利用膜片钳技术对急性分离小鼠螺旋神经节神经元的电生理研究

目的 探讨小鼠螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons SGN)的电生理特性。方法 应用全细胞电压钳技术对急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞膜上的离子通道电流进行记录和分析。结果 在SGN细胞膜上记录到对氯化四乙胺、4-氨基吡啶敏感的外向延迟整流钾电流和瞬时钾电流,以及对河豚毒素敏感的内向钠电流。并且离子通道活动具有明显的电压依赖性,在没有记录到钠电流的细胞记录到延迟整流钾电流。结论 急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞的电生理特性可为听觉传导机制的研究提供了重要的参考,并指导下一步通道药理学的研究。     

利用膜片钳技术对急性分离小鼠螺旋神经节神经元的电生理研究

目的 探讨小鼠螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons，SGN)的电生理特性。方法 应用全细胞电压钳技术对急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞膜上的离子通道电流进行记录和分析。结果 在SGN细胞膜上记录到对氯化四乙胺、4-氨基吡啶敏感的外向延迟整流钾电流和瞬时钾电流，以及对河豚毒素敏感的内向钠电流。并且离子通道活动具有明显的电压依赖性，在没有记录到钠电流的细胞记录到延迟整流钾电流。结论 急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞的电生理特性可为听觉传导机制的研究提供了重要的参考，并指导下一步通道药理学的研究。     

硫酸庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响

为观察硫酸庆大霉素对培养的小鼠耳蜗螺旋神经节细胞（SGC）的细胞生存数和细胞突起长度的影响，在单离培养的出生1～5d的NIH小鼠SGC培养液中，加入不同浓度的硫酸庆大霉素（25，50，100mg／L）。培养14d后，标本用4％多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色，在光镜下计数SGC生存数，目镜测微尺下测量细胞突起长度。结果显示，实验组与对照组间、不同浓度实验组间的细胞生存数及细胞突起长度无明显差异（P＞0．05）。提示硫酸庆大霉素对小鼠耳蜗SGC的生存和生长无明显影响，氨基糖甙类抗生素对SGC的影响可能是继发性的。     

小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育

目的研究小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育,探讨螺旋神经节神经元的发育成熟过程。方法应用透射电镜观察３２只１～６０天龄小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育。结果新生小鼠螺旋神经节神经元为形态相同的幼稚细胞,由卫星细胞及其伸出的单层突起包绕,无致密髓鞘形成;出生后７天,Ｉ型神经元出现,Ｉ型神经元局部致密髓鞘开始形成;出生后１０～１４天,Ｉ型神经元多层致密髓鞘出现;出生后３０天,可见一种细胞形态和Ｉ型神经元相似而有明显致密髓鞘的神经元;出生后６０天,螺旋神经节神经元髓鞘基本发育成熟。螺旋神经节神经元的发育成熟由底回向顶回逐步发展。结论出生后７～１４天是螺旋神经节神经元发育和成熟的重要阶段。     

螺旋神经节神经元原代培养及其免疫细胞化学鉴定

目的 建立成体哺乳动物耳蜗螺旋神经节神经元（ＳＧＮ）体外培养的细胞模型。方法 对出生后７ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠的螺旋神经节细胞进行解离与分散培养。用荧光显微镜与倒置相差显微镜观察原代培养ＳＧＮ细胞的活力以及生长与分化过程。应用链霉卵白素过氧化物酶（ＳＰ）方法和抗神经丝蛋白单克隆抗体（ＮＦＰ－ＭｃＡｂ）对ＳＧＮ进行免疫细胞化学染色鉴定。结果 幼龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠的ＳＧＮ在体外条件下，可良好存活并有正常     

耳蜗螺旋神经节细胞的电生理实验研究现状

耳蜗螺旋神经节细胞(spiral gaaglion cell，SGC)，可将毛细胞的信号传向听觉中枢，在听觉信息的传导中起着极其重要的作用。目前，应用全细胞记录膜片钳技术，证实了SGC细胞膜上可表达多种离子通道，如电压门控离子通道，ATP控制的离子通道，神经递质受体介导的离子通道等，而各种病理状态下的SGC均伴有某些特定离子通道的电变化。对这些电变化的研究，将为我们在细胞和分子水平上诊断和治疗许多由内耳疾病所导致的耳聋和听力障碍提供可能。     

电刺激螺旋神经节细胞的形态学研究

为定量确定刺激螺旋神经节神经元的电流强度的安全范围，利用图象分析仪测量不同电流强度刺激下兔螺旋神经节经（ＳＧＮ）面积、周长、直径和体积的变化，发现ＳＧＮ形态各主要参数对０．４～１．２ｍＡ电流有显著改变，对０．１ｍＡ电流的变化则不显著，与正常组和对照组（药毒致聋组）比较无显著性差异。     

应用膜片钳技术对螺旋神经元放电类型的初步研究

目的：研究原代培养新生鼠螺旋神经元的放电类型。方法：应用膜片钳技术全细胞构型从原代培养的螺旋神经元获得电流钳记录。结果：从螺旋神经元记录到动作电位，螺旋神经元具有不一致的放电特征。结论：螺旋神经元具有快适应和慢适应两种放电特征，多数神经元为快适应神经元。     

庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤机制初步研究

目的探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion cell,SGC）的损伤机制。方法取出生后2～6天昆明种乳小鼠耳蜗,利用酶消化和机械分离相结合的方法分离出SGC,并进行体外培养。将培养4天的SGC用4%多聚甲醛室温固定30min,以小鼠源神经纤维细丝蛋白（Neurofilament-68/200kDa,NF-L＋H）单克隆抗体作为一抗,按照SP法（streptavidin-perosidase法,链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）对所培养细胞进行免疫细胞化学染色,对SGC作出鉴定。将培养第4天的细胞分为4组：空白对照组及3种浓度的庆大霉素干预组（庆大霉素终浓度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L）,作用48h后收集各组细胞进行透射电镜分析。结果SGC原代培养获得成功,经NF-L＋H抗体免疫细胞化学染色,其胞质及突起均呈阳性反应,染成棕黄色,一般有相对生长的两个突起,为典型的双极神经元。在透射电镜下观察SGC超微结构,3种浓度的庆大霉素组SGC与空白对照组相比,均出现明显的形态学改变,这种改变与凋亡相关。结论庆大霉素对小鼠耳蜗SGC有直接毒性作用,可导致细胞凋亡,线粒体损伤在这一过程中可能具有重要意义。     

对灰鼠延迟性神经元死亡模型中螺旋神经节细胞缺损的评估

目的探索观察耳蜗螺旋神经节细胞的简便定量研究方法 ,并在灰鼠延迟性螺旋神经节细胞死亡动物模型中验证本方法的实用性和可靠性。方法 15只成年灰鼠平均分为3组,第1组用于正常对照;第2组一次性同时肌肉注射庆大霉素（125mg/kg）和静脉注射利尿酸钠（40mg/kg）,并在用药后2个月处死;第3组接受与第2组同样的药物注射,但在用药后4个月处死。耳蜗样品被常规应用环氧树脂包埋并制作成耳蜗中轴半薄切片,计数耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节数量并进行统计分析。结果灰鼠耳蜗底回起始端的蜗轴螺旋管腔比耳蜗底回中部和耳蜗中回大,因此耳蜗底回起始端蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞数量多于耳蜗底回中部和耳蜗中回。耳蜗毛细胞被彻底破坏后2个月,与正常灰鼠耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量相比,耳蜗底回蜗轴螺旋管切片截面内的螺旋神经节细胞减少数量比耳蜗中回严重,提示延迟性螺旋神经节细胞死亡可能遵循着从耳蜗底回向顶回扩展的规律。耳蜗毛细胞被彻底破坏后4个月,全耳蜗蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞基本上丧失殆尽。结论计数耳蜗中轴切片各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量是一种简便可靠的定量分析方法 。     

顺铂致豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3活化的研究

目的：探讨顺铂的耳毒性作用与螺旋神经节细胞（sprial glanglion cell,SGC)凋亡的关系，及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase-3信号转导有关。方法：取40只听力正常的豚鼠，随机分为顺铂1、2、4天组和对照组，每天检测听性脑干反应（ABR）和40Hz相关电位以观察豚鼠高，低频的听阈变化，并用TNEL法检测凋亡细胞数量变化，免疫组化检测SGC中Caspase-3p20活性片段的表达。结果：随着注射顺铂时间的延长，豚鼠听力逐渐下降，同时SGC的TUNEL染色明显增强，Caspase-3p20活性片段的表达增高，与对照组比较均有显著性差异（P＜0．01），结论：顺铂的耳毒性损害机制与SGC的凋亡有关；顺铂所致的SGC凋亡过程中有Caspase-3p20的激活。     

水杨酸钠诱导大鼠螺旋神经节细胞发生程序性坏死的研究

目的 探讨受体相互作用蛋白激酶-1(receptor-interacting protein kinase1,RIPK1)/受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)/混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain...     

银杏叶提取物对噪声致大鼠螺旋神经节损伤的保护作用

目的探讨银杏叶提取物对大鼠噪声暴露后螺旋神经节损伤的保护作用。方法将36只SD大鼠分为三组：正常对照组（正常组）、生理盐水＋噪声暴露组（噪声组）、银杏叶提取物＋噪声暴露组（用药组）,每组12只。后两组大鼠每天暴露于110dBSPL白噪声中6h,连续10天,且于噪声暴露开始每天分别腹腔注射生理盐水和银杏叶提取物10ml/d。所有大鼠均于实验前和实验第10天检测听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）,并于第二次测试ABR后处死动物,检测耳蜗组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量,并用透射电镜观察耳蜗螺旋神经节细胞的超微结构变化。结果实验后噪声组和用药组的ABR阈值均高于正常组,但用药组显著低于噪声组,差异有统计学意义;用药组SOD活性较噪声组明显增加、MDA含量较噪声组显著降低,差异有统计学意义;用药组耳蜗螺旋神经节损害明显轻于噪声组。结论银杏叶提取物对大鼠噪声暴露后螺旋神经节细胞的损害具有保护作用。     

顺铂对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响

目的探讨耳毒性药物顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响,了解顺铂耳毒性的离子机制。方法选择状态良好培养2—14d的耳蜗螺旋神经节细胞在电压钳制条件下记录的钾电流作为对照组,浴液中分别加入100,500,1000,5000μM不同浓度的顺铂溶液后记录的电流为实验组,观察其对钾通道电流电生理学特性的影响,并观察冲洗后电流的恢复情况。结果实验显示耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性受不同浓度顺铂溶液的影响,并具有浓度依赖性,表现在其活化动力学和电流幅度的改变。本实验中顺铂的50％的电流被抑制时的浓度（IC50）为294μM,冲洗后钾通道电流逐渐恢复。结论顺铂可以改变耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性,这种变化在短期内可逆,揭示其耳毒性的形成具有一定的离子机制。     

应用LsAB技术显示五羟色胺受体亚型1A在小鼠螺旋神经元上的分布

目的显示五羟色胺（serotonin,5-HT）受体亚型1A在螺旋神经元上的分布。方法采用出生后3～6天的乳小鼠耳蜗进行冰冻切片,应用酶标链亲和素-生物素（labeled streptavidin-biolin technique,LsAB）技术显示五羟色胺受体亚型1A在螺旋神经元上的分布。结果实验组的乳鼠耳蜗螺旋神经元的细胞膜显示阳性信号,阴性对照组的乳鼠耳蜗螺旋神经元的细胞膜上未发现阳性信号。结论五羟色胺受体亚型1A存在于耳蜗螺旋神经元的细胞膜上,推测当毛细胞释放兴奋性神经递质引起螺旋神经元兴奋时,五羟色胺作为神经递质对螺旋神经元的听觉传导活动起着重要的调节作用。     

特异性损伤内耳螺旋神经元小鼠模型的建立

目的：建立小鼠内耳螺旋神经元损伤的耳聋模型,为研究干细胞移植治疗感音神经性聋奠定基础。方法成年雌性SPF级CBA／J小鼠60只,随机分为实验组和生理盐水组,每组30只,实验组动物经圆窗渗透给予10μl哇巴因（ouabain）,生理盐水组同法给予等量生理盐水。每组于给药前及给药后7、14及30天分别检测小鼠听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）,并用免疫组织荧光技术和基底膜铺片技术分别观察耳蜗螺旋神经元（spiral ganglion neurons ,SGNs）细胞及内耳毛细胞（hair cells ,HCs）的变化。结果①与生理盐水组比较,实验组给药后各时间点 ABR反应阈均明显升高,波Ⅰ潜伏期延长,振幅明显降低,差异有统计学意义（ P＜0．05）。②实验组及生理盐水组小鼠DPOAE均可正常引出。③与生理盐水组相比,实验组耳蜗各回螺旋神经元的数量及密度显著降低,差异有统计学意义（P＜0．05）。④实验组在给药后不同时间点,耳蜗各回内、外毛细胞均排列整齐、形态完整、未见明显损伤或丢失。结论哇巴因经圆窗渗透给药可特异性损伤CBA／J小鼠内耳螺旋神经元及其功能,而不损伤内、外毛细胞,是一种理想的研究干细胞移植治疗感音神经性聋的动物模型。     

脑源性神经营养因子基因修饰骨髓基质细胞对体外培养小鼠螺旋神经元的影响

目的探讨人脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因工程细胞的建立及其对体外培养的小鼠螺旋神经元生长活性的影响。方法参照分子克隆技术成功构建BDNF真核表达载体———pcD-NA3.1(-)-BDNF,体外证实BDNF基因转染猿猴病毒40肝脏转化细胞(COS7)后正常表达,将骨髓基质细胞分离培养,体外转染骨髓基质细胞建立BDNF基因工程细胞,观察该基因工程细胞对体外培养小鼠螺旋神经元的生长活性的影响。结果成功构建BDNF基因真核表达载体,并且建立了BDNF基因工程细胞;在体外BDNF基因工程细胞能促进螺旋神经元的生长,并保护螺旋神经元免受氧化损伤。结论建立的BDNF基因修饰的骨髓基质细胞,对体外螺旋神经元生长、生存起着重要的保护作用,为进一步研究基因修饰的骨髓基质细胞内耳移植奠定了重要的基础。     

I h and HCN Channels in Murine Spiral Ganglion Neurons: Tonotopic Variation,Local Heterogeneity,and Kinetic Model

One of the major contributors to the response profile of neurons in the auditory pathways is the I _h current. Its properties such as magnitude, activation, and kinetics not only vary among different types of neurons (Banks et al., J Neurophysiol 70:1420–1432, 1993; Fu et al., J Neurophysiol 78:2235–2245, 1997; Bal and Oertel, J Neurophysiol 84:806–817, 2000; Cao and Oertel, J Neurophysiol 94:821–832, 2005; Rodrigues and Oertel, J Neurophysiol 95:76–87, 2006; Yi et al., J Neurophysiol 103:2532–2543, 2010), but they also display notable diversity in a single population of spiral ganglion neurons (Mo and Davis, J Neurophysiol 78:3019–3027, 1997), the first neural element in the auditory periphery. In this study, we found from somatic recordings that part of the heterogeneity can be attributed to variation along the tonotopic axis because I _h in the apical neurons have more positive half-activation voltage levels than basal neurons. Even within a single cochlear region, however, I _h current properties are not uniform. To account for this heterogeneity, we provide immunocytochemical evidence for variance in the intracellular density of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel α-subunit 1 (HCN1), which mediates I _h current. We also observed different combinations of HCN1 and HCN4 α-subunits from cell to cell. Lastly, based on the physiological data, we performed kinetic analysis for the I _h current and generated a mathematical model to better understand varied I _h on spiral ganglion function. Regardless of whether I _h currents are recorded at the nerve terminals (Yi et al., J Neurophysiol 103:2532-2543, 2010) or at the somata of spiral ganglion neurons, they have comparable mean half-activation voltage and induce similar resting membrane potential changes, and thus our model may also provide insights into the impact of I _h on synaptic physiology.