酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

原代人牙周膜成纤维细胞的培养及培养方法的改进

目的：探讨如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：组织来源于11～15岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，组织贴壁培养法进行培养采用冠根分离控制取材中的污染，首次传代前进行细胞分散的方法来提高传代的成功率，并对培养细胞的形态及超微结构进行了观察。结果：经免疫组化染色证实所培养的细胞为牙周膜成纤维细胞，通过冠根分离法可有效的控制组织污染，首次传代前进行细胞分散可提高细胞传代成功率，从而使细胞培养成功率提高。结论：获得人牙周膜成纤维细胞，培养成功率在15％～20％。     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的：提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLF)原代培养的成功率，快速建立体外细胞研究模型．方法：采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块，获取细胞；用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源，通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性．结果：原代培养成功率为77．8％．获得的细胞呈梭形，抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，     

地塞米松对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的：研究地塞米松（DEX）对体外培养人牙周膜成纤维（PDLF）细胞增殖的影响,寻找体外培养人PDLF(hPDLF)细胞的优化条件,为牙周组织再生的研究工作奠定基础。方法：体外分离培养的hPDLF细胞随机分为5组,分别用5种含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基培养5～8代:①空白对照组（无DEX）;②含5 mg•L^-1DEX;③含10 mg•L^-1 DEX;④含20 mg•L^-1 DEX;⑤含50 mg•L^-1 DEX。以MTT法测定DEX对hPDLF细胞增殖率的影响;采用倒置相差显微镜观察hPDLF细胞在添加不同浓度DEX的胎牛血清培养基中培养后的细胞形态学改变。结果：将hPDLF细胞接种于24孔板后的第3天,细胞出现汇合现象。细胞在孔底呈鳞片状。采用DEX条件DMEM细胞培养液培养,可见 细胞逐渐变成多层,细胞形态变小,突起变钝。MTT法检测结果表明含不同浓度DEX的DMEM培养基中培养的hPDLF细胞数均高于对照组（P<0.05）;不同浓度的DEX对hPDLF细胞增殖均有影响(P<0.05）,且随着浓度增加,hPDLF细胞增殖能力逐渐增高。结论：DEX能使体外培养的hPDLF细胞表现很强的增殖活性。     

体外不同张应力对人牙周膜成纤维细胞胶元纤维合成的影响

目的 观察不同张应力对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)胶元纤维合成总量的影响．方法将体外分离培养的HPDLF在自行开发的膜式动态张应力-体外细胞培养研究体系中进行16h、24h和32h3个时段的不同张应力加载，以^3H—Proline掺入法检测其胶元纤维合成总量。结果 动态张应力组奎(5kPa-2．5kPa-5kPa)HPDLF胶元纤维合成总量的增加最为明显，其次依次为对照组、静张应力组、动态张应力组1(5kPa-0kPa-5kPa)．结论 不同频动范围的动态张应力对HPDLF胶元纤维合成总量的影响截然不同，适当频动范围的动态张应力能更有效地促进胶元纤维的合成。     

碱性成纤维细胞生长因子对培养的人牙周膜细胞增殖和分化的作用

目的 :观察人重组碱性成纤维细胞生长因子 (hu manbasicfibroblastgrowthfactor,hbFGF)对人牙周膜细胞(periodontalligamentcells,PDLC)增殖和分化的效应 .方法 :对hbFGF (5 0 μg·L-1 )刺激后 3,9,1 5和 2 1d的细胞进行计数 ,同时行HE和免疫组织化学染色 .结果 :hbFGF (5 0 μg·L-1 )可促进PDLC细胞生长 ,在培养的 3,9,1 5和 2 1d时 ,其细胞计数分别是 38× 1 0 3 ,80× 1 0 3 ,1 0 6× 1 0 3 ,99× 1 0 3 .但不改变PDLC的形态和生长方式 ;与对照组相比PDLC的ConA ,WGA凝集素受体表达无差异 .两组细胞均未出现钙化现象 .结论 :hbFGF可促进体外PDLC的增殖 ,本实验未发现hbFGF对细胞的促分化效应     

大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

目的建立大鼠乳鼠背部皮肤组织和尾尖部皮肤组织成纤维细胞的体外培养方法,并比较二者的区别。方法分别取大鼠乳鼠的背部和尾尖部皮肤组织,利用组织贴块法分离和培养皮肤成纤维细胞,用酶消化法进行细胞传代培养,采用梯度温度冻存细胞。倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态,用细胞骨架波形蛋白抗体进行鉴定。结果光学显微镜下3~5 d可见细胞从组织块游出,7 d细胞数量增多,10 d可贴满培养瓶壁;且大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞波形蛋白表达均为阳性。结论大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞的生物特点无差别,均可作为皮肤成纤维细胞的取材部位。     

釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞矿化相关蛋白的影响

目的通过检测釉基质蛋白（Enamel matrix proteins,EMPs）作用于体外培养牙周膜成纤维细胞,对细胞骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连素、牙骨质附着蛋白（Cementum attachment protein,CAP）表达及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性的影响,探讨EMPs促进牙周组织再生的作用机制。方法酶消化法获得人牙周膜成纤维细胞（Human periodontal ligament fibroblast,hPDLF）用100mg/L的EMPs诱导,镜下逐日观察细胞形态变化,在3天、7天两个时间点利用免疫组化方法和图像分析技术检测和分析诱导条件作用后细胞骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连素表达的影响,检测细胞牙骨质附着蛋白的表达。利用ALP法检测诱导后细胞成骨活性的变化。结果 100mg/L的EMPs对hPDLF具有上调骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连素的作用,随时间延长这种促进作用愈明显;EMPs作用hPDLF 3天即表达牙骨质附着蛋白;EMPs可促进hPDLF碱性磷酸酶活性的增强。结论 EMPs在一定浓度下可促使hPDLF向成骨、成牙骨质样细胞分化。     

全牙酶消化法原代培养人牙周膜成纤维细胞及鉴定

目的 探讨一种快速简便、原代培养成功率高、可重复性高的人牙周膜成纤维细胞培养方法。方法将处理后的牙齿整个用酶进行消化,原代培养人牙周膜成纤维细胞,对培养出的细胞进行形态学观察,免疫组化方法鉴定其来源,通过生长曲线研究其生物学特性。结果 8~14 d内可获得实验用成纤维细胞,原代培养成功率为90%,细胞形态呈长梭形。波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。结论采用全牙酶消化法可以快速、成功地培养出人牙周膜成纤维细胞,且简单易行,可重复性高。     

酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞

目的建立用酶消化组织块培养兔牙周膜细胞的方法,为下一步的研究做好基础。方法取成年新西兰大白兔牙周膜组织,通过酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞。取第4代免牙周膜细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源。结果酶消化组织块法成功培养出兔牙周膜细胞,细胞形态呈梭形。免疫细胞化学鉴定波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,说明细胞为中胚层来源的牙周膜成纤维细胞。结论酶组织消化块法可以很好地进行兔牙周膜细胞体外培养,且此方法简单易行。     

小型猪牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的:体外分离培养小型猪牙周膜细胞,为建立小型猪体内实验动物模型及进行牙周组织再生的研究奠定实验基础.方法:无菌拔除小型猪上下颌4颗切牙及4颗尖牙,采用组织块法原代培养小型猪牙周膜细胞并传代,绘制生长曲线,通过形态学和免疫组织化学染色方法对其进行鉴定.结果:组织块法成功培养小型猪牙周膜细胞,培养成功率为50%,其中切牙...     

黄芩苷对脂多糖诱导牙周膜成纤维细胞表达炎症因子的影响

【】目的：探讨黄芩苷对脂多糖促人牙周膜成纤维细胞炎症因子表达的影响。方法：将培养后的人牙周膜成纤维细胞用不同浓度的黄芩苷处理,CCK8实验观察不同浓度黄芩苷对人牙周膜成纤维细胞的细胞毒性。将培养后的人牙周膜成纤维细胞分为空白对照组、LPS组、黄芩苷组和LPS+黄芩苷组。空白对照组仅加入2%胎牛血清的培养液;LPS组加入加入100μg/mLLPS ;黄芩苷组分别加入黄芩苷200、500ng/mL ;LPS+黄芩苷组加入100μg/mL LPS,同时分别加入黄芩苷 200ng/mL 、500ng/mL。24h收集细胞, 检测各组IL-6、IL-8、IL-1βmRNA表达的变化。结果： 500ng/mL浓度以下黄芩苷添加至细胞没有明显的细胞增殖毒性。单独加入黄芩苷200ng/mL和500ng/mL的黄芩苷组和空白对照组比较,IL-6、IL-8、IL-1β均无明显变化(P＞0.05)。 和空白对照组比较,LPS组IL-6、IL-8、IL-1β明显上升,差异有统计学意义 (P<0.05),同时加入LPS和200ng/ml黄芩苷,相比单独加入LPS组,IL-6、IL-8、IL-1β明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。而同时加入LPS和500ng/mL黄芩苷,相比单独加入LPS组,IL-6、IL-8、IL-1β明显上升,差异有统计学意义 (P<0.05) 结论：黄芩苷在低浓度时显示有抑炎作用,而在浓度增加达到500ng/mL时显示有促炎作用。     

人牙周膜细胞条件培养基促PC12细胞分化的作用研究

目的研究牙周组织中是否存在神经生长因子(NGF)的表达。方法采用培养的人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)的条件培养基与PC12细胞共培养的方法研究hPDLF是否分泌具有活性功能的NGF。结果在hPDLF条件培养基中培养的PC12细胞长出突起,向神经元样细胞分化。对照组及NGF抗血清培养的PC12细胞仅有少量长出突起。结论本研究通过体外研究初次显示培养的hPDLF分泌NGF蛋白,提示NGF可能作为信号分子在牙周组织损伤愈合过程中的神经再支配中发挥作用。     

胰岛素样生长因子Ⅰ对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的：研究胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）对人牙周膜成纤维细胞( PDLF)增殖能力的影响，为牙周组织改建工作提供理论依据。方法：取本实验室自行制备生长状态良好的转染IGF-Ⅰ的PDLF和未转染IGF-Ⅰ的PDLF，分别用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，经计数后进行接种并计数，绘制成细胞生长曲线，比较2种细胞生长速度的差异；用0.25%胰蛋白酶分别消化转染和未转染IGF-Ⅰ的PDLF，培养后采用MTT法测定A值，并比较2种细胞增殖活性的差异;采用碱性磷酸酶（ALP）比色法检测比较转染和未转染IGF-Ⅰ的PDLF的ALP活性。结果：细胞生长曲线显示转染IGF-Ⅰ的PDLF的生长速度高于未转染IGF-Ⅰ的PDLF，差异有显著性（P<0.05）；转染IGF-Ⅰ的PDLF的增殖能力及ALP活性高于未转染IGF-Ⅰ的PDLF，差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。 结论： IGF-Ⅰ可能通过PDLF发挥其调节牙周组织改建的作用。     

丁酸对人牙周膜细胞增殖的影响

目的:探讨丁酸对人牙周膜细胞增殖的影响.方法:用含不同浓度丁酸(0 mol/L,2 mol/L,4 mol/L,8mol/L)的培养液培养人牙周膜细胞,通过MTT法测定其增殖.结果:人牙周膜细胞进入指数生长期后,丁酸以剂量依赖的方式抑制人牙周膜细胞的增殖.结论:丁酸可能通过抑制人牙周膜细胞的增殖,进而影响牙周膜的改建和更新,促进牙周袋形成和牙周组织破坏.     

茶多酚对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的 观察茶多酚对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响.方法 采用组织块培养法培养原代人牙周膜成纤维细胞并传代,经免疫组化SABC法检测角蛋白和波形丝蛋白鉴定,取5～8代细胞用于实验;按茶多酚不同浓度分1 mg/ml(B组)、0.5mg/ml(C组)、0.25mg/ml(D组)、0.125mg/ml(E组)、0.0625mg/ml(F组)组和空白对照组(A组),采用细胞计数法、MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞DNA含量.结果 不同浓度茶多酚均促进人牙周膜成纤维细胞的增殖和DNA合成(P＜0.05),茶多酚作用的最适浓度为0.5 mg/ml,最佳作用时间为48 h.结论 茶多酚对人牙周膜成纤维细胞增殖具有明显的促进作用.     

干细胞因子对牙周膜细胞增殖分化能力的影响

目的探讨干细胞因子（SCF）对体外培养的人牙周膜细胞（hPDLCs）增殖、分化能力的影响。方法无菌条件下刮取因阻生或正畸需要拔除的牙齿根中1／3的牙周膜组织，采用组织块法行体外原代培养，所培养的细胞经免疫细胞化学鉴定后接种于塑料培养板，加入含0.1、1、10、100μmol／L SCF的培养液。然后采用MTT法测定细胞增殖、分化能力，并以ELISA法检测碱性磷酸酶（ALP）活性。结果原代牙周膜细胞组织块法培养的细胞生长缓慢，加入SCF后细胞生长旺盛，细胞形态为纺锤形或成纤维样，细胞质透明，状态良好。SCF在0．1、1、10、100μmol／L时对hPDLCs均有明显的促增殖作用，其中浓度为10μmol／L时促进作用最明显（P〈0.05）。此外，SCF还可以增强hPDLCs的ALP活性，其中浓度为10μmol／L时ALP OD值最高（P〈0.05）。结论SCF对hPDLCs的生物学活性有促进作用，能促使其向成骨细胞方向分化，提示SCF可能有促进牙周组织再生的作用。