纤维环穿刺法与纤维环切开法建立兔椎间盘退变模型

背景：椎间盘退行性变模型的建立,是研究椎间盘退行性变病理过程和尝试基因治疗等的基础,建立的动物模型要求与人类椎间盘退行性变具有相似性和可比拟性,但目前尚缺乏公认的最佳实验动物模型。 目的：比较纤维环穿刺法和纤维环切开法建立兔椎间盘退变动物模型的差异。 方法：将32只新西兰大白兔以数字表法随机分为纤维环穿刺组和纤维环切开组。经腹膜外入路暴露L3/4、L4/5、L5/6椎间隙,纤维环穿刺组采取针刺纤维环,纤维环切开组采取尖刀切开纤维环,控制穿刺或切开的深度及方向。术后2,4,12,20周通过MRI和组织病理学检查观察腰椎间盘髓核变性及组织病理情况。 结果与结论：术后4周,兔椎间盘髓核面积缩小,纤维环面积增大,髓核内T2加权像信号降低、变暗,椎间隙高度也开始下降,纤维环穿刺组T2信号强度评分较纤维环切开组低(P < 0.05);随着时间的进展,兔椎间盘T2信号强度评分逐步增高,椎间隙逐渐变窄,术后20周椎间盘T2信号强度评分达最高,两组比较差异无显著性意义。随着时间的进展,两组髓核内细胞含量逐渐减少,纤维软骨形成。提示纤维环穿刺法和纤维环切开法均可成功建立椎间盘退变模型,但纤维环切开法椎间盘的退变程度较纤维环穿刺法剧烈,建立的模型过程可能不是人体椎间盘自然退变的模拟过程,纤维环穿刺法比较真实地模拟了人类椎间盘损伤后的退变过程。     

模拟人后路髓核摘除构建椎间盘退行性变动物模型

背景：髓核摘除术是治疗椎间盘突出的经典方法,但存在较高的复发率。 目的：验证模拟人后路髓核摘除进行后外侧穿刺抽吸髓核,建立椎间盘退行性变动物模型的可行性。 设计、时间及地点：观察对照实验,于2006-10/2007-02在解放军南京军区福州总医院动物实验室完成。 材料：选用日本大耳白兔20只,行椎间盘退行性变动物模型制备。 方法：用持针器夹持21G穿刺针,行L1~2及L3~4椎间盘右后外侧穿刺髓核抽吸法摘除部分髓核组织,术后2,4,8,12周分别对造模后椎间盘行组织学观察,并将L2~3椎间盘作为对照。 主要观察指标：通过苏木精-伊红染色观察椎间盘组织学结构。 结果：苏木精-伊红染色可见对照椎间盘大多髓核完整,髓核与纤维环分界清晰,纤维环结构接近正常,髓核组织中有大量髓核细胞。造模后第4周髓核细胞数量不断减少,第12周时髓核中主要为纤维组织,伴有极少量髓核细胞。 结论：模拟人后路髓核摘除术建立后外侧纤维环穿刺髓核抽吸的椎间盘退行性变动物模型成功建立,可为应用组织工程修复重建退行性变椎间盘提供有效的动物模型。     

透明质酸钠溶液复合可注射型骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘

摘要 背景：透明质酸作为椎间盘组织工程支架的基质材料,可提供蛋白多糖附着点,增加蛋白多糖的沉积,以足够大的孔率允许种子细胞长入。 目的：观察透明质酸钠混合溶液复合骨髓间充质干细胞修复兔退变椎间盘的效果。 方法：以后外侧穿刺抽吸L1/2和L3/4髓核构建日本大耳白兔椎间盘退变模型,造模后2周应用微量注射器向L3/4椎间盘内注射同种异体骨髓间充质干细胞与透明质酸钠混合溶液作为实验组,L1/2椎间盘注射透明质酸钠作为对照组。注射后2,4,8,12 周时行兔椎间盘影像学及病理学检查。 结果与结论：对照组椎间盘高度呈降低趋势,实验组注射后2周椎间盘高度缓慢下降,之后缓慢升高,两组在4个时间点椎间盘高度指数改变差异有显著性意义(P < 0.05)。病理结果显示实验组髓核纤维环形态得到保留,髓核纤维环边界清晰,植入的骨髓间充质干细胞产生增殖分裂,并向周围迁徙规律排列,其病理学评分明显高于对照组。12周内实验组Ⅱ型胶原含量高于对照组(P < 0.05)。说明移植于退变椎间盘内的骨髓间充质干细胞能够存活,且有增殖能力,其与透明质酸钠混合溶液联合移植可以延缓退变椎间盘进一步退变,并促进退变椎间盘修复。 关键词：透明质酸钠;骨髓间充质干细胞;椎间盘退变;细胞移植;髓核抽吸 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.16.004     

模拟人后外侧入路髓核摘除构建的椎间盘退行性变动物模型

背景：椎间盘退变的病理生理学机制至今尚未明了,所以制作一种与自然椎间盘退行性病变过程相类似的、适用于这些治疗方法的动物模型有助于对椎间盘退行性变的诱因、病理生理变化及某些治疗方法的研究。 目的：模拟人后路髓核摘除术进行后外侧穿刺抽吸髓核建立椎间盘退行性变动物模型的可行性研究及其优点。 方法：随机选取日本大耳白兔20只,根据解剖结构观察结果,为防止纤维环后外侧穿刺损伤血管,采用右后外侧入路,行L1~2和L3~4椎间盘后外侧穿刺髓核抽吸法摘除部分髓核组织,将L2~3椎间盘纳入对照组。术后2,4,8,12周分别对造模后椎间盘及对照椎间盘(L2~3)行X射线及MRI影像学观察。 结果与结论：日本大耳白兔20只均进入结果分析,术后2,4,8,12周实验组椎间盘高度指数持续下降(P < 0.05),说明造模后椎间盘间隙高度会逐渐降低,并且各时间点椎间盘高度指数明显低于对照组(P < 0.05)。与对照组比较,造模后2,4,8,12周时实验组椎间盘MRI T2WI信号逐渐下降,并且随时间延长逐渐降低,呈低信号改变。通过影像学观察发现本模型退行性变的征象与人腰椎间盘退行性变的征象一致,提示模拟人后路髓核摘除术建立后外侧纤维环穿刺髓核抽吸的椎间盘退行性变动物模型成功建立,为运用组织工程修复重建退行性变椎间盘的研究提供有效的动物模型。     

椎间注射转化生长因子β1对兔退变腰椎间盘蛋白多糖表达的影响

背景：体外研究证实转化生长因子β1可以促进蛋白多糖合成,延缓椎间盘退变,但体内实验鲜见报道。 目的：观察局部应用转化生长因子β1对兔退变腰椎间盘髓核蛋白多糖表达的影响。 方法：取30只新西兰大白兔建立兔腰椎间盘退变模型,造模12周,经X射线证实退变后,随机选择6只模型兔及6只未造模正常兔,处死取材。分别向剩余24只模型兔L4~5椎间隙注射转化生子因子β1和生理盐水。末次给药2,4周取材,间苯三酚法测定兔椎间盘髓核内蛋白多糖的水平。 结果与结论：造模12周,兔退变椎间盘髓核中蛋白多糖水平明显降低(P < 0.01)。经局部注射转化生子因子β1后,兔退变椎间盘髓核中蛋白多糖表达明显增多(P < 0.01)。说明在兔椎间注射转化生子因子β1 可以促进髓核蛋白多糖的合成,延缓椎间盘退变。     

制作兔腰椎终板下缺血模型：MRI与病理学变化验证的可行性

背景：目前的椎间盘退变动物模型主要通过改变椎间盘生物力学环境、损伤椎间盘自身结构以及应用基因技术改变动物的遗传性状等诱发退变,但这些方法均为外界人为因素直接作用于椎间盘,与椎间盘退变的自然病程差别较大。 目的：评价经皮穿刺兔腰椎终板下椎体注射平阳霉素制作椎体终板下缺血模型的可行性。 方法：选取新西兰大白兔46只,每兔设L5为实验组、L4为对照组。穿刺腰椎终板下椎体,L5注射平阳霉素(2 g/L)1 mL,,L4注射生理盐水1 mL。其中4只兔子术前行腰动脉造影。术后第1,2,3,4,5周,2个月及3个月随机选取6只行MRI检查,并取病理送检。测量对比第4周实验组MRI与病理切片的缺血面积。 结果与结论：对照组MRI和病理学检查均无特异性变化,实验组MRI第1,2周变化不明显,第3周出现FST1WI低信号,T2WI及FST2WI呈稍高信号,第4周信号变化更明显;实验组病理第1,2周无特异性变化;第3,4周骨小梁排列杂乱, 骨细胞逐渐减少,椎体骨髓内血细胞减少,脂肪细胞增多融合,终板软骨细胞减少、结构紊乱,纤维环及髓核无明显变化;第5周出现椎间盘退变表现;第2,3个月终板下椎体缺血持续存在、椎间盘退变更加明显。实验组第4周MRI与病理切片缺血面积之间有显著正相关性(r=0.965,P < 0.001)。结果证实,采用经皮穿刺终板下椎体注射平阳霉素的方法可成功制作兔腰椎终板下缺血动物模型,具有创伤小、操作简便、重复性好和成功率高的特点。该模型是研究腰椎及椎间盘退变较理想的一种动物模型。     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。 目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。 方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。 结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的生物学性状比较：可以为干预退变髓核细胞提供最佳时机吗？

背景：人体椎间盘是一个承受载荷却又缺乏血管的结构,因而容易发生退行性变,但椎间盘退变的机制尚不明确。 目的：通过体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞生物学性状比较,认识退变髓核细胞的细胞学退变时机。 方法：分离、培养人正常及退变椎间盘髓核细胞,对两种细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用生长曲线和XTT实验研究两种细胞的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原及糖胺多糖的mRNA表达。 结果与结论：退变椎间盘细胞至少要比正常椎间盘细胞提前2代出现形态学老化表现。退变髓核细胞表现为G1期阻滞,使细胞不能进入S期,细胞有丝分裂受到抑制。退变髓核细胞总体来说,生长要比正常髓核细胞快,但老化也较快。退变髓核细胞自第1代开始,Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达比同期正常髓核细胞低得多。说明在体外培养条件下,退变髓核细胞持续增殖能力低,更容易衰老、凋亡。提示退变髓核细胞体外培养衰老较快,进行干预试验逆转椎间盘退变的最佳时机为传2代之前的细胞。     

骨形态发生蛋白2基因转染软骨细胞注入腰椎间盘损伤模型：10周测量蛋白多糖和胶原含量

背景：研究表明骨形态发生蛋白2基因转染软骨细胞可促进体外培养的髓核细胞合成细胞外基质,但其对体内退变椎间盘组织代谢的影响却罕见报道。 目的：探讨骨形态发生蛋白2基因转染细胞移植治疗椎间盘退变的可行性。 方法：用新西兰大白兔建立腰椎间盘损伤动物模型,建模后随机分为细胞移植组和对照组。细胞移植组注入骨形态发生蛋白2基因转染的软骨细胞,对照组注入等剂量生理盐水,两组动物在注射后2,4,6,8和10周分别取出退变的椎间盘髓核组织,并测量其蛋白多糖及胶原含量。 结果与结论：与对照组比较,细胞移植组髓核蛋白多糖及胶原含量均有明显增高(P < 0.05)。结果提示椎间盘退变的标志之一可能为髓核内细胞外基质含量的减少,而骨形态发生蛋白2基因转染细胞移植的方法可促进细胞外基质合成,改善退变髓核的生物活性,延缓椎间盘的退变。     

山羊腰椎间盘退变模型硬膜外胶原酶的注射*

背景：采用椎间盘外、硬膜外腔注射胶原酶治疗椎间盘突出症的机制，目前尚不完全清楚。 目的：观察硬膜外注射胶原酶对椎间盘退变动物模型的作用。 方法：成年山羊6只，麻醉后作侧外方切口至腰椎体腹侧，椎板加压并用钢板螺钉固定，L1/L2，L3/L4椎间盘分别注射0.5 mL无水乙醇建立椎间盘退变模型。硬膜外注射实验用胶原酶1 mL，2周后处死动物，取出椎间盘，作电镜切片观察。 结果与结论：电镜下显示：退变的椎间盘纤维环上有裂隙，退变的椎间盘的胶原纤维明显溶解，未退变的椎间盘未有明显溶解。提示硬膜外注射胶原酶通过纤维环上的裂隙渗透到盘内，发生化学溶解作用，从而达到治疗作用。     

Immunohistochemical investigation on type III and VI collagen organization in human intervertebral discs in the neonatal period

Nine L5–S1 discs from cadavers following death at ages ranging from 28 weeks of gestation to 1 month after birth were analysed immunohistochemically to investigate type III and VI collagen organization in neonatal discs. The annulus fibrosus stained poorly with the anti-type III antibody. The transition zone and the nucleus pulposus showed a fibrillary framework. No clear pericellular staining was detected. Poor staining with the anti-type VI antibody was detected in the annulus. Single pericellular rings were observed in the transition zone and in the nucleus. The pericellular rings were never multilayered. Type III and VI collagen organization in the newborn is similar to that observed in adults and in the aged. Multiple pericellular rings are never observed. Further research on diseased and healthy intervertebral discs may help clarify which disc changes are age-related and which follow on from degeneration.     

针刺髓核构建退行性变椎间盘模型★

背景：目前对椎间盘退行性变尚无有效治疗方法，实验性椎间盘退行性变模型的建立，是研究椎间盘退行性变病理过程和尝试基因治疗等的基础，建立的动物模型要求与人类的椎间盘退行性变具有相似性和可比拟性。 目的：拟建立一种稳定、重复性强的椎间盘退行性变动物模型。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-10/2006-03在哈尔滨医科大学附属第一临床医院中心实验室完成。 材料：选用健康成年新西兰大白兔30只，按随机数字表法分为2组，手术组15只，对照组15只。 方法：手术组以18#腰穿针针刺L1~5节段椎间盘，至少穿刺5次，直至胶冻样髓核组织出现为止；对照组做同样皮肤切口，拨开肌肉，暴露椎间盘后即缝合。 主要观察指标：手术8周以后通过MRI和组织病理学检查观察腰椎间盘退行性变情况。 结果：①对照组腰椎MRI检查未见异常；手术组L1~2腰椎间盘则相继出现T2加权像低信号、T1加权像信号无明显改变等变化。②组织学切片显示，手术组椎间盘髓核纤维软骨样变性。 结论：针刺髓核的方法可以成功构建椎间盘退行性变新西兰大白兔模型。     

兔不同程度椎体切除相邻椎间盘的组织学变化

背景：切除部分椎体是否可能会导致椎间盘营养通道的破坏,从而导致椎间盘的退行性变,目前很少有研究涉及。 目的：评估兔椎体不同程度切除对相邻椎间盘退行性变的影响。 方法：将10只新西兰兔分为2组,根据椎体不同程度切除植骨内固定,分为切除1/2椎体组和切除3/4椎体组。在造模后6个月处死动物,获取伤椎下位椎间盘及正常椎间盘组织(设为正常对照组);并进行苏木精-伊红染色,观察椎间盘组织学改变,检测椎体软骨终板血管芽数量;通过阿新蓝染色测量图像阳性吸光度以评价椎间盘髓核组织中蛋白多糖的变化。 结果与结论：兔椎体切除小于1/2时,相邻椎间盘营养状况不会有明显改变;如果前路减压需切除椎体不超过1/2时应考虑单节段植骨融合双节段固定。椎体切除大于3/4时,相邻椎间盘营养状况会有明显改变,并导致椎间盘退行性变;如果前路减压需切除椎体超过3/4时应考虑切除相邻间盘行两节段植骨融合。     

Rabbit Model for in vivo Study of Intervertebral Disc Degeneration and Regeneration

Objective

The purpose of this study is to verify the usefulness of the rabbit model for disc degeneration study.

Materials

The L1-L2, L2-L3, L3-L4, or L4-L5 lumbar intervertebral disc (IVD) of 9 mature male New Zealand White rabbits were injured by inserting a 16-gauge needle to a depth of 5 mm in the left anterolateral annulus fibrosus while leaving L5-L6 IVD uninjured. Three other rabbits also received intradiscal injections of rabbit disc cells transfected with adenovirus and bone morphogenetic protein-2 (ad-BMP-2) at L4-L5 in addition to injury by 16-gauge needle at the L1-L2 level. Using digitized radiographs, measurements of IVD height were made and analyzed by using the disc height index (DHI). Magnetic resonance imaging (MRI) scans of the injured discs, injected discs, and uninjured L5-L6 discs were performed at 15 weeks post surgery and compared with preoperative MRI scans.

Results

All twelve rabbits showed consistent results of disc degeneration within 15 weeks following annular puncture. DHIs of injured discs were significantly lower than that of the uninjured L5-L6 discs (p<0.05). The mean value of disc degeneration grade of injured discs was significantly higher than that of uninjured discs (p<0.05). The injection of disc cell transfected with ad-BMP-2 did not induce disc regeneration at 15 weeks after injection.

Conclusion

This study showed that the injured disc had a significant change in DHI on simple lateral radiograph and disc degeneration grade on MRI scans within 15 weeks in all rabbits. Rabbit annular puncture model can be useful as a disc degeneration model in vivo.     

多效生长因子及血小板源性生长因子在增龄鼠椎间盘中的表达*

背景：在组织缺氧状态下,多效生长因子能够直接参与新生血管的生成,在人类腰椎间盘退变方面起重要的作用。 目的：观察增龄鼠椎间盘中多效生长因子和血小板源性生长因子的表达,及其与椎间盘退变的关系。 方法：取1,3,6,12,18月龄Wistar大鼠各10只。采用免疫组织化学染色方法检测椎间盘组织中多效生长因子及血小板源性生长因子的表达情况。采用Spearman相关分析方法对多效生长因子和血小板源性生长因子的相关性进行分析。 结果与结论：随着大鼠月龄的增加,椎间盘细胞中多效生长因子及血小板源性生长因子的表达有逐渐减低的趋势,但至18月龄又有所增加。同月龄组椎间盘细胞中,多效生长因子及血小板源性生长因子在终板的表达高于髓核和纤维环(P < 0.05)。多效生长因子及血小板源性生长因子在椎间盘组织中的表达有一定的相关性(P < 0.01)。提示大鼠椎间盘结构随月龄增加发生退行性变,多效生长因子及血小板源性生长因子参与了大鼠椎间盘的退变。