无血清神经基质培养基培养纯化的视网膜神经节细胞

目的 建立无血清培养基培养纯化原代视网膜神经节细胞（RGCs）的方法，为研究青光眼等引起的RGCs损伤及防护提供理想的细胞模型。 方法 出生后1～3 d的SD大鼠视网膜细胞悬液，分别经抗大鼠信号调节蛋白（CD172G）单克隆抗体筛除巨噬细胞、抗大鼠Thy-1单克隆抗体筛选RGCs的两步筛选法，得到纯化的RGCs。用加入B27、睫状神经营养因子等的无血清神经元专用神经基质（neurobasal）培养基进行培养，通过细胞形态学观察、Thy-1免疫荧光细胞化学染色、钙黄绿素-乙酰乙酸酯（AM）染色等方法观察原代培养的视网膜神经细胞及纯化培养的RGCs生长并进行鉴定。 结果 原代培养的视网膜细胞中约91%为神经细胞。纯化培养的RGCs接种后24 h有突起长出;第4～8天可见细胞形态均一，细胞体较大，细胞突起较长;至第14天，仍有超过60%的细胞有活性。Thy-1的免疫荧光细胞染色结果显示RGCs纯度约为90%。钙黄绿素-AM染色存活的RGCs，结果显示RGCs细胞体较大，多数细胞有长度大于细胞体直径2倍的突起。 结论 该方法培养的RGCs大小均一、形态理想、纯度高，适宜研究各种因素引起的RGCs损伤及保护剂效果评价。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 200-203)     

BDNF/GDNF对体外三维培养的成熟视网膜神经节细胞轴突再生的促进作用

目的建立成熟视网膜神经节细胞(RGCs)的体外三维培养模型,并应用此方法研究BDNF/GDNF对体外三维培养的成熟RGCs轴突再生的促进作用。方法取10周龄大鼠,每只鼠眼视网膜切成0·5mm×0·5mm大小16片。将视网膜片神经纤维层向下浸入12孔培养板的胶原溶液层中,胶原溶液凝固后,培养孔内加入无血清MEM培养液。实验组另外分别添加BDNF/GDNF100ng/ml。相差显微镜观察生长情况,记数每片视网膜外生神经突起数。应用羊抗鼠FITC-Thy-1·1单克隆抗体鉴定培养的神经节细胞突起。结果RGCs突起在凝胶中呈螺旋迂曲生长,无神经因子可存活2周以上,加入神经因子可存活3~4周。培养6d后计数每片视网膜外生神经突起数,BDNF对照组和实验组分别为24·4±11·7和51·2±15·6。GDNF对照组和实验组分别为19·9±11·6和33·6±18·5。免疫组织化学荧光显色神经节细胞突起呈阳性反应。结论应用凝胶做支持物可以成功地对成熟RGCs进行三维培养,BDNF/GDNF可以明显地促进神经节细胞的神经突起再生。     

体外无血清培养新生SD大鼠视网膜神经细胞

目的 采用无血清培养建立新生SD大鼠视网膜神经细胞的体外培养方法,为视网膜神经细胞的体外实验研究奠定基础.方法 取出生后3～5d的SD大鼠视网膜,用胰蛋白酶消化分离获取细胞悬液,使用无血清神经原培养基(Neurobasal TM-A Medium)和添加剂B-27 Supplement Minus AO进行培养.倒置相差显微镜观察细胞形态及轴突生长情况.培养至第5天,用抗微管相关蛋白2抗体、抗视紫红质蛋白抗体及抗胶质纤维酸性蛋白抗体,行免疫细胞化学鉴定并计算视网膜视杆细胞的纯度.结果 采用无血清法培养的视网膜神经细胞生长良好,细胞伸出突起,部分神经元的突起交织呈网状.生长至第5天经免疫细胞化学证实其中神经元细胞占95.6％,而38.6％为视网膜视杆细胞,同时神经胶质细胞的生长得到了很好地抑制.结论 无血清培养法可以获取纯度较高的视网膜神经细胞,为研究视网膜光感受器细胞提供了理想的体外实验模型.     

腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细转染的实验研究

目的 评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adenoassociated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGCs)的转染效率和安全性.方法 取出生24 h内的SD乳鼠的视网膜神经上皮层,行视网膜神经细胞的体外混合培养;培养2 d后,按转染倍数(multiple on infection,MOI)为10、102、103、104、105对细胞进行转染;5 d后行流式细胞仪检测细胞表达绿荧光的比率,并应用PE-Thy1.1抗体标记RGCs,评价不同MOI的rAAV-GFP对RGCs的转染效率.应用MTT比色方法检测各组细胞的生长活性.结果 MOI为10、102、103、104、105时,对混合培养的全体细胞的转染效率分别为6.4%、15.6%、20.2%、45.1%和65.8%,其中对RGCs的转染效率分别为11.7%、22.5%、27.7%、52.0%和75.3%;rAAV-GFP转染RGCs后,细胞生长状态正常;MTT比色结果显示,各转染细胞和未转染细胞的光吸收值无显著性差异(P＞0.05).结论 rAAV作为体外培养的SD乳鼠RGCs转染的载体是安全可行的,且对细胞生长无明显影响.     

腺伴随病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养的鼠视网膜神经节细胞转染的实验研究

目的评价重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(recombinant adeno-associated virus-mediated green fluorescence protein,rAAV-GFP)对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells ,RGCs)的转染效率和安全性。方法取出生24 h内的SD乳鼠的视网膜神经上皮层,行视网膜神经细胞的体外混合培养;培养2 d后,按转染倍数(multiple oninfection,MOI)为10、102、103、104、105对细胞进行转染;5 d后行流式细胞仪检测细胞表达绿荧光的比率,并应用PE-Thy1 .1抗体标记RGCs ,评价不同MOI的rAAV-GFP对RGCs的转染效率。应用MTT比色方法检测各组细胞的生长活性。结果MOI为10、102、103、104、105时,对混合培养的全体细胞的转染效率分别为6·4 %、15.6 %、20.2 %、45.1 %和65.8 %,其中对RGCs的转染效率分别为11.7 %、22.5 %、27.7 %、52.0 %和75.3 %;rAAV-GFP转染RGCs后,细胞生长状态正常;MTT比色结果显示,各转染细胞和未转染细胞的光吸收值无显著性差异(P>0 .05)。结论 rAAV作为体外培养的SD乳鼠RGCs转染的载体是安全可行的,且对细胞生长无明显影响。     

CD81在正常大鼠神经视网膜上的表达

目的 观察CD81在正常大鼠神经视网膜上的表达.方法 用抗CD81抗体对正常大鼠视网膜组织进行免疫组织化学染色,并对神经视网膜进行Western blot分析,同时用细胞免疫组织化学染色法检测体外培养视网膜神经胶质细胞的CD81表达.结果 大鼠视网膜神经节细胞层、内丛状层和外丛状层呈阳性网状致密染色;Western blot分析神经视网膜层出现CD81阳性条带;体外培养的大鼠视网膜神经胶质细胞也呈CD81阳性表达.结论 正常大鼠的神经视网膜表达CD81,视网膜神经胶质细胞是表达CD81的一种细胞类型.     

新生SD大鼠视网膜神经节细胞体外原代培养

目的:建立简便易行的新生SD大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)体外原代培养方法。方法:取出生后24h的SD大鼠视网膜,胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,接种于多聚赖氨酸包被的预先置入盖玻片的24孔培养板中培养,倒置相差显微镜观察细胞生长规律,使用Thy-1mAb免疫细胞化学法鉴定RGCs。结果:该方法培养的RGCs体外存活时间可达5d,免疫细胞化学法显示RGCs的纯度约为80%。结论:使用不添加附加成分的普通培养液SD大鼠RGCs体外培养成功,且RGCs较纯化,是一种较理想的细胞培养实验模型。     

胚胎与成人视网膜神经细胞培养

目的 建立胚胎及成人视网膜神经细胞体外培养系统，为视网膜神经细胞的基础研究与药物开发提供实验模型。 方法 10～13周龄胎儿及20～40岁成人视网膜神经层用不同的酶进行消化，分散的细胞接种于预先经过包被的细胞培养盘内，加入或不加入表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)、神经营养素 4(neurotrophic-4，NT-4)等培养。通过BrdU掺入、免疫组织化学及免疫荧光等方法检测培养细胞增殖并辨别细胞成分。 结果 胚胎及成人视网膜细胞可在体外连续培养100及180 d以上。加入EGF、FGF、BDNF或NT-4可明显促进胚胎与成人视网膜神经元存活，胎儿视网膜细胞增殖。与对照组相比，处理组神经元或神经节细胞的百分率较高。 结论 胚胎及成人视网膜神经细胞培养技术为视网膜神经细胞基础研究及药物开发提供了一种十分有价值的手段，加入外源性的生长因子可促进培养的视网膜神经细胞存活、增殖与分化。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 279-282)     

GDNF家族成员artemin在大鼠视网膜神经节细胞中的表达及其功能

目的观察胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）家族成员artemin在正常大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）中的分布、表达及其功能。方法体外培养出生1～3d SD乳鼠的视网膜神经上皮细胞,免疫荧光染色检测RGCs中artemin的定位及表达,实时定量聚合酶链反应（real—time PCR）对RGCs中artemin进行定量检测。并用40mmol／L葡萄糖处理细胞12h后,再进行上述检测,观察高糖对于RGCs中artemin表达的影响。结果免疫荧光的结果证实了培养的RGCs出现Thy1．1抗体阳性的红色荧光,且多重荧光标记显示RGCs同时存在显示绿色荧光的artelnin抗体和红色荧光的Thy1．1抗体,表明artemin在RGCs中有分布。正常对照组中Thy1．1抗体阳性的细胞为（442±9）个／高倍视野,而40mmol／L高糖培养组中为（263±7）个／高倍视野,差异有统计学意义（P〈0．05）。Real—time PCR对大鼠RGCs中artemin的mRNA水平进行定量分析,40mmol／L葡萄糖处理视网膜神经细胞12h后,artemin在视网膜神经细胞及RGCs的表达明显下降（P〈0．05）。结论研究发现在原代培养的大鼠视网膜神经细胞及RGCs巾均有artemin的表达,并且在高糖作用下表达下降,为进一步研究artemin对受损RGCs的保护作用提供了思路。     

实验动物视网膜神经节细胞的定量研究方法

尼氏染色、逆行标记和免疫标记是目前对视网膜神经节细胞(RGCs)进行定量研究的基本方法。尼氏染色是用碱性染料与神经元细胞内的尼氏体结合,使RGCs染色,并行计数,记数时需要排除非神经元的干扰。逆行标记是将荧光染液注射或贴附到上丘、外侧膝状体或视神经,染液通过神经元细胞轴突内的逆行轴浆运输,向视网膜神经节细胞的胞体内移行,并使其染色。免疫标记是使用特异性的Brn-3b或者Thy-1抗体与视网膜神经节细胞上的抗原结合标记,再行染色和计数。本文综述尼氏染色,逆行标记及免疫标记3种方法对RGCs进行定量计数的研究进展。     

单纯疱疹性角膜炎几种常用辅助诊断方法的比较

目的 比较常用的3种检测单纯疱疹性角膜炎(HSK)辅助诊断方法的敏感性和临床实用性。方法6只新西兰白兔双眼接种1×105PFU单纯疱疹病毒I型(HSV-I)McKrea株。病毒接种后第8天应用无环鸟苷眼膏每2 h 1次,共4次。另外2只兔中1只兔双眼在角膜上划痕但不接种病毒,另1只兔双眼角膜接种曲霉菌作为阴性对照。在病毒接种后的3、9、21天,利用病毒分离、多聚酶链反应(PCR)和蛋白吸附膜快速单纯疱疹病毒I型抗原检测方法进行检测。结果 接种后第2天全部角膜出现典型的HSK点状或树枝状浸润,第5天出现地图状溃疡,第21天仍有2只角膜有持续性感染。抗病毒治疗1天后无明显好转。2只兔于接种后14和16天死亡。病毒分离方法只有接种后3天的泪液培养阳性,第9、21天的标本检测均为阴性。有11/12、11/12和6/8只角膜在接种后的第3、9、21天用PCR方法检测到了HSV-I DNA。蛋白吸附膜抗原检测在接种后的第3、9、21天的阳性率分别为12/12、12/12和3/8。结论 蛋白吸附膜快速HSV—I检测是一种快速、简便、经济的方法。其阳性结果与临床表现相吻合。     

Anterior chamber-associated immune deviation: a review of the anatomical evidence for the afferent arm of this unusual experimental model of ocular immune responses

Anterior chamber-associated immune deviation (ACAID) is an animal model of tolerance induced experimentally by the injection of antigen into the anterior chamber of the eye. The unusual deviant immune response has both afferent and efferent arms and it is the former that is the focus of this review. The paradigm states that antigen injected into the anterior chamber of the eye is internalized by intraocular antigen presenting cells (APCs) which then migrate largely to the spleen to induce the differentiation of regulatory T cell populations which in turn form the basis of the modified efferent arm to the deviant immune response. However, the migration routes of ocular APCs or free antigen to the secondary lymphoid organs remain unclear. In this review we will discuss the evidence for different possible afferent routes by which antigen (either free or cell-associated) leaves the eye and the pattern of distribution to secondary lymphoid organs.     

翼状胬肉中增殖细胞核抗原的免疫组化研究

目的　观察翼状胬肉的增殖状况及用药后的变化。方法　将５４ 例翼状胬肉术前患者随机分为３ 组：Ⅰ组１８ 例为未用药组,Ⅱ组１６ 例术前局部应用氟美松,Ⅲ组２０ 例术前局部应用高三尖杉酯碱加氟美松。采用免疫组化方法对手术切除的翼状胬肉标本进行增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ,ＰＣＮＡ） 检测。结果　未用药组（ Ⅰ组）ＰＣＮＡ 阳性率为（１１５３ ±３６２）％ ,氟美松组（ Ⅱ组） 为（１０２８ ±４１８）％ （ Ｐ＞ ００５） ,高三尖杉酯碱加氟美松组（ Ⅲ组） 为（５５９±３８２） ％ （ Ｐ＜ ００１） 。＜ ６０ 岁的进行型患者ＰＣＮＡ阳性率高于≥６０ 岁的静止型患者。结论　翼状胬肉组织中存在细胞增殖及ＰＣＮＡ表达,术前应用高三尖杉酯碱加氟美松可抑制ＰＣＮＡ 表达及术后翼状胬肉的复发,而术前应用氟美松对ＰＣＮＡ的表达则无影响     

Vogt-小柳原田综合征与HLA-DR4、DRw53相关的研究

目的 探讨ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲｗ５３抗原与Ｖｏｇｔ－小柳原田综合征的相关性。方法 用聚合酶链反应一系列引物对对６１例Ｖｏｇｔ－小柳原田综合征和１０２例健康人进行ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲｗ５３分型,结果：患者ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲｗ５３阳性率分别为４５．９０％和６２．２９％,正常对照组阳性率则分别为１４．７１％和３８．２４％,患者与正常对照组之间差异有显著性意义（Ｐ〈０．０５）。结     

Immunodiagnosis of ocular chlamydial infection

The diagnostic roles of enzyme immunoassay and indirect immunofluorescence tests were studied in 99 patients with various grades of active trachoma and in 72 patients with inactive trachoma. Normal invididuals and patients with non-specific chronic conjunctivitis were used as a control group. Chlamydial antigens were detected in the conjunctival swabs from a large proportion of patients with severe or moderate trachoma. Cases with antigen-negative but clinically severe trachoma showed presence of specific IgG in the blood, thus indicating that serological tests may complement the ELISA test for the detection of chlamydia in infected tissues. The nature of cellular reaction in the conjunctiva seems to be related to the severity of trachoma and presence of the infective organism. Antigen-negative trachoma thus represents either an error of diagnosis or limited sensitivity of currently available immunologic techniques, or a predominantly hypersensitivity state triggered by transient tissue parasitism. Recombinant DNA technology and chronobiologic study of infiltrating lymphocytes are likely to provide some insight in such cases.     

HLA-B27抗原与前葡萄膜炎的相关性及其临床意义

探讨ＨＬＡ－Ｂ２７抗原与前葡萄膜炎的相关性及可能的意义。方法用多聚酶链反应（ＰＣＲ）和微量淋巴细胞毒试验对２０例伴有关节强直性脊椎炎（ＡＳ）的急性前葡萄膜炎（ＡＡＵ）、６７例ＡＡＵ、７０例慢性前葡萄膜炎和７０８个健康人进行ＨＬＡ－Ｂ２７分型。结果ＡＳ伴有ＡＡＵ和单纯的ＡＡＵ患者ＨＬＡ－Ｂ２７阳性率分别为７０％和４９．２５％,显著高于对照组（２．９７％,Ｐ〈０．００１）,慢性前葡萄膜炎患者中ＨＬＡ－     

Langerhans Cells of the Ocular Surface

Recent evidence has been collected by several investigators defining a distinct population of dendritic cells (Langerhans cells) of mesenchymal origin residing in the epidermal surfaces of many mammalian species. These cells play a dominant role in the processing of antigens presented through cutaneous surfaces and carry a Class II histocompatability antigen felt to be of central importance in the afferent arm of allograft rejection. They also possess many of the characteristics of macrophages active in the efferent arm of immunologic responses. An equivalent subset of dendritic cells (Langerhans cells) in ocular surface epithelium of the human, mouse, rat, and guinea pig has been identified by enzyme histochemistry, immunofluorescence, and electron microscopy. Ocular surface Langerhans cells proliferate in the setting of corneal inflammation (remote and recent) and are depleted by topical and systemic corticosteroids. Ocular surface Langerhans cells may play a central role in ocular contact hypersensitivity, corneal allograft rejection, and ocular surface immune surveillance.     

The role of CEA in eye cancer

CEA is expected to be of some assistance in malignancy diagnosis in eye tumour patients. It should be proven whether or not the CEA levels in malignant eye tumours are higher than those in benign eye tumours. Furthermore, the threshold values of the CEA levels must be determined by means of estimating its sensitivity and specificity values in order to differentiate between a benign tumour and a malignant tumour.

Samples of blood serum were taken from eye tumour patients at our clinic in 1990 and 1992 respectively, and the CEA level examination was carried out with radioimmunoassay technique. The measurement of malignant and benign tumours from the tissue obtained after the surgery was based on the results of histopathological examination.

The CEA level in 53 samples of blood serum, which were taken from 28 patients with benign tumours and from 25 patients with malignant tumours suggested: (a) that the mean CEA level in the group of malignant tumours is significantly higher than that in the group of benign tumours, that is, 4.982 ng/ml vs 2.961 ng/ml with a p value of 0.009 or P & <0.05, (b) that the CEA level which is employed as the threshold to distinguish between malignant and benign tumours is 3.5 ng/ml, with the sensitivity value of 60% and the specificity value of 64.3%.

It is concluded that CEA can be used as a supportive diagnostic aid in eye cancer.     

口服免疫耐受与眼部免疫性疾病的治疗

口服免疫耐受是通过口服抗原后引起机体对该抗原不产生或产生低免疫反应的一种特异性无应答状态。口服耐受的机制尚未完全明了 ,可能与克隆清除、克隆无能、克隆忽视、抗独特型抗体或抑制细胞有关。近年来应用口服耐受机制已成功地用于治疗多种自身免疫性疾病 ,由于无毒副作用 ,为一些自身免疫性疾病的治疗带来了希望。