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将pN2-LacZ和pN2-CMV-UK质粒直接注射到Wistar大鼠股四头肌,可以在肌肉中检测到这两种基因的表达产物。注射pN2-LacZ质粒后7天,β-半乳糖苷酶的表达量最高,可达2.48×10-4U/g组织,并且可持续表达3周以上。组织化学染色表明部分肌细胞内有LacZ基因表达。当用脂质体介导时,注射含30μg质粒的脂质体─DNA复合物,β-半乳糖苷酶的活性同直接注射80μg质粒时的活性无差别,直接注射pN2-CMV-UK质粒后7天,单链尿激酶原含量最高,可达550ng/g组织。基因注射后3个月仍可检测到单链尿激酶原。 相似文献
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为观察外源性基因在心血管细胞内的表达,本工作构建了含有外源性标记基因LacZ的逆转录病毒质粒fPGV-MT-LacZ。应用脂质体(Lipofectin)包裹质粒,转染培养的大鼠主动脉平滑肌细胞,经G4l8筛选、克隆以及β-半乳糖苷酶的酶活测定,证明外源性基因可以在血管平滑肌细胞中表达。揭示血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的一种靶细胞。 相似文献
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t-PA基因转移持续升高小鼠血浆纤维蛋白溶解活性彭鲁英,崔宁,林冰,蔡旭,朱运松,宋后燕(上海医科大学基础医学院分子遗传学研究室200032)血栓性疾病在心、脑血管疾病中占有重要比例,是这类疾病引起死亡的主要原因之一。而各种原因引起的纤溶系统功能降低... 相似文献
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将医用缝合线浸泡在质粒DNA溶液中,然后缝合在大鼠股四头肌上,可以观察到外源基因在肌肉组织中高效、稳定地表达,其表达量高于磷酸钙共沉淀和DNA沉淀块埋植法,较肌肉直接注射法表达量高10倍左右。 相似文献
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建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)的细胞株。将t-pAcDNA连接在真核表达载体pcDNA3的HindⅢ位点,构建成重组质粒pcDNA3tPA,用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,G418筛选培养后形成阳性克隆。结果:培养液中重组t-pA(Recombinantt-pA,rt-pA)活性>6000IU/106细胞d-1.Northern杂交证实t-PAcDNA基因的转录。高表达细胞连续传代10次后,培液中rt-pA活性未见明显变化。结论:转染t-PAcDNA基因的CHO细胞已形成稳定的工程细胞。 相似文献
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有效的基因转移技术是基因治疗的关键步骤。为了研究外源基因在动物心肌组织中的表达,我们将pN2-LacZ质粒直接注射到大鼠的左心室壁,经X-gal染色和酶活力测定,结果表明外源基因直接注射入心肌组织后,可在大鼠心肌中高效表达。 相似文献
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ANF基因转染人血管平滑肌肉瘤细胞及其表达的实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
通过对体外传代培养的人血管起源平滑肌肉瘤细胞进行直接和脂质体Tfx-50包裹的人心钠素(ANF)基因表达质粒pcDNA3/ANF转染,并以非同位素地高辛标记的RNA分子探针对转染细胞中的ANFmRNA水平进行RNADotBlot分子杂交检测,同时利用放射免疫方法测定转染细胞培养上清中的ANF含量。结果显示,与未经脂质体Tfx50包裹的poDNA3/ANF直接进行细胞转杂及低浓度质体Tfx-50包裹 相似文献
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目的 了解癌基因c-myc分子中各个区域的作用,找出最佳的反义封闭靶区,为c-myc表达增高相关疾病的基因治疗提供依据。方法 系统地构建了人类3种反义c-myc重组逆转录病毒表达载体(aM1、aM2和aM3),分别载有c-myc和第1、2和3外显子的反义片段,经脂质体转染大鼠主动脉平滑肌细胞,并于转染后48h采用流式细胞仪对细胞进行瞬时表达检测。结果 与对照组相比,aM2使c-myc表达量减少了3 相似文献
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目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型p53基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型p53基因逆转录病毒载体,通过逆转录病毒载体介导,将野生型p53基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中,21d后观察其对新生内膜形成的影响,并检测p53蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型p53基因的重组逆转录病毒载体,并在体外细胞中表达;用逆转录病毒载体转导野生型p53基因至大鼠球囊损伤的颈动脉,免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型p53蛋白,且与对照组相比,损伤血管新生内膜/中层面积比降低了44%。结论人野生型p53基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用 相似文献
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将人β-珠蛋白基因(2.4kb),分别反向克隆入逆转录病毒载体N_2β和N_2A,并在N_2A3'LTR插入412bp的增强子HSⅡ(简称N_2AβE0.4)。将此两种逆转录病毒重组质粒分别转入(-2和PA317细胞,经G418筛选后,用PA317细胞产生的病毒粒子感染小鼠红白血病细胞MEL。结果显示,人β-珠蛋白基因可在MEL内得到表达,来自人HSⅡ(412bp)的增强子可以增强人β-珠蛋白基因mRNA的表达水平。 相似文献
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本研究连接合成了BQ123-多聚赖氨酸(BP)利用BQ123对血管平滑肌细胞(VSMC)膜表面内皮素A型受体(ETA)的高度选择性和多聚赖氨酸对DNA的强吸附作用,以BP携载含有β-半乳糖苷酶(β-LacZ)基因的表达质粒pSV-β-Galactosidase(pSV-β-LacZ)对培养的VSMC和内皮细胞(EC)转移基因。结果表明,BP具有向VSMC转基因性能,且依赖与靶细胞表面ETA的结合。 相似文献
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为探讨转染单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV tk)基因联合ganciclovir(GCV)治疗方案用于治疗冠状动脉成形术后再狭窄的可行性,构建了携带HSV tk基因的复制缺陷型逆转录病毒,利用该病毒将HSV tk基因转染至体外培养的血管平滑肌细胞(VSMC)和大鼠腹主动脉再狭窄模型的损伤动脉中,并均给予GCV,分别观察上述处理对VSMC的增殖和新生内膜的形成是否有抑制作用。结果:该方案使培养的VSMC增殖受抑制,抑制程度对GCV有剂量依赖关系;既往在恶性肿瘤中发现的旁观者效应,在培养的VSMC中也存在。同时,该方案使大鼠腹主动脉再狭窄模型的新生内膜面积减少。但单纯转染HSV tk基因或单纯应用GCV无论在体外还是在体内均无上述抑制作用。提示本基因治疗方案对人类冠脉成形术后再狭窄有治疗价值。 相似文献
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我们观察了不同浓度的胰岛素对体外培养人血管平滑肌细胞增殖的影响,及其该过程中原癌基因c-fos,c-myc的表达。结果表明,胰岛素能促进血管平滑肌细胞(SMC)增殖,即:SMC数目的增多,SMCDNA的合成;胰岛素能促进原癌基因c-fos和c-myc的异常表达;且以上作用均存在着剂量-效应关系。这些结果提示,高胰岛素血症促进动脉粥样硬化(AS)发生、发展可能是通过促进某些原癌基因异常表达,进而促进SMC增殖而实现的。这也许是某些基因治疗AS的基础。 相似文献
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目的 研究抗增殖性p21基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞(HVSMC)的增殖抑制作用及其作用机制。方法 通过腺病毒介导将外源性p21基因转入HVSMC,通过免疫印迹法(Western blot)检测p21基因的表达,原位末端标记法(TUNEL)、DNA片段梯度分析及流式细胞分析(FCM)观察靶细胞的细胞周期变化及凋亡,利用酶联免疫光度仪分析靶细胞的增殖抑制情况。结果 Western blot结果显示p21基因转染后的HVSMC可高水平表达p21蛋白,而另两组无表达。感染后5 d,Adp21组的细胞数为0.275 5±0.01(525 nm波长下吸光度A值),AdlacZ组为0.340 9±0.02,空白组为0.347 5±0.02,Adp21组较另两组的差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL、DNA片段梯度分析及FCM检测均提示靶细胞发生了凋亡。FCM检测还发现明显的细胞周期阻滞现象,Adp21组G0-G1期细胞比例为66.23%,S期细胞比例为10.18%,而另两组G0-G1期和S期细胞比例分别为:47.73%、30.56%和45.31%、32.34%。结论 复制缺陷性腺病毒在体外可有效介导外源性p21基因转染HVSMC,转染后的细胞除发生细胞周期阻滞外还出现明显的凋亡,其生长增殖受到抑制。 相似文献
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目的 了解癌基因c-myc分子中各个区域的作用,找出最佳的反义封闭靶区,为c-myc表达增高相关疾病的基因治疗提供依据。方法 系统地构建了人类3种反义c-myc重组逆转录病毒表达载体(aM1、aM2和aM3),分别载有c-myc第1、2和3外显子的反义片段,经脂质体转染大鼠主动脉平滑肌细胞,并于转染后48 h采用流式细胞仪对细胞进行瞬时表达检测。结果 与对照组相比,aM2使c-myc表达量减少了37.6%,aM1为对照组的98.8%,而aM3却使c-myc表达增高21.7%;与此同时,aM1和aM2组增殖细胞核抗原(PCNA)表达分别下降了36.0%和30.9%,而aM3组PCNA表达增高。DNA分析则表明3种载体均使处于G0/G1期的细胞比例略为增高(aM2>aM1>aM3),S 期比例略下降(aM1>aM2>aM3),但尚未有DNA合成量的明显改变。结论 反义基因的导入在瞬时表达时可影响细胞中靶蛋白及其他生长相关蛋白的表达,但对细胞周期和DNA合成的影响尚小。 相似文献
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目的研究乳腺癌C-erbB-2基因的过度表达,探讨该基因对乳腺癌诊断、鉴别诊断和预后判断的意义。方法乳腺癌标本98例,乳腺良性病变26例,正常乳腺组织10例,应用免疫组化SP法,检测癌基因C-erbB-2表达情况。结果乳腺癌C-erbB-2阳性率(59.2%)明显高于乳腺良性病变(3.9%)和正常乳腺组织(0%)(X2=27.06,P<0.01,X2=12.78,P<0.01)。乳腺癌中高恶性的浸润性导管癌、硬癌阳性率82.4%,75%,低恶性的小叶原位癌、粘液腺癌皆阴性,C-erbB-2过度表达与乳腺肿瘤大小、腋窝淋巴结转移明显相关(X2=7.06,P<0.01;X2=4.94,P<0.05),与雌激素、孕激素受体亦关系密切(X2=4.80,P<0.05;X2=3.91,P<0.05)。结论C-erbB-2基因过度表达可作为乳腺癌诊断、鉴别诊断和预后判断的有效指标。 相似文献
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目的 利用Dox-on可调控哺乳动物表达系统,建立起了受四环素类似物Doxycycline(Dox)紧密调控、表达AT2R基因的双重稳定血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC),在此基础上对纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)的表达受AngⅡ及其受体拮抗剂的影响进行研究.方法 建立Dox可调控表达AT2R基因的双重稳定大鼠VSMC细胞,观察该VSMC细胞中AT2R受调控表达情况,以及血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ,AngⅡ)及其1型、2型受体拮抗剂干预上述细胞后FN的mRNA及蛋白表达情况变化.结果 Dox-on可调控哺乳动物表达系统可成功介导AT2R基因在原代培养大鼠主动脉VSMC的表达,该表达受到Dox给予/去除的紧密调控;Dox干预可在48 h内迅速诱导该VSMC细胞表达AT2R,AT2R表达在Dox干预后72 h进一步增强(P<0.01).AT2R基因的可调控表达抑制由于AngⅡ干预VSMC后引起FN表达的增强(P<0.01).这一作用被AT1R拮抗剂CV-11974进一步增强(P<0.01);而被加入AT2R拮抗剂干预而取消;同时给予AT1R拮抗剂和AT2R拮抗剂时FN的表达与基础状态时的情况一致.结论 AngⅡ干预增强FN的表达,该作用是通过AT1R介导的;经Dox 诱导表达AT2R基因可以明显抑制这一生物学作用,说明在这一生物学效应上,AT2R具有与AT1R相拮抗的生物学功能. 相似文献