应用Ⅳ型胶原黏附法进行人表皮干细胞的体外快速分离与鉴定

目的:以Ⅳ型胶原黏附法体外快速分离人表皮干细胞,利用其特异性标记物β1整合素及角蛋白19鉴定所培养细胞是否为表皮干细胞。方法:实验于2004-05/2005-03在南昌大学医学院烧伤研究所完成。①包皮来自行包皮环切术的儿童,由南昌大学第一附属医院提供,患者及其家属均签署知情同意书。②取手术刚切下的新鲜包皮,剔除皮下组织,采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞。收集处于对数生长期的第2～3代成纤维细胞的上清液,过滤除菌后与角朊细胞无血清培养基等比例混合,再加入体积分数为0.1的胎牛血清、表皮生长因子5μg/L、氢化可的松400μg/L、氯化钙0.05mmol/L、L-谷氨酰胺0.1mol/L、牛垂体提取物1.0mg/L,组成表皮干细胞培养液。分离的表皮片浸入2.5g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸消化液中5min,所得细胞以表皮干细胞培养液悬浮。③将获得的角朊细胞悬液接种于预铺Ⅳ型胶原的六孔板中,每孔接种约1.5mL,室温静置10min,吸除未贴壁细胞,磷酸盐缓冲液漂洗至无细胞悬浮,即为富集分离的人表皮干细胞。加入人表皮干细胞培养基常规培养,第3天换液,后每隔1d换液一次。以同一标本同一批次培养的角朊细胞作为对照。④通过检测β1整合素、角蛋白19的表达水平及其克隆形成率和克隆维持时间,对其进行鉴定,以角朊细胞作为对照。结果:①人表皮干细胞形态学观察:倒置显微镜下,从角朊细胞中分离出的表皮干细胞体积小,呈单个、圆形贴壁,分散生长;培养12d后呈克隆样生长。②人表皮干细胞的克隆形成率:与同一标本同一批次培养的角朊细胞比较,人表皮干细胞的克隆形成率高[(8.72±0.73)%,(17.04±1.01)%,P<0.01],克隆维持时间更长[(9～10)d,(15～18)d,P<0.01]。③人表皮干细胞β1整合素和角蛋白19的表达:β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论:①应用Ⅳ型胶原黏附法可对人表皮干细胞进行体外快速分离。②结合细胞形态学、细胞高克隆形成率和特异性标记物阳性表达等多种手段,鉴定所培养细胞为表皮干细胞。     

成体表皮干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨成体表皮干细胞体外分离、培养和鉴定的技术方法。为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法 通过中性蛋白酶消化成人包皮获得表皮细胞，再通过胰蛋白酶与乙二胺四乙酸（EDTA）消化并制成单个表皮细胞悬液，接种至人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内．以Dulbecco改良Eagle培养基／F12（DMEM／F12，1：1）作为表皮干细胞培养基置培养箱内培养，37℃静置10～l5min，留用快速贴壁细胞继续培养，所得细胞分别以能否呈克隆状生长、流式细胞仪测细胞周期、透射电镜观察其超微结构及β1-整合素、角蛋白19（K19）免疫细胞化学染色进行鉴定。结果 人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞继续培养24h后细胞呈克隆状生长；电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征；细胞周期分析示，第2代中静息期／DNA合成前期（G0／G1期）细胞占86．83％。β1-整合素、K19免疫细胞化学染色呈阳性。结论 成体表皮干细胞在体外得到成功分离与培养。     

体外分离、纯化人表皮于细胞促进皮肤的功能生理性修复

目的 表皮干细胞是皮肤发生、修复、重建的关键“种子细胞”，因而研究建立人表皮干细胞体外分离、培养及鉴定的方法非常重要。方法 通过本科消化法，分离小儿包皮的表皮与真皮层，表皮制成单细胞悬液，以高糖低钙的DMEM培养基，补充100ml/L的干细胞培养专用胎牛血清（FBS），0.05mmol/L氯化钙，10ng/ml表皮生长因子，1&;#215;10^-6mol/L氢化可的松进行培养，在实验之前用胶原Ⅳ包被直径35mm的培养皿，其中有些放置消毒盖坡片以制“细胞玻片”，置4℃冰箱中放置30min以上，吸干胶原Ⅳ，再将培养皿置室温下自然干燥半小时以上，备用。调整细胞含量为2&;#215;10^6/ml，接种于包被好胶原Ⅳ的培养皿中快速黏附10-15min（37℃），弃去未黏附细胞，保留快速黏附细胞继续培养。培养至21d对所培养细胞进行流式细胞仪α6、CD71表型鉴定，角蛋白19（K19）、角蛋白5（K5）免疫细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果 在胶原Ⅳ包被的细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果 在胶原Ⅳ包被的培养皿中快速贴壁细胞经继续培养，可见细胞克隆数增多，细胞传代次数达8-10次，培养时间达2个月。K19，K5免疫化学染色阳性，α6^briCD71^dim细胞占细胞总数的40%左右。结论 研究表明用胶原Ⅳ快速黏除法可从包皮分离和富集表皮干细胞，用此体外培养体系，可较好地扩增表皮干细胞。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的：通过表皮干细胞对基底膜的黏附性，利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质，探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法：取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤，通过酶消化法获得幼鼠表皮，并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物，利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果：与角质细胞对照，表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好，克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色；广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论：用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

体外分离、纯化人表皮干细胞促进皮肤的功能生理性修复

目的表皮干细胞是皮肤发生、修复、重建的关键“种子细胞”,因而研究建立人表皮干细胞体外分离、培养及鉴定的方法非常重要。方法通过酶消化法,分离小儿包皮的表皮与真皮层,表皮制成单细胞悬液,以高糖低钙的DMEM培养基,补充100ml/L的干细胞培养专用胎牛血清(FBS),0.05mmol/L氯化钙,10ng/ml表皮生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松进行培养。在实验之前用胶原IV包被直径35mm的培养皿,其中有些放置消毒盖玻片以制“细胞玻片,置4℃冰箱中放置30min以上,吸干胶原IV,再将培养皿置室温下自然干燥半小时以上,备用。调整细胞含量为2×106/ml,接种于包被好胶原IV的培养皿中快速黏附10～15min(37℃),弃去未黏附细胞,保留快速黏附细胞继续培养。培养至21d对所培养细胞进行流式细胞仪α6、CD71表型鉴定,角蛋白19(K19)、角蛋白5(K5)免疫细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果在胶原IV包被的培养皿中快速贴壁细胞经继续培养,可见细胞克隆数增多,细胞传代次数达8～10次,培养时间达2个月。K19,K5免疫化学染色阳性,α6briCD71dim细胞占细胞总数的40%左右。结论研究表明用胶原IV快速黏附法可从包皮分离和富集表皮干细胞,用此体外培养体系,可较好地扩增表皮干细胞。     

Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景:发育生物学研究表明,表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉,如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞,并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。目的:观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况,并与角质细胞进行对照。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:因创伤等原因致意外流产的妊娠24~26周龄胎儿皮肤标本,由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品,角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。方法:将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100mg/L,均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本,剪成3.0mm×5.0mm皮条片,4℃胰蛋白酶 EDTA联合消化8~10h,表皮真皮分离,用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打,获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,20min后吸去培养液和未黏附细胞,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10μg/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液,细胞约70%~80%融合后传代扩增;将未黏附细胞接种于另一培养板中,相同条件下作为角质细胞对照培养。主要观察指标:表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。结果:经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形,折光性较强;1d后细胞略伸展为扁平的多角形,胞质近中央处有圆形核;3d时出现表皮干细胞克隆;5d时克隆数量明显增多,细胞之间紧密衔接,呈铺路石状;14d左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率(t=1.972,P<0.05)。结论:采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞,且呈明显克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特性。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的:通过表皮干细胞对基底膜的黏附性,利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质,探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法:取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤,通过酶消化法获得幼鼠表皮,并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物,利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果:与角质细胞对照,表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好,克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色;广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论:用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

重复利用Ⅳ型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞

目的：观察表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性，评价重复利用Ⅳ型胶原以差速黏附法在分选表皮干细胞中的效果。 方法：实验于2004—09／2005-06在解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所基础部完成。①包皮来自解放军空军总医院泌尿外科收治的7-25岁行包皮环切术患者。②未包被胶原的培养瓶作为对照1组，首次Ⅳ型胶原和3次Ⅳ型胶原包被的培养瓶分别作为对照2组和实验组1，将包被Ⅳ型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组2。③人角质形成细胞分别接种其上，15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数；对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察；并用β1整合素、鼠抗人角蛋白19对贴壁的细胞进行鉴定。 结果：①胶原包被组的贴壁细胞数明显增多沪≤0．05），并于5d铺满培养瓶底，而对照1组2d后仍未铺满瓶底。对照1组15min细胞贴壁数显著低于对照2组、实验1组、实验2组[（119．0&;#177;3．0），（246．3&;#177;19．6），（241．3&;#177;15．3），（262．0&;#177;11．1）个／100倍视野，P≤0．01]；对照2组与各实验组差异无显著性意义（P〉0．05）。②贴壁细胞β1整合素和鼠抗人角蛋白19表达阳性。 结论：表皮干细胞对Ⅳ型胶原具有较好的黏附特性，回收利用Ⅳ型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响，并可节约费用。     

人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

背景：皮肤真皮组织是皮肤损伤修复时除表皮基底层以外可形成表皮层结构的重要干细胞来源。目的：探索从人皮肤真皮组织中分离培养角朊干细胞样细胞的新方法。方法：将一定大小的成人腹部全层皮肤组织用Dispase过夜消化后去除表皮层结构,然后用0．1％I型胶原酶过夜消化,离心分离以获取真皮来源总细胞。将分离的细胞用含有体积分数1％N2,2％B27,20μg／L表皮生长因子和40pg／L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM／F12（1：1）无血清培养液悬浮后以低密度接种于培养皿进行培养。采用RT-PCR和免疫细胞荧光染色法对其进行分析。结果与结论：RT-PCR分析结果显示所分离的真皮细胞中含有表达Lgr5和Lirgl等特异基因的毛囊来源干细胞;免疫细胞荧光分析结果显示其表达细胞角蛋白8和细胞角蛋白14。在无血清条件下培养6d时,可观察到表达细胞角蛋白14和整合素α6的“铺路石”样细胞克隆。进行传代培养后P1细胞表达角朊干细胞标志物CD29、细胞角蛋白14和P63。传代培养至P3,4时大部分细胞分化,不能继续传代。结果证实,以无血清培养液结合低密度培养法可直接从人真皮组织中有效地培养增殖活跃、细胞角蛋白14和P63阳性的角朊干细胞样细胞。     

重复利用Ⅳ型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞

目的:观察表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性,评价重复利用Ⅳ型胶原以差速黏附法在分选表皮干细胞中的效果。方法:实验于2004-09/2005-06在解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所基础部完成。①包皮来自解放军空军总医院泌尿外科收治的7～25岁行包皮环切术患者。②未包被胶原的培养瓶作为对照1组,首次Ⅳ型胶原和3次Ⅳ型胶原包被的培养瓶分别作为对照2组和实验组1,将包被Ⅳ型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组2。③人角质形成细胞分别接种其上,15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数;对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察;并用β1整合素、鼠抗人角蛋白19对贴壁的细胞进行鉴定。结果:①胶原包被组的贴壁细胞数明显增多(P≤0.05),并于5d铺满培养瓶底,而对照1组2d后仍未铺满瓶底。对照1组15min细胞贴壁数显著低于对照2组、实验1组、实验2组[(119.0±3.0),(246.3±19.6),(241.3±15.3),(262.0±11.1)个/100倍视野,P≤0.01];对照2组与各实验组差异无显著性意义(P>0.05)。②贴壁细胞β1整合素和鼠抗人角蛋白19表达阳性。结论:表皮干细胞对Ⅳ型胶原具有较好的黏附特性,回收利用Ⅳ型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响,并可节约费用。     

实验室条件下人角质形成细胞的培养技术

背景:随着角质形成细胞体外培养技术的建立和发展,皮肤不再被认为是单纯的生理屏障,其在机体免疫和内分泌等方面尤为重要。目的:探讨实验室条件下人体角质形成细胞的培养技术,为角质形成细胞的多方面应用提供可靠的细胞来源。设计:开放性实验。单位:解放军第四军医大学西京医院临床免疫科和皮肤科。材料:实验于2003-03/2005-03在解放军第四军医大学西京医院临床免疫科实验室完成。选取同年4月西京医院泌尿外科门诊收治的1例6岁正常男性术后的包皮为角质形成细胞的来源。方法:①对表皮细胞分离过程采取两步消化法:首先运用离散酶对全层皮肤进行低温消化,将包皮皮片浸入质量浓度为2.5g/L的Dispase酶中,4℃过夜,次日分离表皮;第二步采用胰蛋白酶和乙二氨基四乙酸的混合液进行消化。②采用改良的无血清培养技术进行人体角质形成细胞的培养,培养基为人角质形成细胞无血清培养基 2.5mg/L牛垂体浸出液 5μg/L表皮生长因子 438mg/L谷氨酰胺,其中谷氨酰胺能促进角质形成细胞的生长。③将处于对数生长期的细胞进行人角质形成细胞的冻存和复苏,加入无血清培养基制成细胞悬液,调整细胞密度为5×105/mL接种入75cm培养瓶中传代培养。置于显微镜和透射电2镜下进行细胞形态观察。主要观察指标:①原代和传代细胞的生长情况。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况。③角质形成细胞形态学观察结果。结果:①原代和传代细胞的生长情况:初期细胞悬于培养液中,逐渐细胞贴附于培养皿底部。一般在6～24h内开始贴壁,细胞以圆形为主,随着时间的延长伸展成椭圆型。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落或小集簇,四周可见卫星样表皮细胞增殖,多数细胞为多角形,细胞的均质性和透明度加强。5d左右细胞融合范围可达70%,9d左右细胞融合达90%,11d左右细胞完全融合形成细胞膜片。角质形成细胞可在体外稳定培养2～3个月,细胞形态和生长速度无明显改变。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况:将不同代的角质形成细胞分别冻存于液氮罐中,3个月后进行复苏,发现角质形成细胞的形态和生长速度无明显改变。③角质形成细胞形态学观察结果:显微镜下细胞呈典型上皮样特征,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚折光性好。透射电镜下培养的表皮角质形成细胞胞浆内有大量束状张力丝和张力原纤维,可见线粒体和粗面内质网,胞质周边有短的突起,细胞间有桥粒相连等角化细胞所具有的特点。结论:培养的角质形成细胞在多次传代后仍能够保持正常的形态特征,提示改良的培养角质形成细胞的技术可为实验和临床提供可靠丰富的角质形成细胞来源。     

人羊膜负载猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物的实验研究

背景人羊膜为半透明的薄膜,含有多种促进细胞增殖的营养成分,是一种较好的负载角朊细胞的生物材料.目的将人羊膜负载培养猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物,并观察猪角朊细胞在人羊膜上生长增殖的形态特点.设计以细胞为研究对象,单一样本研究,重复测量观察.单位解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所.材料实验于2001-01/11在创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成.猪角朊细胞取自3月龄贵州小香猪.方法将贵州小香猪的角朊细胞原代培养,传代扩增后,将角朊细胞以1.63×105/cm2的密度接种于人羊膜基质面,逐日于倒置显微镜下观察角朊细胞的生长增殖变化情况,并于培养3 d与15 d进行光镜、电镜观察,检测角朊细胞在人羊膜上的生长情况.主要观察指标角朊细胞在人羊膜上的生长情况.结果倒置显微镜下观察接种后30 min内明显见到角朊细胞在人羊膜上黏附,24 h内大部分黏附生长,3 d形成单层完全覆盖人羊膜.光镜下人羊膜负载角朊细胞3 d,可见角朊细胞在人羊膜基质面黏附呈单层生长,细胞扁平紧密排列.扫描电镜下可见胞体呈多边形,多见胞膜突起.透射电镜下可见角朊细胞与人羊膜黏附良好,生长在人羊膜上的角朊细胞内有许多角质丝.生长至15 d,在倒置显微镜和扫描电镜下均可见,细胞因过于拥挤而隆起,因老化而形成较多碎片,部分细胞有空洞形成.结论人羊膜是角朊细胞在体外培养的良好载体,对角朊细胞有明显的促增殖作用.但人羊膜负载角朊细胞生长至15 d,因老化部分细胞有空洞形成.     

Role of keratinocytes in human recurrent herpetic lesions. Ability to present herpes simplex virus antigen and act as targets for T lymphocyte cytotoxicity in vitro

In human recurrent herpetic lesions epidermal keratinocytes are induced to express HLA class II (DR) antigens. Keratinocytes derived from human split skin and cultured in vitro were induced to express HLA-DR but not -DQ antigens with IFN gamma preparations. These stimulated keratinocytes presented herpes simplex antigen directly to autologous blood-derived T lymphocytes in four of four subjects (stimulation indices: 1.5-2.7), suggesting that keratinocytes may have an accessory herpes simplex virus (HSV) antigen-presenting role in addition to the Langerhans cells and macrophages in herpetic skin lesions. Blood mononuclear cells from eight herpes simplex seropositive subjects which were activated in vitro by HSV antigen for 6 d showed cytotoxicity specific for HSV in infected autologous keratinocytes. This was significantly increased by prestimulation with IFN gamma (51-56% to 83-85%). In four of eight patients some cytotoxicity also occurred against uninfected, IFN gamma-stimulated keratinocytes. Lymphocyte subset analysis showed that cytotoxicity against HSV-infected, IFN gamma-stimulated keratinocyte targets was mediated by both CD3+ T lymphocytes and Leu 11b+ natural killer cells. T lymphocyte cytotoxicity was mediated by both CD4+ and CD8+ T lymphocytes, suggesting a cytotoxic role for the activated CD4+ lymphocytes that initially predominate in herpetic lesions.     

Thrombospondin-induced adhesion of human keratinocytes.

Human epidermal keratinocytes obtained from normal skin attached and spread on thrombospondin (TSP)-coated plastic dishes but failed to attach and spread on untreated plastic culture dishes or dishes coated with fibronectin or laminin. These cells produced minimal amounts of immunoreactive TSP. Keratinocytes established in culture on MCDB 153 medium and maintained for one to three passages in an undifferentiated state by continued cultivation in this low Ca2+-containing medium attached and spread on plastic dishes as well as on TSP-coated dishes. These cells also secreted significant amounts of TSP into the culture medium. When the keratinocytes were incubated for one day in MCDB 153 medium supplemented with high Ca2+ or in MEM (which also contains high Ca2+), there was decreased secretion of TSP into the culture medium concomitant with a reduction in attachment and spreading on plastic culture dishes. Proteolytic fragments of TSP were examined for stimulation of keratinocyte attachment and spreading. A 140-kd fragment produced by removal of the 25-kd heparin-binding domain had similar activity to the intact molecule while the 25-kd fragment was without effect. Further proteolytic treatment of the 140-kd fragment gave rise to a fragment consisting of 120 kd and 18-D moieties held together in disulphide linkage. This fragment did not support attachment or spreading. This study reveals that normal epidermal keratinocytes grown under conditions that maintain the undifferentiated state are able to produce TSP and utilize it as an attachment factor. When keratinocytes are grown under conditions that promote differentiation, ability to produce and utilize TSP is diminished. Since TSP is present at the dermal-epidermal junction and because TSP promotes keratinocyte attachment and spreading, this molecule may play an important role in maintaining normal growth of the basal cell layer and may also participate in reepithelialization during wound repair.     

在铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿气-液交界面培养角质形成细胞形成皮肤样器官

背景:浸没式体外培养角质形成细胞的技术已得较普遍的应用,但角质形成细胞的体外器官样培养技术尚存在不足.目的:以铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿,提供的气-液交界面体外培养角质形成细胞,以改进角质形成细胞的体外器官样培养技术.设计、时间及地点:体外人工皮肤器官实验,于2008-07/2009-02在河北医科大学第一医院实验室完成.材料:角质形成细胞由解放军第二军医大学王教授馈赠.方法:将浸没式培养的角质形成细胞接种到铺有鼠尾胶原的Transwell培养板套皿当中,Transwell培养板套皿每板有6个孔,每孔当中有一插件,插件悬挂于孔的边缘上,插件底面为一孔径为0.4 μm的高分子膜,距离培养板孔的底面有1.5 mm的高度,使细胞处于气-液交界面上并培养4周,然后将不同培养时段的培养物进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学、流式细胞仪检测,进而观察细胞分层和分化的状况.主要观察指标:观察细胞的生长状态及分层和分化状态.结果:培养2周的角质形成细胞大部分为单层结构,细胞彼此衔接成铺路石状结构,多数细胞为三角形或多角形结构,细胞核清晰可见,细胞比较饱满.部分区域细胞出现双层结构,表现为单层的角质形成细胞上面铺有连接成条索状的细胞.3周的角质形成细胞大部分为双层结构,异层及同层细胞之间彼此衔接,呈索形结构,细胞核仍然清晰可见,细胞不如2周时饱满.4周的角质形成细胞部分区域为三层结构,且细胞较前变得萎缩,表现为细胞浆减少,细胞核变小.角质形成细胞进行气-液交界面培养至4周,细胞会分为3层,表层的细胞会表达终末分化的标志物角蛋白10.结论:在Transwell培养板套皿膜上,角质形成细胞会出现分层和分化,形成体外的皮肤样器官.     

A comparison of targeting performance of oncoretroviral versus lentiviral vectors on human keratinocytes

The epidermis, like other rapidly renewing tissues, relies on a stem cell compartment to undergo constant regeneration. In order to develop realistic and long-lasting therapeutic approaches for some skin disorders, gene transfer to these critical cells must be obtained. While efficient retroviral ex vivo targeting and transgene integration in human keratinocytes is tightly dependent on proliferation, transferring genetic information to quiescent cells in culture also presents advantages, including the possibility of targeting putative dormant epidermal stem cells. In the present study we compared the efficiency of transduction achieved with a third-generation of human immunodeficiency virus (HIV)-based lentiviral vector to that obtained with a Moloney murine leukemia oncoretroviral vector (MLV) on proliferating and quiescent human keratinocytes growing in vitro in standard Rheinwald and Green cultures as well as in confluent organotypic cultures. Each viral vector contained the enhanced green fluorescent protein (EGFP) as a reporter gene. The lentiviral vector, but not the MLV vector, led to EGFP expression both in nondividing and proliferating epidermal cell populations in vitro. This feature was clearly evident when direct targeting of human keratinocytes, forming part of the epidermal component of an organotypic skin culture, was attempted. Keratinocytes modified by both MLV and the lentiviral vector allowed long-term regeneration of genetically engineered human skin on the backs of immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency disorders (NOD/SCID) mice. However, EGFP transgene expression in the context of the MLV (long-terminal repeat [LTR]-driven) or lentiviral vector (cytomegalovirus [CMV]-driven) demonstrated clear differences both in quantitative terms and in the in vivo localization pattern.     

表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼诱导人表皮角质细胞凋亡的研究

目的:探讨表皮因子受体抑制剂吉非替尼对分离培养的人表皮角质细胞的生长抑制及其诱导凋亡的作用机制,为探寻其对皮肤的毒副作用机制奠定基础.方法:采用分散酶分离表皮细胞,无血清培养法进行表皮细胞的培养,MTT法检测吉非替尼对角质细胞生长的影响,Annexin V-FITC/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blotting检测Bcl-2、bim的变化,采用caspase-3 试剂盒检测caspase-3活性的变化.结果:以分散酶分离法成功得到8例人角质细胞,吉非替尼对人角质细胞生长有显著的抑制作用,并能显著诱导细胞发生凋亡,其作用呈明显的量效依赖性.吉非替尼能明显提高bim表达水平,促进caspase-3的活性.结论:吉非替尼通过调节Bcl-2家族蛋白及激活caspase-3诱导人角质细胞凋亡,抑制角质细胞增殖,这可能是其皮肤毒性的分子生物学基础.     

Human keratinocytes contain mRNA indistinguishable from monocyte interleukin 1 alpha and beta mRNA. Keratinocyte epidermal cell-derived thymocyte-activating factor is identical to interleukin 1

Keratinocytes produce an IL-1 like factor termed epidermal cell-derived thymocyte-activating factor (ETAF). In this study, we show that ETAF and IL-1 are identical by the following criteria: Both normal and malignant human keratinocytes contain mRNAs identical to monocytic IL-1 alpha and IL-1 beta mRNA, as determined by an S1 nuclease protection assay; and IL-1 activity in medium conditioned by these cells can be neutralized by antibodies specific for human IL-1. The IL-1 alpha and IL-1 beta mRNAs can be identified in cultured human keratinocytes in the absence of identifiable stimulation; this basal level of mRNA can be further induced to accumulate with certain defined stimuli. Cultured normal human keratinocytes (HFKs) contain 2-4 times more IL-1 alpha than IL-1 beta mRNA; in contrast, human peripheral blood monocytes contain 10-20 times more IL-1 beta than IL-1 alpha mRNA. The IL-1 activity released by these HFK can be neutralized by an antibody that neutralizes both alpha and beta IL-1, but not by an antibody that neutralizes only IL-1 beta. While human monocytes produce a large excess of IL-1 beta after appropriate stimulation, these data suggest that IL-1 alpha is a major (and may be the predominant) form of IL-1 produced by human keratinocytes.     

Detection of transforming growth factor alpha in normal, malignant, and hyperproliferative human keratinocytes

Transforming growth factor alpha (TGF-alpha) is a 50-amino acid peptide, previously demonstrated only in transformed cell lines and human tumors, which is structurally homologous to epidermal growth factor (EGF). TGF-alpha expression in keratinocytes from normal individuals, patients with psoriasis, and patients with malignant skin diseases was investigated using an mAb raised against synthetic human TGF-alpha. mAb A1.5 reacted with TGF-alpha, but not EGF, in a sensitive ELISA. Keratinocytes in eight nodular basal cell carcinomas, one morpheic basal cell carcinoma, and one squamous cell carcinoma demonstrated intense membranous immunoperoxidase staining with mAb A1.5. Of even greater interest was the observation that the overlying normal epidermis, as well as the epidermis from five normal skin specimens, were stained by the mAb. Keratinocytes in plaques from 18 psoriasis patients were more intensely stained than those from normal skin. Cultured normal keratinocytes demonstrated membranous staining with mAb A1.5. Absorption of mAb A1.5 with synthetic human TGF-alpha completely removed the reactivity of mAb A1.5 with both basal cell tumors and normal epidermis. The demonstration of TGF-alpha in normal keratinocytes suggests that it plays a role in normal keratinocyte growth, wound healing, and in the pathogenesis of acanthosis.     

表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的实验研究

目的探讨表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的可行性。方法（1）用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成人表皮干细胞培养基进行体外培养,测定克隆形成率。（2）将培养人表皮干细胞接种于制备的脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤,移植治疗兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果。（3）取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面,随机分为4组：A、B、C组分别用含表皮干细胞的组织工程皮肤、含角质细胞的组织工程皮肤和单纯脱细胞真皮移植于皮肤缺损创面;D组用创面空置为对照。观察创面修复情况、局部炎症反应,并记录创面愈合时间。结果体外培养的人表皮干细胞增殖稳定,克隆形成率明显高于角质细胞对照组（P〈0．05）。移植后A组创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较B、C、D组明显缩短（P〈0．05或P〈0．01）。结论以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用于皮肤缺损创面的修复治疗。