hand2基因对斑马鱼胚胎发育影响的实验研究

  目的 观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况,验证显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（Morpholino oligonucleotides,MO）使hand2 表达下调的有效性。观察hand2 表达下调后斑马鱼胚胎发育的异常表型,初步探讨hand2在斑马鱼胚胎发育中的作用,为利用斑马鱼开展hand2的功能研究提供线索。 方法 采用胚胎整体原位杂交的方法观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况。利用向斑马鱼受精卵显微注射MO的方法使hand2 表达下调,并进行hand2 表达下调的效率验证。将斑马鱼单细胞受精卵分为四组进行显微注射,即对照MO（Con MO）注射组、hand2 MO注射组、hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组。在荧光显微镜下观察hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组的荧光表达情况以验证hand2 表达下调的效率。在显微镜下观察hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的各器官发育情况并进行评定。 结果 hand2在斑马鱼胚胎的侧板中胚层、咽弓、心脏和鳍有较强表达。hand2-GFP mRNA注射组在8hpf（hours post fertilization）时胚胎有较强的荧光表达,而hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组胚胎几乎无荧光表达。与Con MO注射组相比,hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节有明显的发育异常。 结论 向斑马鱼受精卵显微注射hand2 MO的方法可有效的使 hand2表达下调。hand2 在斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节的发育过程中有重要作用。     

Connexin43基因表达下调导致斑马鱼胚胎后部体节发育异常

目的：验证斑马鱼胚胎体节的发育是否受到间隙连接蛋白connexin43（cx43）基因表达调控。方法：利用吗啉修饰的反义寡核苷酸（morpholino antisense oligos）下调cx43基因的表达;单克隆抗体CH1进行全胚胎的免疫荧光来标记体节;全胚胎的TUNEL实验检测细胞凋亡。结果：研究发现cx43基因表达下调的斑马鱼胚胎呈现为尾部向侧下弯曲,并且后部体节排列紊乱。进一步的研究证实cx43下调诱导了后部体节细胞的异常凋亡。结论：cx43与斑马鱼后部体节的正常发育有关。     

EphA2对结肠癌细胞株HCT116中VEGF和MMP9蛋白表达的影响

目的:探讨EphA2对结肠癌细胞株HCT116中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9, MMP9)蛋白表达的影响.方法:用Western 印迹验证选择高表达EphA2蛋白的结肠癌细胞株HCT116;脂质体转染法将EphA2反义寡核苷酸瞬时转染入HCT116细胞,Western 印迹检测反义寡核苷酸转染效率后, ELISA检测转染前后细胞上清液中VEGF蛋白的表达;明胶酶谱分析法检测转染前后细胞上清液中明胶酶的分泌.结果:EphA2 反义寡核苷酸成功抑制了EphA2总蛋白的表达, 降低了VEGF蛋白和MMP9蛋白的表达.结论:EphA2 反义寡核苷酸通过降低结肠癌细胞株HCT116中VEGF,MMP9蛋白的表达来抑制结肠癌细胞株HCT116的侵袭和转移.     

生存素反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞株MMP-2及MMP-9表达的影响

目的:研究生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人乳腺癌MCF-7细胞株基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2及MMP-9表达的影响,以进一步阐明生存素介导乳腺癌浸润及转移的机制.方法:经脂质体介导将生...     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对胰腺癌细胞基质金属蛋白酶的影响

目的研究低氧状态下乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynu—cleotide,AS—ODN）对胰腺癌高转移细胞株MIAPaCa-2细胞基质金属蛋白酶．2（matrixmetalloproteinase．2,MMP-2）和MMP-9的影响。方法以HpaAS—ODN预先阻断MIAPaCa-2细胞Hpa表达并低氧培养,观察MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达的变化,明胶酶法检测MMP-2和MMP-9活性的变化,观察阻断Hpa对MMP-2和MMP-9表达及活性的影响。结果低氧培养条件下,MIAPaCa-2细胞MMP-2mRNA及蛋白表达略有上调,但是与常氧条件下培养对比,在6、12和24h差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。以ASODN阻断Hpa后,MMP-2mRNA及蛋白表达均无明显变化。低氧后6hMMP-9mRNA及蛋白表达开始升高,12h（P〈0．05）和24h（P〈0．01）更加明显。阻断Hpa表达后,MMP-9mRNA及蛋白表达在各时间段均有下降,而在24h下降明显,差异具有统计学意义（P〈0．01）。低氧后12h和24h,活化型的MMP-2和MMP-9均显著增强,当Hpa表达被抑制后,于12h（P〈0．01）和24h（P〈0．01）活化型的MMP-9活性受到明显抑制,而各时间内,活化型的MMP-2活性均不受HpaAS—ODN的影响（P〉0．05）。结论低氧可刺激MIAPaCa-2细胞MMP-9mRNA及蛋白的表达,增强酶活性。预先阻断Hpa表达在12h和24h可抑制MMP-9mRNA和蛋白的表达,降低MMP-9的活性,而对MMP-2则无明显影响。     

视黄酸缺乏对斑马鱼心脏房室分化的影响

目的 通过化学遗传学方法建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,探讨视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏前后轴发育即房室分化的影响.方法 在斑马鱼胚胎孵育的5 hpf,用不同浓度梯度的视黄醛脱氢酶2抑制剂DEAB(1×10-6、5×10-6、10×10-6、25×10-6 mol/L)处理斑马鱼胚胎,实时观察斑马鱼胚胎发育的全过程.通过给予斑马鱼胚胎外源性视黄酸,观察其对DEAB的拮抗作用.应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸缺乏对心脏特异基因vmhc和amhc表达的影响.结果 斑马鱼胚胎的生存率随着DEAB处理浓度的增加而降低,当DEAB浓度≥5×10-6 mol/L时,斑马鱼的畸胎率达100%.5×10-6 mol/L DEAB的致畸作用能够被1×10-9mol/L外源性视黄酸所拮抗.整体原位杂交结果显示视黄酸缺乏会导致斑马鱼胚胎心脏房室分化异常,表现为vmhc表达细胞的范围增大,amhc表达细胞的范围缩小.结论 通过外源性DEAB处理能有效地建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,DEAB影响胚胎发育存在剂量依赖性.视黄酸在斑马鱼心脏前后轴发育过程中起重要调控作用,心脏发育早期视黄酸缺乏会抑制心房的发育而支持心室的发育,出现房室分化异常.     

低氧微环境对MDA-435细胞株MMP2、9及其抑制剂TIMP21表达的影响

目的：探讨低氧微环境对人乳腺癌细胞株MDA 435中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及其抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)表达的影响。方法：分别置人乳腺癌细胞株MDA 435于常氧（21% O2、5% CO2）和低氧（1% O2、5% CO2和94% N2）环境中培养6?h，RT PCR技术mRNA水平检测MMP2、9及TIMP2、1的表达。结果：MDA 435细胞株表达MMP9和TIMP1 mRNA，未检测到MMP2和TIMP2 mRNA；低氧环境下MDA 435细胞株中MMP9 mRNA 水平显著上升(P＜0.05)，TIMP1基因的表达在低氧环境与常氧环境下差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：与常氧环境相比，低氧环境下乳腺癌细胞株MDA 435中MMP9及其抑制剂TIMP1的表达平衡发生了改变，提示，进行肿瘤转移分子机制的体外研究应充分考虑氧环境的影响。     

60Co γ射线辐照对人前列腺癌PC-3细胞MMP家族基因表达的影响

目的:通过用不同剂量60Co γ射线照射人前列腺癌细胞系PC-3细胞后, 观察MMP2, MMP9的变化,阐明γ射线对前列腺癌PC-3细胞转移侵袭能力的影响. 方法:采用1, 3和5 Gy不同剂量的60Co γ射线,分别照射体外培养的人前列腺癌PC-3细胞系,用MTT方法观察细胞生长,软琼脂克隆集落形成试验观察细胞的克隆形成率;Western Blot检测其蛋白含量变化. 结果:① 1, 3和5 Gy组均可明显抑制细胞的生长;②细胞的克隆形成率随着照射剂量的增加而逐渐降低;③ Western Blot检测其蛋白含量,显示在各实验组中MMP2总体上出现降低趋势;MMP9表达在1, 3和5 Gy组均高于对照组. 结论:亚致死剂量的60Co γ射线照射前列腺癌PC-3细胞后,MMP9表达增高,提示存活肿瘤细胞的浸润性也同时增高.     

Effect of Tbx1 knock-down on cardiac performance in zebrafish

Background Tbxl is the major candidate gene for DiGeorge syndrome （DGS）. Similar to defects observed in DGS patients, the structures disrupted in Tbxl-/- animal models are derived from the neural crest cells during development. Although the morphological phenotypes of some Tbxl knock-down animal models have been well described, analysis of the cardiac performance is limited. Therefore, myocardial performance was explored in Tbxl morpholino injected zebrafish embryos. Methods To elucidate these issues, Tbxl specific morpholino was used to reduce the function of Tbxl in zebrafish. The differentiation of the myocardial cells was observed using whole mount in situ hybridization. Heart rates were observed and recorded under the microscope from 24 to 72 hours post fertilization （hpf）. The cardiac performance was analyzed by measuring ventricular shortening fraction and atrial shortening fraction.Results Tbxl morpholino injected embryos were characterized by defects in the pharyngeal arches, otic vesicle, aortic arches and thymus. In addition, Tbxl knock down reduced the amount of pharyngeal neural crest cells in zebrafish. Abnormal cardiac morphology was visible in nearly 20% of the Tbxl morpholino injected embryos. The hearts in these embryos did not loop or loop incompletely. Importantly, cardiac performance and heart rate were reduced in Tbxl morpholino injected embryos.Conclusions Tbxl might play an essential role in the development of pharyngeal neural crest cells in zebrafish. Cardiac performance is impaired by Tbxl knock down in zebrafish.     

反义微小RNA-21对人膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨微小RNA-21（miRNA-21）反义寡核苷酸（ASOND）对人膀胱癌细胞株T24增殖和凋亡的影响,为膀胱癌的治疗提供理论依据。 方法：将脂质体介导的反义寡核苷酸（AS-miRNA-21）转染T24细胞,设转染无义序列组、对照组和AS-miRNA-21转染组,采用蛋白印迹(Western blotting)检测转染细胞miRNA-21表达水平,噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞仪（FCM）分别检测转染细胞的增殖和凋亡情况,转染无义序列组、对照组分别与AS-miRNA-21转染组比较。 结果：经过转染AS-miRNA-21的T24细胞miRNA-21表达水平下降,细胞增殖能力受抑。AS-miRNA-21组T24细胞增殖率为53.6%,转染无义序列组T24细胞增殖率为92.5%,对照组为100%;相对应的凋亡率分别为13.8%、1.9%和2.7%。上述3组间T24细胞的增殖率、凋亡率比较差异均有显著性（P<0.01）。 结论：反义miRNA-21对人膀胱癌细胞T24具有抑制增殖和促进凋亡的作用,抑制miRNA-21表达有望成为膀胱癌基因治疗的有效方法。     

Retinol dehydrogenase, RDH1l, is essential for the heart development and cardiac performance in zebrafish

Background Retinoic acid (RA) is a potent signaling molecule that plays pleiotropic roles in patterning,morphogenesis,and organogenesis during embryonic development.The synthesis from retinol (vitamin ...     

raldh2基因阻抑导致斑马鱼心脏发育畸形的机制

目的通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸(MO)阻抑视黄醛脱氢酶2(raldh2)基因表达,探讨raldh2基因阻抑对斑马鱼胚胎心脏发育的影响及可能的分子机制。方法根据斑马鱼raldh2基因起始密码区域序列设计合成吗啡啉修饰的反义寡核苷酸,采用显微注射方法阻抑斑马鱼胚胎raldh2基因表达。构建raldh2-EG-FP重组质粒进一步验证MO的特异性和有效性。分析raldh2基因阻抑后对胚胎发育,尤其心脏表型和功能的影响。通过胚胎整体原位杂交,分析心脏相关nppa和tbx20基因表达模式以及raldh2阻抑后对其表达的影响。结果显微注射raldh2-MO能有效地特异地阻抑斑马鱼胚胎raldh2基因表达,raldh2-MO对胚胎发育影响呈剂量依赖性。raldh2基因阻抑可导致胚胎心脏发育畸形,干扰正常的房室分化和向右环化,导致房室瓣血液反流。与野生型胚胎比较,raldh2基因阻抑组胚胎心率和心室收缩分数降低(P<0.05),心功能受损。整体原位杂交结果显示raldh2基因阻抑后nppa基因表达改变,心室部位nppa表达清晰,而心房部位表达减弱。tbx20基因在心脏、运动神经元、顶盖及视网膜表达,raldh2基因阻...     

The Retinol Dehydrogenase, RDH1l, is essential for the heart development and cardiac performance in zebrafish

中文摘要 视黄酸是在胚胎排列模式,形态发生及其后的器官形成等一系列胚胎发育过程中起着重要作用的信号因子。从视黄醇（维生素A）合成视黄酸需要两个顺序发生的氧化反应。第一个步骤是视黄醇通过视黄醇脱氢酶催化的氧化过程生成视黄醛。RDH1l是一个新发现的斑马鱼视黄醇脱氢酶。本文我们详细观察了斑马鱼RDH1l在斑马鱼心脏发育和心脏功能中的作用研究。采用RDH1l特异性吗啡啉反义寡核苷酸显微注射下调基因功能。采用整体原位杂交方法观察基因下调对基因表达模式的影响。解剖显微镜下记录斑马鱼胚胎孵化后24-72小时心率变化情况。采用心室收缩指数作为评估心脏功能的指标。 RDH1l吗啡啉寡核苷酸注射组胚胎神经嵴迁移异常和神经嵴细胞数量减低。同时RDH1l吗啡啉寡核苷酸注射组胚胎心神经嵴细胞数量减低。吗啡啉反义寡核苷酸介导的基因下调导致心脏环化异常。RDH1l基因下调胚胎左-右决定基因的表达模式发生改变。同时RDH1l基因下调胚胎心脏功能减低。这些结果说明RDH1l对于斑马鱼心脏发育和心脏功能起着重要的作用。RDH1l在神经嵴细胞的发育中起着至关重要的作用,并且最终导致心脏环化过程和心脏功能。这一结果首次表明参与视黄醇-视黄醛转化的酶在斑马鱼心脏发育过程和心脏功能中起着重要作用。     

利用吗啉代寡核苷酸技术下调早期斑马鱼胚胎lmna基因的初步研究

目的利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼lmna基因的技术方法。方法在斑马鱼lmna基因序列中选择靶点,设计针对斑马鱼lmna基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),构建能特异指示lmna基因表达的lmna-EGFP-pCS~(2+)重组质粒,并通过显微注射方式将二者共注射入斑马鱼胚胎中,通过观察胚胎中绿色荧光表达量反应lmna基因表达量,并通过蛋白质印迹法检测胚胎中lamin蛋白表达量。结果蛋白质印迹法检测斑马鱼体内lamin蛋白的表达,分别有大小为69 KD和62 KD两种蛋白表达。设计并构建了lmna-MO和重组质粒lmnaEGFP-pCS~(2+),单独注射lmna-EGFP-pCS~(2+)质粒后观察到从6 hpf到96 hpf胚胎均有绿色荧光蛋白表达;二者共注射后观察到,与对照组相比,实验组从6 hpf至30 hpf胚胎中绿色荧光蛋白表达量均不同程度下降或消失;蛋白质印迹实验结果显示实验组胚胎内lamin蛋白表达量明显下降。表明已成功下调了斑马鱼胚胎lmna基因表达。结论可通过lmna-MO和重组质粒lmna-EGFP-pCS~(2+)共注射方法下调斑马鱼lmna基因表达,并通过绿色荧光蛋白表达量反映下调效果。该方法可为深入研究人核纤层病提供良好的动物模型。     

人巨细胞病毒对巨核细胞生长的影响及其反义寡核苷酸的抗病毒活性

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)对人巨核系祖细胞的抑制作用及其机制,初步研究HCMV反义寡核苷酸(ASON)的抗病毒感染作用。方法采用体外悬浮培养巨核系细胞,观察HCMV AD169株对巨核系祖细胞生长的影响。用流式细胞术检测HCMV感染巨核系细胞上HCMV pp65抗原的表达。用HCMV感染经ASON预处理的巨核细胞,计数存活巨核细胞数,用FACS检测巨核细胞上HCMV pp65蛋白表达,并用MTT法测定ASON的细胞毒性。结果HCMV AD169株在体外能明显抑制巨核系祖细胞的增殖,悬浮培养第12天,与对照组相比,HCMV感染组的巨核细胞数减少了67.86%(P<0.05)。HCMV感染的巨核系细胞有HCMV pp65抗原的表达,其表达率为(24.5±3.1)%。0.08μmol/L的UL36反义寡核苷酸(UL36Anti)能对抗HCMV的作用,使巨核细胞数保持在未被感染时的水平,与HCMV感染组巨核细胞数比较有显著差异(P<0.05)。UL36Anti组巨核细胞上几乎无HCMV pp65蛋白的表达。MTT结果表明UL36Anti显著影响细胞生长的浓度为90μmol/L。结论HCMV感染引起的血小板减少与其抑制巨核系祖细胞增殖有关。特异的ASON有一定的抗HCMV活性,有可能作为一种新的手段用于HCMV感染引起的血小板减少症的防治。     

韧粘素反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的探讨韧粘素 (TN)反义寡核苷酸 (ODN)对培养大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的抑制作用。方法采用细胞计数及快速竞争性逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)等方法 ,观察不同剂量 ( 5、10、2 0 μg/ml)TN反义ODN和正义ODN对体外培养大鼠VSMC的增殖以及TNmRNA表达水平的影响。　结果TN反义ODN可有效抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖 ,作用呈剂量依赖性 (反义组 5、10、2 0 μg/ml剂量细胞计数分别为 10 5/ml× ( 4 .99± 0 .2 1)、( 4 .0 8± 0 .14 )、( 2 .85± 0 .39) ,对照组为 10 5/ml× ( 5 .95± 0 .41) ,(P <0 .0 5 ) ;TN反义ODN亦可下调TNmRNA表达水平 (反义组 0 .32± 0 .0 5 ,对照组为 0 .5 2± 0 .0 8;P <0 .0 1) ;而TN正义ODN则无上述作用。　结论TN反义ODN可能通过下调TNmRNA表达水平而抑制血管平滑肌细胞的增殖。     

基质金属蛋白酶在心肌肥厚大鼠细胞外基质重塑中的作用及氯沙坦干预

目的 :探讨基质金属蛋白酶 (MMP 9)及其生理性抑制剂TIMP 1和转化生长因子β1(TGF β1)在心肌肥厚大鼠细胞外基质重塑中的作用及氯沙坦干预的效果 .方法 :雄性SD大鼠随机分为 3组 :①对照组 ;②去甲肾上腺素 (nore pinephrine,NE)组 (1.0 6mg·kg-1·d-1× 15d) ;③NE +氯沙坦组 (10mg·kg-1·d-1× 15d) .NE腹腔注射 ,2次·d-1,连续15d ,建立心肌肥厚的模型 .应用超声心动图及病理学方法评价整体心肌肥厚和组织胶原的表达 .用逆转录 聚合酶链反应法 (RT PCR)及免疫组化方法检测MMP 9,TIMP 1和TGF β1mRNA和蛋白表达情况 .结果 :大鼠腹腔注射NE后发生左心室肥厚及纤维化 ,胶原的含量及MMP 9,TIMP 1和TGF β1的蛋白、mRNA的表达显著高于健康对照组 (P <0 .0 1) .氯沙坦能降低室间隔的厚度 ,减少左室心肌中总体胶原、I型、III型胶原的合成及MMP 9,TGF β1的表达 (P <0 .0 1) .结论 :MMP 9,TIMP 1和TGF β1与NE诱导的心肌细胞外基质重塑有关 .氯沙坦能有效的防治心肌肥厚及细胞外基质重塑 ,这一效应与其降低心肌中高表达的MMP 9和TGF β1有关 .