 Andro组作为空白对照组,采用克隆形成实验检测各组细胞克隆形成能力。取对数生长期786-0细胞,加入不同浓度（10、20和40 μmol·L^-1） Andro作为实验组,以0 μmol·L^-1 Andro组作为空白对照组,采用划痕实验检测各组细胞迁移能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较,10、20、40和80 μmol·L^-1 Andro组细胞增殖率明显降低（P<0.05或P<0.01）。与空白对照组比较,0.50和1.25 μmol·L^-1 Andro组细胞克隆形成率明显降低（P<0.05或P<0.01）。与空白对照组比较,10、20和40 μmol·L^-1 Andro组细胞划痕愈合率均明显降低（P<0.01）,20和40 μmol·L^-1 Andro组细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）。与空白对照组比较,40 μmol·L^-1 Andro组细胞中DNA损伤蛋白γ-H2AX表达水平明显升高（P<0.01）,Caspase-8表达水平明显降低（P<0.05）,Caspase-8剪切体表达水平明显升高（P<0.01）。结论：Andro能够有效地抑制RCC细胞的增殖、迁移和克隆形成能力,并诱导其凋亡,其诱导凋亡作用的机制与诱导DNA损伤及JNK/H2AX和Caspase-8介导的细胞程序性凋亡途径有关。     

LY294002通过PI3K/Akt/Mtor对CD133+CD44+结直肠癌干细胞自我更新、增殖能力的影响

目的:探讨LY294002对CD133+CD44+结直肠癌干细胞自我更新、增殖能力的影响及其机制.方法: 通过流式细胞术从人结直肠癌HCT116细胞中分选CD133+CD44+的肿瘤干细胞(CSCs),不同浓度(10、20、30 μmol/L)LY294002作用CSCs,对照组不使用药物.成球实验及有限浓度稀释法检测细胞自我更新能力,细胞活性计数法及平板克隆实验检测增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR及流式细胞术检测PI3K/Akt/mTOR信号通路基因Akt、磷酸化Akt、诱骗受体3(DcR3)、B淋巴细胞瘤-2(Bc--2)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达变化.结果: 与对照组相比,30 μmol/L LY294002作用实验组成球能力明显削弱(P＜0. 01),CSCs比例明显下降(P＜0. 05),增殖能力明显削弱(P＜0. 01),G0G1期细胞周期受到阻滞(P＜0. 01);磷酸化Akt表达降低(P＜0. 01),DcR3、Bcl-2、mTOR及Cyclin D1表达量下调(P＜0. 01).结论: LY294002可能通过PI3K/Akt/mTOR通路导致结直肠癌CSCs周期阻滞、抑制其自我更新、增殖能力.     

8-溴-7-甲氧基白杨素对Huh-7细胞系肝癌干细胞样细胞自我更新的影响

目的:研究8-溴-7-甲氧基白杨素(BrMC)抑制源自人肝细胞癌Huh-7细胞系细胞肿瘤球形成细胞即肝癌干细胞样细胞(LCSLCs)自我更新作用。方法:体外培养人肝癌Huh-7细胞系细胞,干细胞条件培养基悬浮培养法富集和扩增LCSLCs。MTT比色法测定细胞活性;肿瘤球形成法检测自我更新能力;FITC-CD133标记FCM分析CD133表达。结果:干细胞条件培养基悬浮培养6天,Huh-7细胞形成非粘附、三维生长的肝癌球体细胞即LCSLCs。与Huh-7细胞相比,BrMC抑制LCSLCs细胞活性作用更强(P<0.05),并以浓度依赖性方式减少肿瘤球数目(P<0.05),降低CD133蛋白表达(P<0.05)。结论:干细胞条件培养基悬浮培养能分离和富集LC-SLCs;BrMC具有抑制LCSLCs细胞自我更新能力作用,其作用机制与降低干细胞标记物CD133蛋白的表达相关。     

GSK-J4通过抑制STAT3磷酸化对HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的 探讨GSK-J4通过抑制组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域蛋白3(Jumonji domain-containing protein 3, Jmjd3) 并上调H3K27me3的表达影响HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的分子机制.方法 体外培养人正常肝细胞L02及人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 细胞株HepG2、 SMMC7721,RT-PCR检测Jmjd3 mRNA表达,Western blot检测Jmjd3、H3K27me3蛋白表达;CCK-8法检测不同浓度GSK-J4(0、10、30、50 μmol /mL) 处理HepG2后增殖能力;流式细胞仪检测凋亡率;Transwell检测细胞侵袭力;Western blot检测Jmjd3、H3K27me3和凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 相关标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin ) 、波形蛋白(Vimentin) 以及p-STAT3、STAT3蛋白表达.结果 与L02比,Jmjd3高表达,H3K27me3低表达于HepG2、SMMC7721肝癌细胞株(P＜0. 05);GSK-J4抑制HepG2增殖(P＜0. 05);GSK-J4处理组细胞凋亡率明显提高,细胞侵袭能力减弱(P＜0. 05);GSK-J4处理HepG2后Jmjd3水平降低,H3K27me3水平增高,Bcl2水平降低,Bax、Caspase3水平增高,E-cadherin表达增高,Vimentin水平降低(P＜0. 05);p-STAT3表达下调(P＜0. 01) .结论 GSK-J4通过抑制Jmjd3并上调H3K27me3表达而诱导HepG2发生凋亡并减弱侵袭,其可能与抑制EMT形成和STAT3的磷酸化有关.     

SIRT1激动剂通过降低ACAT1表达抑制平滑肌泡沫细胞形成

目的 探讨沉默信息调节因子1 (silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)泡沫化的作用和相关的分子机制.方法 用组织贴块法体外培养原代VSMC,用80μg/mL ox-LDL刺激VSMC诱导泡沫细胞形成.检测SIRT1在ox-LDL刺激不同时间(24、48、72 h)的表达变化.SIRT1的活性调控分别应用SIRT1激动剂(SRT1720,SRT,1μmol/L)和抑制剂(nicotinamide,Nic,100 μmoL/L)进行干预.干预24 h后采用Western blot检测VSMC过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(A-cholesterol acyhransferase 1,ACAT1)的蛋白表达,干预48 h后采用油红O染色检测细胞内脂质沉积和泡沫细胞形成情况.应用PPARγ激动剂(Rosiglitazone,RSG,50 μmol/L)和抑制剂(GW9662,10 μmol/L)调控PPARγ的表达,Western blot检测VSMC中ACAT1的表达.结果 ①ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中,SIRT1蛋白表达在48 h降低约47％ (P ＜0.01);油红O染色显示,SRT可以抑制VSMC泡沫细胞形成,而Nic可逆转SRT的抑制作用;②ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中ACAT1的表达显著增加[(2.77±0.70),P＜0.01],SIRT1激动剂SRT可显著抑制ACAT1的表达[(0.90±0.27),P＜0.01],而SIRT1抑制剂Nic可阻断这一作用,升高ACAT1的表达[(2.25±0.37),P＜0.05];③ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中PPARγ的表达减少[(0.73±0.12),P＜0.05],SIRT1激动剂SRT可上调VSMC中PPARγ的表达[(0.98±0.16),P＜0.05],SIRT1抑制剂Nic抑制PPARγ的表达[(0.47 ±0.13),P＜0.01];④PPARγγ激动剂RSG可抑制ACAT1的表达[(0.73±0.09),P＜0.01],而PPARγ抑制剂GW9662则上调ACAT1表达[(1.68±0.09),P＜0.01].结论 SIRT1通过上调VSMC中PPARγ表达而抑制ACAT1表达,从而抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫样变.     

吉非替尼通过促进H3K27甲基化水平抑制恶性周围神经鞘瘤细胞的增殖

目的:研究表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂吉非替尼（gefitinib）对恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞增殖、迁移的影响。方法:选择STS26T细胞、ST88-14细胞,分为对照组和给药组（10 μmol/L）,其中药物IC50实验、蛋白印迹实验给药组浓度分为5、10、15 μmol/L。CCK-8法检测吉非替尼对STS26T、ST88-14的半数抑制浓度并绘制药物IC50曲线;平板克隆形成实验检测吉非替尼对细胞增殖能力的影响;划痕实验检测吉非替尼对细胞迁移能力的影响;实时荧光定量PCR检测加药后各组细胞Kras、SUZ12、EED、EZH2 mRNA的表达情况;蛋白印迹实验检测加药后Kras、组蛋白H327位赖氨酸三甲基化蛋白（H3K27me3）的表达。结果:STS26T、ST88-14细胞的药物IC50曲线显示半数抑制浓度均为10 μmol/L（t=11.42、16.51,均P＜0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（10 μmol/L）STS26T、ST88-14细胞增殖能力显著降低（t=5.48,P＜0.05;t=4.89,P＜0.01）、细胞迁移能力显著降低（t=4.94,P＜0.01;t=4.75,P＜0.01）;与对照组比较,吉非替尼给药组（10 μmol/L）STS26T细胞中Kras mRNA表达显著降低（t=4.87,P<0.01）,SUZ12、EED、EZH2表达显著升高（t=11.36、15.54、13.19,均P＜0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（10 μmol/L）ST88-14细胞中Kras mRNA表达显著降低（t=13.75,P<0.05）,SUZ12、EED、EZH2表达水平显著升高（t=12.56、7.48,16.33,均P＜0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（5、10、15 μmol/L）STS26T、ST88-14细胞Kras蛋白表达显著降低（t=13.70、15.21,均P<0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（5、10、15 μmol/L）STS26T、ST88-14细胞H3K27me3蛋白表达显著增加（t=14.31、12.40,均P<0.05）。结论:EGFR抑制剂吉非替尼通过促进MPNST中PRC2的表达,提高表观遗传学标志物H3K27me3的表达,降低MPNST细胞株增殖、迁移的能力。