趋化因子FKN对外周血单核细胞NF-κB和TNF-α表达的影响及蛋白激酶C在其中的作用

[目的]对单核细胞合成核因子-κB(nuclear factor-KappaB,NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响,探讨趋化因子(fractalkine,FKN)-CX3CR1可能存在的信号转导机制及在动脉粥样硬化形成中的作用,并探讨了蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的介导作用.[方法]①Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞.②每份提取的单核细胞分为空白对照组、FKN、R031-8220(PKC特异性阻断剂)组.③免疫细胞化学法检测各组单核细胞中NF-κB的表达.④酶联免疫法检测各组培养液中TNF-α的表达水平.[结果]FKN、R031-8220与空白对照组的NF-κB的阳性细胞率分别为(34.80±2.69)%.(20.10±2.78)%与(3.80±0.95)%(三组间差异P＜0.05);TNF-α含量分别为(1506.1±69.3)pg/mL,(820.2±22.8)pg/mL,(80.5±5.5)pg/mL(三组间差异P＜0.05).[结论]FKN-CX3CR1能增加NF-κB、TNF-α单核细胞的表达:而FKN与CX3CR1结合以后,可能通过激活细胞内蛋白激酶C,进而诱导单核细胞合成NF-κB、TN-α.     

fractalkine影响动脉粥样硬化信号的转导机制及卡托普利的干预作用

目的:通过鸟苷酸结合蛋白（G-蛋白）对不规则趋化因子fractalkine（FKN）诱导单个核细 胞合成核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响,探讨FKN及其受体CX3CR1 可能存在的信号转导机制及卡托普利的干预作用。方法：将抗凝血用Ficoll密度梯度离心 法分离外周血单个核细胞,随机分为空白对照组、FKN组、PTX组、RO31-8220组、PDTC组及 卡托普利组,应用免疫组化检测各组单个核细胞中NF-κB表达情况,应用酶联免疫法检测各 组培养液中TNF-α的表达水平。结果：FKN组与空白组比较NF-κB 、TNF-α表达明显增多( P<0.05);G-蛋白阻断剂PTX组与FKN组比较NF-κB 、TNF-α表达明显减少(P<0.05); PKC阻断剂RO31-8220组与FKN组比较NF-κB 、TNF-α表达减少(P<0.05);NF-κB抑制剂PDTC组TNF-α表达较FKN组明显减少(P<0.05);卡托普利组较FKN组NF-κB 、TNF-α表达部分减少(P<0.05)。结论：FKN/CX3CR1有增加单个核细胞表达NF-κB、 TNF-α的作用;而卡托普利可通过减弱FKN/CX3CR1诱导单个核细胞合成NF-κB、 TNF-α,抑制炎症反应和抗动脉粥样硬化;FKN/CX3CR1影响动脉粥样硬化的信号转导机制可能是通过以下级联反应实现的：FKN+CX3CR1→G蛋白→PKC→NF-κB→TNF-α。     

IL-10对脂多糖诱导Ana-1细胞的MyD88/核因子κB活性影响的研究

目的探讨IL-10对小鼠巨噬细胞髓样分化因子88(MyD88)/核因子κB(NF-κB)炎症信号活化的影响。方法将小鼠巨噬细胞Ana-1分为脂多糖(LPS)组和LPS+IL-10组,分别于0.5、1及2h收集巨噬细胞和细胞培养上清液,Western blot检测细胞MyD88与胞浆、胞核NF-κBp65亚基表达,ELISA法检测培养上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果在0～2h,LPS组细胞MyD88表达显著持续上升,LPS+IL-10组于LPS刺激后上升,0.5h达峰值,2h恢复至正常水平,1h和2h相对含量均低于LPS组(11.6±1.3比17.5±0.7,8.8±0.3比21.4±1.8,P0.05);总NF-κB表达量在两组间无明显差异。NF-κB核浆比变化趋势与MyD88类似,LPS+IL-10组1h及2h相对含量亦均低于LPS组(1.1±0.1比2.4±0.4,0.6±0.7比3.1±0.6,P0.05);相应的,LPS+IL-10组1h和2hTNF-α含量亦低于LPS组[(222.5±33.5)pg/mL比(365.2±22.7)pg/mL,(212.7±15.9)pg/mL比(566.2±31.5)pg/mL,P0.05]。结论 IL-10通过抑制减少MyD88/NF-κB信号通路活化,降低TNF-α表达,从而下调炎症反应强度。     

积雪草苷对脂多糖诱导的RAW264.7细胞核转录因子κB活化及炎症反应的作用

目的探讨积雪草苷对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞核转录因子κB(NF-κB)活化及炎症因子表达的影响。方法用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测低、中、高浓度积雪草苷(终浓度分别为10-7、10-6及10-5mol/mL)对RAW264.7细胞增殖的影响,激光共聚焦显微镜观察积雪草苷对细胞NF-κB核转运的作用,ELISA法检测细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-1及IL-10的变化。结果低、中、高浓度积雪草苷对RAW264.7细胞增殖均无显著影响。积雪草苷明显抑制RAW264.7细胞NF-κB活化,抑制促炎因子TNF-α和IL-1的表达,同时上调抗炎因子IL-10的表达。空白组、模型组及积雪草苷低、中、高浓度干预组NF-κB转入细胞核百分率分别为(3.5±1.5)%、(75.7±9.1)%、(66.8±7.1)%、(58.9±9.0)%、(40.1±8.8)%,细胞上清TNF-α浓度分别为(171.12±35.42、1775.45±193.97、1284.63±162.13、1035.22±187.97、598.90±107.73)pg/mL,IL-1浓度为(5.66±0.98、26.93±3.48、22.41±2.84、17.05±1.70、10.64±1.29)ng/mL,IL-10为(25.23±2.17、71.75±8.31、82.82±6.00、98.70±8.84、119.97±9.13)pg/mL。结论积雪草苷可能通过抑制NF-κB信号通路,维持促炎系统与抗炎系统的平衡而发挥抗炎作用。     

抑制高迁移率组蛋白1对大鼠急性脊髓损伤后炎性反应的影响

目的探讨抑制高迁移率组蛋白1(HMGB1)对大鼠急性脊髓损伤(ASCI)炎性反应的影响。方法选择健康雄性Wister大鼠32只,随机分为正常组、假手术组、模型组、甘草酸(Gly)组,每组8只。正常组大鼠不予任何刺激,假手术组大鼠只咬除T10椎板,不损伤脊髓,模型组和甘草酸组大鼠采用改良Allen’s法制备T10不完全性急性脊髓损伤模型,甘草酸组给予200mg/kg甘草酸灌胃处理,每天1次,连用3天。术后3天取各组大鼠T10段脊髓,应用ELISA法检测脊髓组织HMGB1、核转录因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)水平,qRT-PCR法检测脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达量。结果ELISA结果显示,脊髓损伤后,模型组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β水平较正常组明显升高[(3139.33±68.89)pg/mL比(1977.42±19.08)pg/mL、(2420.16±30.45)pg/mL比(1390.88±15.32)pg/mL;(244.61±5.49)pg/mL比(103.35±2.20)pg/mL、(271.91±3.24)pg/mL比(138.90±3.34)pg/mL、(109.89±3.33)pg/mL比(47.44±1.94)pg/mL,P均<0.01];甘草酸组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β水平较模型组明显降低[(2566.91±23.75)pg/mL比(3139.33±68.89)pg/mL、(1728.55±24.27)pg/mL比(2420.16±30.45)pg/mL、(177.50±4.86)pg/mL比(244.61±5.49)pg/mL、(190.77±1.95)pg/mL比(271.91±3.24)pg/mL、(66.38±3.62)pg/mL比(109.89±3.33)pg/mL,P均<0.01]。RT-qPCR结果表明,模型组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平较正常组明显升高[(1.25±0.08)比(0.57±0.02)、(1.66±0.04)比(0.76±0.02)、(1.26±0.06)比(0.53±0.03)、(1.73±0.08)比(0.94±0.07)、(1.82±0.07)比(1.01±0.06),P均<0.01];甘草酸组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平较模型组明显降低[(0.79±0.03)比(1.25±0.08)、(1.14±0.04)比(1.66±0.04)、(0.75±0.03)比(1.26±0.06)、(1.37±0.04)比(1.73±0.08)、(1.31±0.04)比(1.82±0.07),P均<0.01]。结论 HMGB1至少部分参与介导ASCI炎性反应,并与HMGB1依赖的NF-κB信号通路密切相关,甘草酸可能通过抑制HMGB1/NF-κB通路减轻大鼠急性脊髓损伤后的炎性反应。     

曲格列酮对肿瘤坏死因子α诱导肾小球系膜细胞的作用及其机制

目的：探讨曲格列酮对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导肾小球系膜细胞增殖的影响及机制。方法将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分为空白组,TNF-α组、TNF-α+曲格列酮组,MTT法检测各组系膜细胞的增殖情况,ELISA法测定各组系膜细胞上清液中细胞间粘附分子1(ICAM-1)蛋白表达,免疫组化法测定各组系膜细胞核因子κB (NF-κB)的表达情况。结果 TNFα组肾小球系膜细胞6 h、12 h、24 h和48 h增殖的OD值分别为(0.198±0.025)、(0.241±0.028)、(0.286±0.030)、(0.267±0.042),空白组分别为(0.159±0.021)、(0.161±0.019)、(0.164±0.023)、(0.170±0.020),TTNF-α+曲格列酮组分别为(0.187±0.023)、(0.184±0.017)、(0.172±0.018)、(0.168±0.026),TNF-α组肾小球系膜细胞增殖的OD值明显高于空白组,TNF-α+曲格列酮组明显低于TNF-α组,差异均有统计学意义(P<0.05);TNF-α组肾小球系膜细胞NF-κB蛋白阳性率为(62.34±10.26)%,空白组为(29.97±4.88)%,TNF-α+曲格列酮组为(45.67±8.36)%,TNF-α组肾小球系膜细胞NF-κB蛋白阳性率明显高于空白组,而TNF-α+曲格列酮组则明显低于TNF a组,高于空白组,差异均有统计学意义(P<0.05);TNF-α组肾小球系膜细胞ICAM-1蛋白浓度为(967.8±77.4) pg/mL,空白组为(571.2±69.6) pg/mL,TNFα+曲格列酮组为(787.5±81.2) pg/mL,TNF-α组肾小球系膜细胞ICAM-1蛋白浓度明显高于空白组,TNF-α+曲格列酮组明显低于TNF-α组,但仍高于空白组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TNF-α能够促进肾小球系膜细胞增殖,促进NF-κB蛋白和ICAM-1蛋白表达,曲格列酮能够抑制肾小球系膜细胞增殖,降低NF-κB蛋白和ICAM-1蛋白表达。     

蒺藜皂苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织PPARγ和NF-κB炎症信号途径表达的影响

目的探讨蒺藜皂苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和核因子κB(NF-κB)炎症信号途径表达的影响,并进一步探讨其潜在的机制。方法将40只SD大鼠依据随机数字表法分为假手术组、模型组和蒺藜皂苷低剂量组和高剂量组,每组10只,采用线栓法制备大鼠脑缺血/再灌注损伤模型。脑缺血/再灌注24 h后检测大鼠神经功能损伤评分;酶联免疫吸附测定法检测大鼠脑组织NF-κB、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素(IL)1β的水平;免疫印迹法检测大鼠脑组织PPARγ蛋白表达水平。结果与模型组比较,蒺藜皂苷治疗低剂量组和高剂量组大鼠神经功能损伤明显减轻[(1.8±0.7)分、(1.3±0.5)分比(2.3±0.7)分],差异有统计学意义(P<0.05);与模型组NF-κB、TNF-α、IL-1β[(18.4±1.5)μg/mg、(916±128)pg/mg、(169±16)pg/mg]比较,蒺藜皂苷低剂量[(16.4±1.3)μg/mg、(257±110)pg/mg、(148±16)pg/mg]和高剂量组[(15.0±1.2)μg/mg、(665±72)pg/mg、(139±14)pg/mg]缺血脑组织NF-κB、TNF-α和IL-1β水平明显降低(P<0.05)。结论蒺藜皂苷可能通过激活PPARγ的表达,进而抑制NF-κB炎症信号途径,抑制炎性因子的表达,降低炎症反应,从而减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤而发挥其神经保护作用。     

NF-κB抑制剂对脂多糖刺激的退变人椎间盘髓核细胞炎症因子表达的影响

目的 观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激退变人椎间盘髓核细胞前后,核因子kappB(NF-κB)与炎症因子表达及相互关系.方法 体外培养退变的人椎间盘髓核细胞,设立对照组、LPS (500 μg/mL)刺激组、NF-κB抑制剂(BAY11-7082)+LPS(500 μg/mL)刺激组.ELISA方法检测各组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β的含量,免疫荧光法检测各组髓核细胞内p65的表达及定位,Western blot检测TNF-α、IL-1β、NF-κB结合蛋白p65以及磷酸化p-p65的表达,Real-time PCR检测TNF-α及IL-1β的表达.结果 LPS刺激髓核细胞后,p65入核增多,p-p65表达明显增加,ELISA实验结果表明LPS刺激组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平升高(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显上升(P＜0.05);而与LPS刺激组相比,NF-κB抑制剂+LPS刺激组p65入核减少,p-p65表达明显降低,细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平降低(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显下降(P＜0.05).结论 LPS能够通过激活人退变髓核细胞NF-κB信号通路,促进炎性因子TNF-α及IL-1β表达增多,抑制NF-κB信号通路后可明显减轻炎性因子的表达.     

FKN、PI3K及NF-κB对人外周血单个核细胞IL-6表达的的影响及缬沙坦的干预作用

目的探讨不规则趋化因子Fractalkine(FKN)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、核因子κB(NF-κB)对外周血单个核细胞(PBMC)IL-6表达的影响及缬沙坦的干预作用,研究FKN影响IL-6表达的信号转导机制。方法利用密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞,将提取的PBMC分为7组:空白对照组、FKN组、LY294002组(PI3K抑制剂)、PDTC组(NF-κB抑制剂)、FKN+缬沙坦组、FKN+LY294002组、FKN+PDTC组,后二组在FKN诱导PBMC细胞前分别由LY294002、PDTC预处理。各组PBMC分别在12 h和24 h后,用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组细胞培养液中的IL-6表达。结果培养12 h后,与对照组比较,FKN组IL-6明显降低(P<0.05),LY294002组和PDTC组无明显差异(P>0.05);与FKN组比较,FKN+缬沙坦组IL-6明显降低(P<0.05),FKN+LY294002组IL-6明显升高(P<0.05)、FKN+PDTC组IL-6明显降低(P<0.05)。培养24 h后,各组IL-6表达无明显差异(P>0.05)。结论 FKN对人外周血单个核细胞IL-6的表达具有双向调节作用,通过PI3K途径抑制IL-6的表达,而通过NF-κB途径促进IL-6的表达,总体上FKN可以抑制IL-6的表达。缬沙坦可增加FKN抑制IL-6表达的作用。     

CX3CR1多态性与中药治疗2型糖尿病肾病尿蛋白疗效的关系

目的观察CX3CR1-V249I基因多态性与中药治疗2型糖尿病肾病疗效的关系。方法糖尿病肾病患者108例随机分为对照组(西医治疗)和中药组(西医治疗联合中药参芪地黄汤加减),予相应治疗3个月。全部患者治疗开始前均接受CX3CR1-V249I基因多态性检测。治疗前、后检测糖化血红蛋白、尿白蛋白、尿α1微球蛋白(α1MU)、血β2微球蛋白(β2MU)、趋化因子Fmetalkine(FKN)、核因子-κb(NF-κb)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。结果 108例中CX3CR1-V249I野生型(VV)87例,突变型(Ⅵ+Ⅱ)21例。治疗后两组不同基因型患者尿白蛋白、尿α1MU、血β2MU较治疗前均有明显下降(P0.05)。中药组突变型疗效明显优于对照组突变型[尿白蛋白:(642.7±42.1)mg/L比(815.4±59.7)mg/L,P0.05;尿α1MU:(73.21±10.06)mg/L比(84.5±11.01)mg/L,P0.05;血β2MU:(37.42±9.04)mg/L比(51.12±10.57)mg/L,P0.05]。中药组治疗后血清NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量较治疗前明显减少(P0.05);与对照组突变型比较,中药组突变型患者下降更明显,差异有统计学意义[NF-κb:(0.32±0.07)ng/m L比(0.53±0.09)ng/m L,P0.05;FKN:(0.75±0.09)ng/m L比(0.91±0.14)ng/m L,P0.05;IL-6:(121.21±22.65)pg/m L比(140.26±22.1)pg/m L,P0.05;TNF-α:(57.16±8.31)ng/m L比(69.12±16.55)ng/m L,P0.05]。结论参芪地黄汤能有效减少2型糖尿病肾病患者尿白蛋白、尿α1MU、血β2MU、FKN、NF-κb、IL-6、TNF-α含量,保护肾脏组织,这一作用在CX3CR1-V249I突变型患者中更加明显。     

益肺活血方对香烟提取物诱导巨噬细胞炎症反应的影响

目的探讨益肺活血方对香烟提取物诱导巨噬细胞炎症反应的影响。方法用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇将U937细胞诱导为巨噬细胞,用1.2、2.4、4.8、9.6 g/L的益肺活血方及5、10、20、50、100 mL/L的香烟提取物处理巨噬细胞,于12、24、48 h用细胞增殖和毒性检测(CCK-8)法测定细胞活性。巨噬细胞分5组:正常细胞组、香烟提取物组、香烟提取物+益肺活血方低、中、高浓度组,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测培养上清白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,RT-PCR法检测胞内IL-8和TNF-αmRNA水平。机制实验分4组:正常细胞组、香烟提取物组、香烟提取物+益肺活血方(2.4 g/L)组及香烟提取物+NF-κB抑制剂组,蛋白印迹法(Western blot)检测胞内核转录因子-κB(NF-κB)p50、p65及p-IκB表达;免疫荧光法观察胞核内NF-κB p65及胞浆内p-IκB表达。结果益肺活血方(9.6 g/L)作用细胞24、48 h后及香烟提取物(100 mL/L)于各时间点均有细胞毒性(P0.05)。与正常细胞组相比,香烟提取物组IL-8及TNF-α表达上调,胞内NF-κB p50、p65及p-IκB表达亦升高(P0.05),NF-κB核转位增加(P0.05);益肺活血方可抑制诱导后的IL-8和TNF-α的表达以及NF-κB活性(P0.05)。结论益肺活血方可减少香烟提取物诱导的巨噬细胞表达IL-8、TNF-α,抑制NF-κB活化可能是其机制之一。     

肿瘤坏死因子α对肠上皮细胞株HT-29的核转录因子κB信号通路的激活作用研究

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肠上皮细胞株HT-29的核转录因子κB(NF-κB)信号通路的激活作用及鼠尾草酚对TNF-α诱导HT-29的NF-κB激活的影响。方法:将HT-29细胞分为空白对照组、TNF-α组和低、中、高剂量鼠尾草酚组。用CCK-8法检测HT-29细胞活力;Western-blot方法检测IκBα、Pi-IκBα和PiIKKα/β蛋白表达;用NF-κB转录活性试剂盒检测HT-29细胞NF-κB转录活性。结果 :实验各组的HT-29细胞活力比较无显著性差异(P>0.05);TNF-α刺激可诱导HT-29的IκBα磷酸化及降解;鼠尾草酚能使TNF-α诱导HT-29的IKKα/β和IκBα磷酸化显著受抑制(均P<0.05),并且可显著降低NF-κB的转录活性(P<0.05)。结论:TNF-α可激活HT-29的NF-κB经典信号通路,鼠尾草酚对TNF-α诱导的NF-κB激活有抑制作用。     

脓毒症大鼠肿瘤坏死因子-a、内皮素-1、核因子kB表达与心肌损伤及药物影响的研究

目的探讨米力农注射液对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用及其可能机制.方法 SD雄性大鼠45只,按随机数字分为对照组、假手术组、模型组及米力农小剂量组、大剂量组.采用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症模型,24 h后取动脉血及左室心肌,检测血清心肌肌钙蛋白I(cTn)I、心肌同工酶CK-MB,心肌组织匀浆上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)及内皮素-1(ET-1)水平,观察心肌组织病理学改变.结果模型组血清cTnI、CK-MB及心肌TNF-α、ET-1、NF-κB水平较正常对照组明显升高;[cTnI(μg/L)]:(19.425±0.637)比(1.015±0.210);[CK-MB(μg/L)]:(4970.50±562.56)比(423.67±21.92);[TNF-α(pg/L)]:(956.70±72.61)比(239.63±37.21),[ET-1(pg/L)]:(786.92±126.30)比(175.12±28.35),[NF-kB(μg/mL)]:(53.96±11.29)比(11.84±2.95);均P<0.01.米力农小剂量组血清cTnI,CK-MB及TNF-α,ET-I、NF-kB水平与模型组比较差异无统计学意义;[cTnI(ug/L)]:(15.572±0.398)比(19.425±0.637);[CK-MB(μg/L)]:(4698.52±501.52)比(4970.50±562.56);[TNF-α(pg/L)]:(912.50±96.67)比(956.70±72.61);[ET-1(pg/L)]:(716.52±63.71)比(786.92±126.30),[NF-kB(μg/mL)]:(47.39±12.35)比(53.96±11.29);均P>0.05.米力农大剂量组血清cTnI、CK-MB及心肌TNF-α、ET-1、NF-kB较模型组明显降低,[cTnI(μg/L)]:(3.520±0.267)比(19.425±0.637);[CK-MB(μg/L)]:(3920.00±516.49)比(4 970.50±562.56);[TNF-α(pg/L)]:(442.53±75.67)比(956.70±72.61);[ET-1(pg/L)]:(279.42±37.59)比(786.92±126.30),[NF-κB(μg/mL)]:(21.18±8.19)比(53.96±11.29);均P<0.01.结论大剂量米力农对脓毒症心肌损伤具有保护作用,其机制可能通过抑制心肌TNF-α、ET-1、NF-κB的表达而实现;小剂量米力农对脓毒症心肌损伤无保护作用.     

电刺激小脑顶核对局灶脑缺血再灌注大鼠脑组织核因子-κB/p65、TNF-α蛋白和基因表达的影响

目的观察电刺激小脑顶核干预对局灶性缺血再灌注大鼠脑组织核因子-κB/p65(NF-κB/p65)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白和基因表达的影响及其对中枢神经元保护的作用机制。方法 2014年9月—2015年9月在重庆医科大学神经病学实验室进行。Wistar大鼠60只随机分为假手术组(NC组)、缺血再灌注组(I/R组)、电刺激小脑顶核组(FNS组),每组20只,采用线栓法制作脑缺血再灌注动物模型,FNS组予以电刺激小脑顶核干预,造模或干预成功后处死大鼠取脑组织,分别采用免疫组织化学法和RT-PCR检测各组NF-κB/p65、TNF-α的表达。结果与NC组比较,I/R组NF-κB/p65、TNF-α蛋白表达增加(q=0.032、0.020,P<0.05);与I/R组比较,FNS组NF-κB/p65、TNF-α的表达明显降低(q=0.182、0.013,P<0.05)。与NC组比较,L/R组NF-κB/p65mRNA和TNF-αmRNA表达量明显增高(P<0.05);与I/R组比较,FNS组NF-κB/p65 mRNA和TNF-αmRNA表达量明显减少(P均<0.05)。结论电刺激小脑顶核抑制NF-κB/p65的活化和TNF-α的转录,NF-κB/p65的活化抑制和表达减少及所致的TNF-α表达下调可能是其发挥中枢神经源性保护作用的机制之一。     

趋化因子FKN对人外周血单个核细胞IL-8表达的影响及ERK、PI3K和NF-κB在其中的作用

目的：通过研究趋化因子Fractalkine（FKN）对人外周血单个核细胞IL-8表达的影响,以及信号分子细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）、核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）在其中的作用,探讨FKN促进动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的机制。方法利用密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞;将提取的单个核细胞分为：空白对照组、FKN组、PD98059（ERK阻断剂）组、LY294002（PI3K阻断剂）组、PDTC（NF-κB阻断剂）组、FKN＋PD98059组、FKN＋LY294002组、FKN＋PDTC组;分别于培养12 h和24 h后收集细胞培养上清,应用ELISA检测各组单个核细胞中IL-8的表达情况。结果（1）细胞培养12 h或24 h后,PD98059组、LY294002组和PDTC组与空白组比较,IL-8表达有减少趋势,但差异无显著性意义（P＞0.05）。（2）FKN组较空白组IL-8表达明显减少（P＜0.05）,FKN＋PD98059组和FKN＋LY294002组较FKN组IL-8表达明显增加（P＜0.05）,FKN＋PDTC组较FKN组、FKN＋PD98059组和FKN＋LY294002组IL-8表达均明显减少（P＜0.05）。（3）细胞培养24 h后,各组IL-8表达均较12 h明显减少（P＜0.05）。结论趋化因子FKN可能通过ERK、PI3K信号途径抑制单个核细胞IL-8的表达,而通过NF-κB途径促进IL-8的表达,FKN对单个核细胞IL-8的表达具有双向调节作用,但以抑制作用为主。     

核因子-κB在TNF-α诱导HL-60细胞凋亡中的作用

目的　了解白血病细胞系 HL- 60中 ,肿瘤坏死因子 - α( TNF- α)诱导的核因子 - κB( NF- κB)活化与细胞凋亡之间的关系。方法　采用脂质体基因转染技术 ,将突变的核因子抑制蛋白 ( IκBα)质粒 ( p CMV4- IκBαS32 / 36 A)转染 HL-60细胞 ,于 48h后测其瞬时表达效应。用间接免疫荧光和 Western blot技术检测转染组和非转染组 HL- 60细胞的 NF-κB活化状态 ,同时用流式细胞术和 MTT法分别检测 TNF- α对两组 HL- 60细胞的凋亡诱导及生长抑制效应。结果　TNF- α可诱导非转染组 HL- 60细胞的 NF- κB活化 ,不能诱导转染组细胞的 NF- κB活化 ,即突变型 IκBα可特异性抑制HL- 60细胞的 NF- κB活化。结论　用突变型 IκBα特异性抑制 HL- 60细胞的 NF- κB活化 ,能明显增加其对 TNF- α的敏感性     

干扰素α抑制NF-κB活化增强TNF-α诱导的Hela细胞凋亡

目的探讨干扰素α(IFN-α)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及TNF-α诱导核转录因子NF-κB活化的影响。方法细胞分为空白对照组(不加TNF-α),实验组(加TNF-α)、实验组终浓度分别为(5,10,15ng/ml),作用不同时间分为6,12,24 h,与干扰素α(终浓度100IU/ml)共培养2 h,再加入终度与上述相同的TNF-α继续培养3 h,应用免疫组化,免疫印迹方法检测NF-κB活性的变化,采用Tunel法检测细胞凋亡。结果TNF-α诱导Hela细胞凋亡与其诱导NF-κB活化明显相关,100 IU/ml的IFN-α能显著增强TNF-α诱导Hela细胞凋亡和抑制TNF-α诱导的Hela中NF-κB的活化。细胞凋亡增加率为69.2%(P<0.05),NF-κB活化抑制率为48.0%(P<0.05)。结论TNF-α诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的同时激活NF-κB;IFN-α可通过抑制NF-κB活化,增强TNF-α诱导Hela细胞凋亡的作用。     

TNF-α激活NF-κB信号通路抑制培养成纤维细胞SDF-1α分泌

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活核因子-κB(NF-κB)信号通路对成纤维细胞生物学行为的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行体外培养,将细胞分为TNF-α组、TNF-α+吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)组及对照组,处理后的细胞采用CCK-8方法检测细胞增殖情况、Western blot和细胞免疫荧光检测IκBα蛋白表达与定位、ELISA检测基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的分泌。结果 TNF-α在一定浓度范围内对成纤维细胞起到明显的促增殖作用,CCK-8检测显示TNF-α组在不同浓度和不同时相点MEF的光密度值与TNF-α+PDTC组及对照组相比差异显著(P<0.05);免疫荧光染色显示IκBα主要分布于细胞质,TNF-α组与对照组和TNF-α+PDTC组相比,IκBα荧光强度明显减弱。Western blot结果发现TNF-α刺激后30 min,TNF-α组和TNF-α+PDTC组IκBα蛋白表达[(3 070.0±39.0)vs(1 421.7±75.3),(3 212.2±57.5)vs(1 468.2±45.8),P<0.05]均降至最低值,随时间推移逐渐恢复,TNF-α+PDTC组IκBα蛋白表达显著高于TNF-α组[(3 112.3±89.7)vs(2 610.4±26.9),P<0.05];ELISA检测发现TNF-α作用后成纤维细胞SDF-1α的分泌呈减少趋势[(15.9±1.6)vs(12.7±0.6),P<0.05],TNF-α+PDTC组则能显著逆转TNF-α作用[(23.5±3.2)vs(15.0±1.2),(21.6±0.4)vs(12.7±0.6),P<0.05],促进SDF-1α分泌。结论 TNF-α能通过激活NF-κB通路,影响小鼠胚胎成纤维细胞的增殖并抑制SDF-1α分泌。     

益气活血利湿汤对糖尿病视网膜病变模型大鼠炎症因子及视神经保护作用

目的观察益气活血利湿汤对糖尿病视网膜病变模型大鼠炎症因子及视神经保护作用的影响。方法 10只SD大鼠为对照组,40只SD大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素和玻璃体腔注射血管内皮生长因子(VEGF)建立大鼠糖尿病视网膜病变模型,再采用随机数字表法分为模型组,益气活血利湿汤高、中、低剂量组,每组10只,模型组和空白对照组给予蒸馏水灌胃,益气活血利湿汤高(2.0g·kg~(~(-1))·d~(-1))、中(1.0g·kg~(-1)·d~(-1))、低(0.5g·kg~(-1)·d~(-1))剂量组给予益气活血利湿汤溶液煎煮液灌胃。治疗8周后观察大鼠视网膜和视神经结构,采用ELISA检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)和白细胞介素-6(IL-6)水平,RT-PCR检测大鼠视网膜神经生长因子(NGF)和核因子-κB(NF-κB)mRNA表达。结果模型组大鼠视网膜出现水肿和扩张充血毛细血管;益气活血利湿汤低剂量组大鼠视网膜水肿,结构紊乱,血毛细血管扩张充,有新生血管;中剂量组视网膜结构相对完整,水肿明显减轻;高剂量组视网膜结构基本完整,未见明显水肿、毛细血管扩张充血和新生血管。模型组大鼠神经纤维排列紊乱,轴突重度肿胀,多处毛细血管扩张出血,胶质细胞增生;益气活血利湿汤低剂量组大鼠视神经纤维排列不规则,轴突肿胀减轻;中剂量组视神经纤维轴突肿胀明显减轻,偶见毛细血管扩张出血和胶质细胞增生;高剂量组视神经纤维排列整齐规则,结构较致密,未见毛细血管扩张出血和胶质细胞增生。与空白对照组比较,模型组大鼠血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平明显升高[TNF-α:(23.46±2.64)pg/mL比(12.34±2.18)pg/mL;hsCRP:(8.69±1.05)pg/mL比(3.64±0.67)pg/mL;IL-6:(97.61±5.12)pg/mL比(31.26±3.26)pg/mL,P0.05],视网膜NGF和NF-κB mRNA表达显著下调[NGF:(0.27±0.12)比(0.86±0.08);NF-κB:(0.32±0.11)比(0.91±0.09),P0.05]。与模型组比较,益气活血利湿汤低、中、高剂量组大鼠血清TNF-α、hs-CRP、IL-6水平显著降低[TNF-α:(19.39±2.47)pg/mL、(15.16±2.39)pg/mL、(13.27±2.32)pg/mL比(23.46±2.64)pg/mL;hs-CRP:(6.78±0.86)pg/mL、(5.04±0.81)pg/mL、(4.29±0.71)pg/mL比(8.69±1.05)pg/mL;IL-6:(74.66±4.89)pg/mL、(56.37±4.56)pg/mL、(40.45±4.35)pg/mL比(97.61±5.12)pg/mL,P均0.05],视网膜NGF和NF-κB mRNA表达显著上调[NGF:(0.41±0.09)、(0.62±0.08)、(0.79±0.07)比(0.27±0.12);NF-κB:(0.48±0.10)、(0.63±0.08)、(0.85±0.09)比(0.32±0.11),P均0.05]。结论益气活血利湿汤能改善糖尿病视网膜病变大鼠视网膜和视神经结构,减轻炎症反应,上调NGF和NF-κB表达。     

高密度脂蛋白对氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪细胞TNF-α表达的影响

目的观察高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)刺激下3T3-L1脂肪细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表达的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 3T3-L1脂肪细胞促分化成熟后,oxLDL刺激脂肪细胞,给予不同浓度的HDL(10～100μg/ml),及H-89(10μmol/L)+HDL(100μg/ml)干预,收集细胞,测定脂肪细胞TNF-αmRNA表达水平,IκB蛋白浓度及核因子-κB(NF-κB)活性。结果 OxLDL刺激使3T3-L1脂肪细胞TNF-αmRNA表达及NF-κB活性明显增强。HDL浓度依赖性抑制TNF-αmRNA表达、NF-κB活化和IκB降解。与oxLDL刺激组比较,100μg/ml HDL使TNF-αmRNA表达降低64.5%,NF-κB活性减少49%,并明显增加IκB蛋白水平。HDL的这些抗炎效应能被蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89部分抑制。结论HDL能抑制oxLDL诱导的3T3-L1脂肪细胞TNF-αmRNA表达,PKA-IκB-NF-κB信号通路是其中作用途径之一,该效应不需要HDL与oxLDL的直接接触作用。