噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎表面抗原单链抗体库

[目的]应用噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)单链抗体(ScFv)库。[方法]提取经免疫具有乙肝表面抗体的正常人淋巴细胞总RNA,采用反转录、触减PCR扩增人免疫球蛋白G(IgG)重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),用Linker连接肽经重叠PCR将VH和VL基因连接成VH-Linker-VL形式的ScFv基因。将ScFv与pCANTAB-5E载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成全套人源性抗HBsAg ScFv库。[结果]成功构建了人源性抗HBsAg噬菌体ScFv库。[结论]人源性HBsAg噬菌体ScFv库的构建,为进一步筛选特异性高,具有治疗作用的乙肝抗体奠定基础。     

人源性老年痴呆单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性老年痴呆(AD)单链噬菌体抗体库,为进一步筛选AD相关抗原的人源性抗体奠定基础.方法 从200 ml AD病人的外周血中分离B淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成总cDNA.以PCR技术,利用特定的引物分别扩增出人抗体的重链和轻链可变区基因片段(VH、VL),并分别克隆入噬菌粒pDAN5中,构建出含人单链抗体可变区(scFv)基因序列的pDAN5克隆载体,电转化感受态大肠杆菌XLI-Blue后,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建成初级噬菌体抗体库.从抗体库中随机挑选数个克隆,提取质粒,PCR扩增目的片段后,用内切酶BstN Ⅰ消化,每个克隆经消化后的DNA指纹印迹用琼脂糖凝胶电泳分析,评价抗体库的多样性.结果 所有抗体VH和VL基因片段均得到了扩增并成功克隆及转化,经辅助噬菌体感染后,构建成初级抗体库.BstN Ⅰ消化后的DNA指纹图谱显示各克隆抗体基因各不相同,经计算构建的噬菌体抗体库容量为1.5×106.结论 利用噬菌体抗体库技术成功构建了AD病人的单链可变区噬菌体抗体库.     

人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抗体库的构建及临床价值

目的筛选出抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa自身抗体,用噬菌体表面展示技术构建人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa单链噬菌体抗体(ScFv)库。方法用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)技术和血小板聚集试验筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗体的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者。从筛选出患者的外周血淋巴细胞中提取mRNA,用RT PCR扩增出人免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片断,用DNA linker将VH和VL连接成ScFv基因片断。用限制性内切酶SfiⅠ/NotⅠ酶切ScFv后克隆到噬菌体载体pHEN2,然后转化大肠杆菌TG1。用辅助噬菌体M13K07援救转化后的TG1,产生ScFv。结果95例慢性ITP患者中41例(43.2%)血浆中抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体阳性,强阳性患者5例(5.3%)。2例(2.1%)明显抑制血小板聚集功能。扩增出380～400bp大小的VH和VL基因,用连接肽(Gly4Ser)3成功地连接成约780bp大小的ScFv片断。ScFv克隆到pHEN2并转化大肠杆菌TG1后,形成2.1×107个克隆。用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的噬菌体抗体库滴度为1.62×1010cfu/ml。结论少数抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体可抑制血小板聚集功能。用噬菌体表面展示技术构建了ScFv库,可用来筛选人源化抗血小板GPⅡb/ⅢaScFv。     

人源性阿尔茨海默病噬菌体单链抗体库的构建

目的构建人源性阿尔茨海默病(AD)噬菌体单链抗体(scFv)库,为筛选β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的人源性特异性抗体奠定基础。方法采集18例AD患者的外周血40ml,提取总RNA,应用RT-PCR法得到人抗体可变区重链(VH)和可变区轻链(VL)基因。将VH和VL由连接肽连接得到scFv片段,将所得片段双酶切后,克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,大肠埃希菌TG1感受态细胞经电击转化,辅助噬菌体M13K07拯救后构建scFv型噬菌体抗体库。结果总RNA经逆转录PCR扩增VH和VL可变区基因的凝胶电泳显示,PCR产物长度分别为360bp和300bp,其连接形成的scFv片段长度为750bp,最终构建了库容为2.4×109的scFv库。BstNⅠ酶切鉴定构建的scFv库,经凝胶电泳可见,酶切片段长度差异性大,显示scFv库具有良好的多样性。结论成功构建人源性AD噬菌体scFv库,为进一步筛选Aβ特异性抗体,继而为AD的治疗研究奠定基础。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的 构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库.方法 分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA.用相应引物进行PCR,扩增出轻链和重链Fd段基因,经酶切后分别和噬粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XLl-Blue菌株.将轻链和重链Fd基因先后克隆人pComb3中.结果 从分离出的淋巴细胞中提取到高质量RNA,RT-PCR分别扩增出约680 bp大小的κ、λ和Fd基因.PCR 产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,轻链K、κ、λ和重链Fd基因均插入pComb3的重组率为50%.结论 构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,为筛选大肠癌相关抗体打下基础.     

抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体的构建及表达

目的　用基因工程抗体技术构建抗日本血吸虫膜蛋白特异的单链抗体。　方法　用抗体框架区的通用引物 PCR扩增抗日本血吸虫膜蛋白特异性单克隆抗体 NP11- 4的 VH 及 VL 基因 ,测序分析其核苷酸序列。用VH 和 VL 基因在 p THA90质粒载体中构建成单链抗体基因并诱导表达。　结果　扩增获得 NP11- 4的 VH 和 VL基因 ,经测序分析确定为新发现的抗体可变区序列 ,构建成排列顺序为 VH- linker- VL 的单链抗体基因 ,经诱导表达出与硫氧环蛋白融合的单链抗体 ,大小约为 36 .2 k Da,以包涵体形式存在。　结论　成功地构建和表达了抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体。     

PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体基因的构建和表达

目的　构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体 (scFv)基因。　方法　通过PCR方法体外扩增并经测序验证的重链、轻链可变区 (VH、VL)基因先后重组入原核表达质粒 pTHA90相应的位点上 ,中间通过一连接肽 (Gly4 Ser) 3基因连接构建成单链抗体基因 (scFv) ,连接产物转化相应受体菌Top1 0 ,提取质粒 ,酶切鉴定重组克隆。表达产物经ELISA方法测定活性。　结果　重组克隆经酶切鉴定可见预期大小的片段 ,表明重组成功。表达产物经ELISA检测 ,OD4 92 值为 1 .0 6 ,高于阴性对照 3倍以上 ,证实具有与相应抗原结合的能力。　结论　成功地构建了scFv基因 ,且其表达产物保留了抗体的亲和性和特异性     

抗SSA噬菌体抗体库的构建及鉴定

目的　用噬菌体展示技术构建抗SSA单链抗体库。方法　分离抗SSA抗体阳性病人外周血单个核细胞 ,提取RNA并反转录cDNA。扩增免疫球蛋白重链可变区 (VH)和κ链可变区(Vκ)。通过重叠聚合酶链反应 (PCR)用连接片段将VH和Vκ体外连接成单链抗体 (single chainFv ,scFv)基因。而后用SfiⅠ和NotⅠ酶切并与噬菌粒 pHEN2 连接 ;将 pHEN2 scFv电转至大肠杆菌TG1,建立抗SSAscFvcDNA库。随机挑选克隆用PCR扩增插入片段了解插入效率。用辅助噬菌体VCS M13感染含 pHEN2 scFv的TG1,产生scFv噬菌体抗体。用酶联免疫吸附 (ELISA)检测构建的scFv噬菌体抗体库中有无抗SSA抗体存在。结果　与VH和Vκ支架结构互补的引物可扩增出 30 0～ 4 0 0bp大小VH和Vκ片断 ;重叠PCR体外连接成约 80 0bp大小scFv基因 (VH linker Vκ)。将scFv基因克隆至 pHEN2 ,电转TG1后计数克隆数为 3 0× 10 7cfu。随机挑选 12个克隆 ,其中 11个克隆PCR扩增出插入片段 ,插入效率约为 91%。用辅助噬菌体VCS M 13感染含 pHEN2 scFv的TG1后 ,产生 1 2× 10 14 pfu/ml噬菌体抗体颗粒。抗SSAELISA试剂盒检测其抗SSA活性 ,scFv噬菌体抗体的A值比相同稀释度的VCS M13的A值高 2 0～ 2 2倍。结论　建立的抗SSAscFv噬菌体抗体库含有的独立克隆数为 3 0× 10     

抗人肝癌MDscFV基因的表达及其免疫活性初步研究

将抗人肝癌单克隆抗体MD的重链可变区VH和轻链可变区VL基因重组，并使其表达。采用PT-PCR技术扩增VH及VL基因，通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽，体外构建MDscFV基因，经过常规转化与筛选，诱导表达蛋白。MDscFV基因全长为732bp，VH354bp位于上游VL330bp位于下游。重组蛋白相对分子量36kDa。scFV保留了与亲本抗体MD相似的免疫活性。成功地构建了抗人单链抗体MDscFV，并获得了较高水平的功能性表达。     

抗华支睾吸虫噬菌体抗体库的构建

目的　构建抗华支睾吸虫噬菌体抗体库 ,以期筛选出抗循环抗原的抗体组合。方法　应用噬菌体表面呈现技术 ,从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA后 ,用相应引物 PCR扩增出重链 Fd和轻链基因 ,经 Xho 和 Spel、Sac 和 Xba 双酶切 ,先后克隆入噬粒载体 p Comb3,再电转化大肠杆菌 XL1- blue菌株 ,辅助噬菌体 VCSM13超感染。结果　从感染华支睾吸虫病人淋巴细胞中扩增出约 70 0 bp重链 γ1 、γ3Fd段和轻链 κ、λ基因 ,分别和 p Com b3连接后成功导入 XL 1- blue,得到滴度为 7.5× 10 1 0 cfu/ ml,库容量为 5 .6× 10 6 噬菌体抗体库。结论　抗华支睾吸虫 Fab段噬菌体抗体库的构建 ,为进一步筛选抗华支睾吸虫循环抗原单克隆抗体奠定了基础。     

PCR法扩增NOGO基因RNA干涉小发夹和体外效应研究

目的 通过PCR方法获得带有U6启动子的NOGO基因RNA干涉小发夹.方法 设计特异性引物,人工合成U6启动子的上游引物和带有NOGO-66反相互补序列的下游引物.PCR扩增带有U6启动子的小发夹,PCR产物与载体连接.酶切产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,释放出430bp基因片段的质粒初步确定为阳性重组质粒,并测序.结果 成功地扩增了靶向NOGO基因RNAi的带有U6启动子的小发夹.结论 PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA.     

HCV-5′端非编码区cDNA在大肠杆菌内的克隆

本文从本院住院病人血清中用异硫氰酸胍裂解法提取HCV RNA,采用均含有EcoRⅠ内切酶位点的内引物进行RT—PCR,得到HCV RNA 5′端144bp(核苷酸从46到219)大小的cDNA片段,用EcoR Ⅰ酶消化RT—PCR产物,再将酶切后的扩增产物纯化,插     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

用PCA方法选择HBV DNA多聚酶TP区VH抗体

目的:用PCA方法选择HBVDNA多聚酶TP区VH抗体.方法:从YeastDisplayscFvAntibodyLibrary中提取包含scFv抗体库的质粒pPNL6,扩增VH抗体片段.以HepG2.2.15细胞分泌的HBVDNA为模板,PCR扩增HBVDNA末端蛋白(TP).以TP区作为抗原,用PCA方法进行VH抗体选择.结果:PCR扩增的TP区共540bp.对HBVDNA多聚酶TP区进行抗体选择,用PCA方法从抗体库中选择出3个对应抗体,根据DNA序列和WernerMüller数据库可标明3个抗体.结论:对HBVDNA多聚酶TP区进行抗体选择,用PCA方法可以从抗体库中较为简便的选择出对应抗体.     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因的体外扩增克隆及序列分析

目的 分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区（VH）基因并测定其序列。方法 根据鼠免疫球蛋白重链可变区基因FR1和FR4序列的保守性，化学合成体外扩增Ig重链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板，扩增VH基因，将其克隆入pUC19载体，重组子用Sanger′s双脱氧链终止法测定序列，将序列与GeneBank中已发表的抗体序列比较。结果 VH基因全长357bp，属鼠免疫球蛋白重链第Ⅱ亚类，由种系基因V、Dsp2．8与JH4重排而来。该VH基因序列已被GeneBank收录（accession No AF282622）。结论 该VH基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因。     

人源性抗-HBc单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性单链噬菌体抗体库，为筛选人源性抗—HBc单链抗体奠定基础。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体(抗—HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因，重组于噬菌粒载体叶pHEN1，转化抑制型大肠埃希菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。结果 成功地构建了人源性抗—HBc单链噬菌体库，库容量达10^6。结论 利用RT—PCR和噬菌体表面展示技术可以成功构建人源性单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选人源性单链抗体。     

抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定

目的将已筛选出的抗汉坦病毒核衣壳蛋白（NP）抗原单链抗体基因克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-scFv。方法提取含抗NP抗原单链抗体基因的T7噬菌体DNA,此为模板,PCR扩增单链抗体基因,BamHI和SalⅠ双酶切,经连接酶与BamHⅠ和SalⅠ双酶切的表达载体pGEX-6p-1连接;重组DNA转化入宿主菌E．coli BL-21（DE3）,琼脂糖凝胶电泳初筛选阳性重组质粒,并用PCR法、双酶切法及DNA测序鉴定。结果重组质粒pGEX-6P-1-scFv经BamHⅠ和SalⅠ双酶切,片段大小分别为5000bp和750bp,与预期值一致;重组质粒PCR产物大小为750bp,与预期值一致;测定重组质粒序列,并与scFv序列比较,结果相一致。抗NP单链抗体基因序列克隆人表达载体pGEX-6p-1。结论成功构建了含抗汉坦病毒NP抗原单链抗体基因的重组原核表达质粒pGEX-6P-1-SCFv。     

日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48可变区基因的克隆及序列分析

目的克隆日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48轻链及重链可变区基因并分析其序列.方法从杂交瘤细胞NP48提取总RNA、RT-PCR扩增目的基因片段,分别克隆于pMD18-T载体,测序并作核苷酸序列分析.结果 VL基因全长336 bp,属鼠免疫球蛋白κ链第Ⅱ亚类,由种系基因he24与Jκ4重排而来.该VL 基因序列已被GeneBank收录(accession No.AY309010).VH基因全长354 bp,属鼠免疫球蛋白重链第Ⅱ亚类, 由种系J558.47、Dsp2.2和JH4基因重排而来.该VH基因序列已被GeneBank收录(accession No.AY312433).结论序列比对分析表明该VL、VH基因为日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48可变区基因.     

带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签（HA标签）的乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）的表达质粒,为进一步研究HBe蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563bp;PCR产物经过Eco砒和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3／HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48h后,RIPA裂解细胞,Western blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5．9kb,酶切鉴定结果符合目的条带（563bp）大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3／HA—HBc蛋白,为进一步研究HBe蛋白的功能奠定了良好的实验基础。