人端粒相关蛋白HKR3、SMARCB1的筛选及其在胃癌细胞中的表达

端粒酶与肿瘤的发生有十分密切的联系，研究与人端粒酶逆转录酶（hTERT）相互作用的端粒相关蛋白将有助于了解端粒酶在肿瘤细胞中的生物学特性和分子机制。目的：筛选新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶的全酶结构、生物学特性及其作用机制奠定实验基础。方法：采用酵母双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选。构建诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT，筛选人睾丸cDNA文库；以蛋白质印迹法测定pGBKT7-hTERT融合蛋白的表达。对筛选得到的阳性克隆质粒进行测序，在GenBank中行同源性比较。采用逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）检测hTERT、HKR3、SMARCBl mRNA在胃癌细胞株SGC．7901中的表达。结果：融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT可在酵母菌株AHl09中有效、稳定地表达。cDNA文库筛选获得GenBank已收录的人cDNA序列HKR3和SMARCBl。hTERT、HKR3、SMARCBl mRNA在胃癌细胞株SGC-7901中表达一致，均呈高表达。结论：HKR3、SMARCBl是人端粒相关蛋白成员．与hTERT有十分密切的联系，可能在胃癌的发生过程中存在相互调节或协同作用。     

Sonic hedgehog蛋白N端基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建含Sonic hedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体.方法 通过BamH 1、Xho 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR 1及Not 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9 K-SHH-N DNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定.结果 转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致.结论 成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体.     

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗（BCG）CFP32,分析其抗原性。 方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、 鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。 结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和 pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456-g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310-g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。 结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。     

VEGF165正反义表达载体的构建及其对人胃癌细胞VEGF表达的调节

目的构建VEGF165(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞VEGF在mRNA和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将VEGF165 cDNA从pGEM-hVEGF165克隆载体上切下来,以正、反方向插入质粒pCDNA3中,构建VEGF165正、反义真核表达载体;用限制性内切酶和Sanger双脱氧终止DNA测序法证明VEGF165正、反义表达载体目的基因的序列和方向的正确性;用脂质体将VEGF165正、反义表达载体转染人胃癌细胞,用RNA斑点杂交及免疫荧光流式细胞仪检测VEGF mRNA和蛋白质的表达水平.结果酶谱分析及DNA测序表明VFGF165正、反义真核表达载体目的基因的序列及方向正确;转染正义表达载体后VEGF mRNA和蛋白质表达水平增加(蛋白免疫强度为75.4%;P＜0.05vs对照组,31.6%),转染反义表达载体后VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(蛋白免疫强度为8.9%;P＜0.05vs对照组).结论成功地构建了VEGF165正、反义真核表达载体;构建的载体能在胃癌细胞内有效表达,调节血管内皮生长因子的水平.     

HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化

目的用基因重组技术将HIV-1p24基因以及gp41基因具有抗原线性中和表位的部分重组连接，构建重组质粒，并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法设计带有酶切位点的引物，分别PCR扩增p24和gp41两个基因，将它们分别连接到pMD18-T载体中，测序验证后，挑选出含有目的基因的正确克隆。将p24片段酶切后连接到gp41基因所在的pMD18T载体中，再将连接后的两个基因酶切，重新连接到pET21a表达载体中。将表达载体转染大肠埃希菌诱导表达，经Western-blot验证表达正确。结果融合蛋白p24-gp41在大肠埃希菌中高效表达。结论融合蛋白p24-gp41可以在pET21a表达载体中高效表达。     

人羧基肽酶H原核表达载体的构建及其应用

目的 构建人羧基肽酶H（CPH）的原核表达系统，以获得其重组蛋白，并初步应用于人CPH自身抗体（CPH—Ab）的检测。方法 采用PCR方法，从质粒pcDNAⅡ扩增出CPH基因片段，将其克隆到原核表达载体pQE30后转化宿主菌E．coli M15，IPTG诱导CPH蛋白表达，用NiNTA亲和层析柱纯化，Western—blot法检测表达蛋白的抗原性。用重组CPH蛋白作为包被抗原，初步建立检测CPH—Ab的ELISA方法。 结果 获得了CPH原核表达载体，CPH蛋白得到了表达。纯化的蛋白可被CPH—Ab阳性的1型糖尿病患者血清识别。与放射配体法相比较，以重组CPH蛋白作为包被抗原初步建立的ELISA方法，其灵敏性和特异性均升高，分别为93．3％和97．5％。结论重组CPH蛋白具有良好的抗原性，为糖尿病患者CPH—Ab的检测奠定了基础。     

结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值

目的构建重组结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16kD和38kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段两次连接到表达载体pET21a中,形成38kD-16kD(3816),16kD, 38kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。     

利用pcDNA3.1/TOPO(R)TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因,构建其正义真核表达质粒.方法采用逆转录聚合酶链式反应技术,从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列,通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3.1/TOPO(R)TA真核表达载体上,构建出人类ANNEXINA2基因正义表达质粒.通过DNA测序方法对重组表达质粒进行鉴定.结果通过测序分析证实,构建的重组表达质粒目的基因片段为人类ANNEXINA2基因的完整编码区1 032 bp.结论构建真核表达载体的方法快速简便,适于进一步研究基因的细胞生物学作用.     

豚鼠结膜炎衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp3的克隆、表达和鉴定

目的 获得豚鼠结膜炎衣原体(GPIC)噬菌体φCPG1衣壳蛋白Vp3基因及其蛋白.方法 提取φCPG1及其核酸,PCR扩增Vp3基因,双酶切后将其定位插入原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒,转化入大肠埃希菌BL-21,并酶切分析、PCR扩增及测序鉴定,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)及Western印迹鉴定,胶回收纯化.结果 获得的Vp3基因片段经测序,长度为447 bp,检索确认其序列与GenBank一致.对重组质粒进行诱导表达,SDSPAGE和Western印迹均显示获得相对分子质量约25 000的GPIC噬菌体φCPG1衣壳蛋白Vp3,并得到了纯化蛋白.结论 成功表达了噬菌体φCPG1衣壳蛋白Vp3,为进一步研究其作用机制和临床应用奠定基础.     

人源M2三联体靶抗原BPO-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的用基因工程的方法克隆表达抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的3个靶抗原侧链二氧酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）、丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）及其连接形成的三联体BPO-E2融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断。方法针对BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2的cDNA序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取RNA，通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pET28a（＋），构建重组表达载体pET28a（＋）-BCOADC-E2、pET28a（＋）-PDC-E2、pET28a（＋）-OGDC-E2、pET28a（＋）-BPO-E2，转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western-blot等鉴定。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明，成功地构建了4种重组质粒。IPTG诱导表达后，获得4种融合蛋白。经免疫学鉴定，重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性。结论重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验室诊断。     

JC病毒t抗原的融合蛋白表达及抗体制备

目的 构建JC病毒t抗原的原核融合蛋白表达载体,表达并纯化该融合蛋白.方法 采用PCR方法 从患者脑脊液中扩增JC病毒t抗原,测序正确后再克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-t表达重组体,并诱导表达t抗原融合蛋白.大量制备该融合蛋白并以镍柱亲和层析纯化.然后以纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果pET32a(+)-t表达出相对分子质量为41 000左右的重组蛋白.十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-βD-硫代半乳糖苷诱导后3.5～20.0 h融合蛋白均高水平表达.Western印迹证实具有良好的抗原性,免疫BALB/c小鼠后,成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET32a(+)-t,表达纯化t抗原融合蛋白,成功制备了JC病毒小包膜蛋白t的抗体,为进一步流行病学调查及该基因的功能研究奠定了基础.     

大鼠髓样细胞表达激发受体-1／人IgG融合蛋白真核表达载体的构建表达与鉴定

目的 构建大鼠髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）/人IgG融合蛋白的真核表达载体,并在家蚕Bm细胞中实现稳定表达。方法 克隆大鼠TREM-1胞外段与人IgGFe段,片段连接后PCR扩增,再与病毒穿梭载体BAC1连接,基因克隆,构建重组质粒。利用杆状病毒表达系统（Bar-to-Bar）筛选重组杆状病毒,在Bm细胞中进行融合表达,并用Western blot法行蛋白鉴定。结果 重组质粒酶切测序正确,确认克隆载体构建成功。Western blot结果说明该蛋白样品可被抗大鼠TREM-1抗体特异性识别,证明该蛋白为TREM-1/IgG融合蛋白。结论 成功构建了大鼠TREM-1/IgG融合蛋白真核表达载体,并在Bm细胞中稳定表达。     

结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究

目的 构建Mtb ESAT6-RpfE（早期分泌抗原靶6-复活促进因子E）的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究。方法 分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白。采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6 RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺（dimethyl dioctyldecyl ammonium bromide,DDA）;第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG［DDA+poly(I:C)+明胶］。分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠。末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平;ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1。结果 PCR扩增的esat6、rpfE基因序列与GenBank报道一致;融合蛋白主要以包涵体形式表达;亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(427.13±100.46)］显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P＜0.001); 分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(506.50±140.40)］明显高于PBS组(19.25±14.75;q=11.36,P＜0.001)和 BCG组(125.5±46.41;q=8.882, P＜0.001)。ESAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体。结论 成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白。此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究。     

利用pcDNA3．1／TOPOC TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因，构建其正义真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术，从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列。通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1／TOPO TA真核表达载体上，构建出人类ANNEXIN A2基因正义表达质粒。通过DNA测序方法对重组表达质粒进行鉴定。结果通过测序分析证实，构建的重组表达质粒目的基因片段为人类ANNEXIN A2基因的完整编码区1032bp。结论构建真核表达载体的方法快速简便．适于进一步研究基因的细胞生物学作用。     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.     

人肝脏胆汁酸转运蛋白基因的克隆表达及其亚细胞定位

胆汁酸在脂肪和维生素消化吸收中发挥重要作用,当被排入小肠后约95%通过顶端钠依赖胆汁酸转运蛋白(ABST)被重吸收,其中的80%可通过牛磺胆汁酸钠共转运多肽(NTCP)被摄入肝细胞内并再次被分泌到胆汁中形成胆汁酸的肠肝循环[1].     

胃癌MG-7抗原模拟表位与HSP70融合基因的构建及表达

目的构建和表达胃癌MG7模拟表位与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法采用加端PCR的方法,将MG7模拟表位(GC23)的编码序列融合到HSP基因的3′端;PCR获得的融合基因片段经TA克隆法克隆到pUCm-T载体上,并进行DNA测序;将融合基因片段从pUCm-T载体上酶切后,亚克隆到表达载体PET-21a(+)上;将重组质粒PET-21a(+)/GC23-hsp转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测结果应用PCR方法扩增出约2.0kb的目的片段,序列测定结果证实,模拟表位GC23序列成功地融合到HSP70基因的3′端,GC23及HSP70基因序列均正确;经EcoRⅠ+XhoⅠ酶切及PCR鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体PET-21a(+)上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SSS-PAGE发现在Mr为72000处有表达量明显增多的蛋白条带,Western blot证实,Mr72000处的条带为目的条带.结论成功构建并表达了MG7模拟表位与HSP70的融合基因.