微囊化培养对肝细胞增殖生长和功能表达的影响

背景:前期研究证实,肝细胞在微囊化培养过程中结构形态发生变化,细胞的骨架会发生重排.目的:在前期研究基础上,进一步考察微囊化培养体系对细胞生长和功能表达的影响.方法:采用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化人肝癌细胞系HepG2细胞,通过显微观察、苏木精-伊红染色、MTT实验、Realtime RT-PCR与Elisa实验,检测微囊内细胞的生长形态、细胞团的形态结构、细胞的活性、以及细胞的功能表达情况.结果与结论:HepG2细胞在微囊内聚集成团,以三维方式生长,细胞间连接紧密,与传统的平面培养相比,微囊化细胞的生长速率减慢,但微囊化细胞的功能基因表达水平及白蛋白的分泌量增高,说明海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊所提供的微环境有利于肝细胞类组织的体外构建.结果也提示海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊能够实现肝细胞的体外类组织化培养,有望成为一种更具前景的三维培养模式,应用于癌症治疗、高通量药物筛选以及肝组织工程的研究.     

微囊化培养对肿瘤细胞耐药性的影响☆

背景:在微胶囊微环境中肿瘤细胞表现出更接近在体肿瘤的特性。目的:考察微囊化培养对肿瘤细胞耐药性的影响。方法:将平面培养至对数生长期的HepG2细胞微囊化培养15d,再次包封于微胶囊内进行微囊化培养,如此反复3次。回收每次微囊化培养的细胞,并通过显微镜、流式细胞仪、CCK-8和Real Time PCR检测细胞形态、黏附能力、增殖能力、细胞周期、药物敏感性和耐药相关基因的变化。结果与结论:微囊化培养不同次数的细胞再次进行平面培养,其形态、黏附能力、增殖能力和细胞周期均无显著变化。经过微囊化培养后再次进行平面培养,肿瘤细胞的耐药性随着微囊化培养次数的增加而逐渐下降,且耐药性降低的主要原因是耐药相关基因表达下调。提示只有在微胶囊这一独特微环境中肿瘤细胞才能保持高的耐药性,一旦回归平面培养,这一特性便会消失,肿瘤细胞只有在微囊化环境中培养才能表现出类似在体的耐药性。     

微囊化人肝细胞移植对小鼠急性肝衰竭的治疗作用

目的:评价微囊化人源性肝细胞腹腔内移植对四氯化碳诱导的小鼠急性肝功能衰竭的治疗作用,为微囊化异种肝细胞在肝细胞移植的临床应用提供实验依据。方法:实验于2005-02/2006-01在中国科学院大连化学物理研究所,生物技术部生物医学材料工程实验室完成。①采用自制静电液滴发生器制备海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠胶囊,应用四氯化碳腹腔注射建立急性肝功能衰竭动物模型,以谷草转氨酶、谷丙转氨酶高出正常值10倍以上作为判定肝功能衰竭的具体标准。②取造模成功的急性肝衰竭小鼠90只,随机分为空囊组、微囊化细胞组、游离细胞组,30只/组。各组均于注射四氯化碳24h后进行移植实验:空囊组腹腔注射含有空囊的生理盐水,微囊化细胞组腹腔注射微囊化肝细胞悬液,游离肝细胞组腹腔注射游离肝细胞悬液,均1mL/只。③每组随机取出10只用于观察8d存活率,其余小鼠分别于移植后1,2,4,8d经眼球后静脉丛采血,进行肝功能检测谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平,每组5只/次。并回收微胶囊观察其形态,对回收的微囊化细胞进行组织切片细胞活性观察。结果:成功建立急性肝衰竭模型的90只小鼠全部进入结果分析。①移植后不同时间点各组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平的变化:移植后第1,2天,微囊化细胞组的两种转氨酶水平均显著低于游离细胞组和空囊组(P<0.05)。到移植后第8天各组间转氨酶水平基本相似(P>0.05)。②各组小鼠移植8d存活率的比较:微囊化细胞组小鼠的存活率显著高于空囊组、游离细胞组(90.0%,50.0%,60.0%,P<0.05)。③腹腔移植微胶囊的形态及囊内细胞活性观察结果:回收的微胶囊形态完整光滑,未见明显的纤维包裹,囊内细胞呈圆形,细胞膜完整光滑,胞浆饱满,仍有90%以上肝细胞存活。结论:微囊化人源性肝细胞腹腔内移植可以提高药物诱导急性肝衰竭小鼠的存活率,改善急性肝衰小鼠的肝脏功能。提示生物微胶囊可以有效阻断免疫排斥作用,保护移植的肝细胞,有利于其发挥生物功能。     

牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响

目的:微胶囊中存在一定程度的高渗透压胁迫,可造成细胞生长代谢减慢,为改善微囊化肝细胞的生长,尝试应用抗渗透压胁迫物质牛磺酸,观察其对微囊化肝细胞生长的影响.方法: 实验于2006-07/08在中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程实验室完成.将HepG2细胞悬液(非微囊化细胞)和微囊化HepG2分别接种于牛磺酸浓度为0,0.6,0.8和1.2 mmol/L的MEM培养液中,在37 ℃体积分数为0.05的CO2中培养.MTT法测定非微囊化和微囊化HepG2细胞的生长活性,相差显微镜观察囊内细胞生长状态.结果:①非微囊化HepG2细胞:0.6,0.8和1.2 mmol/L的牛磺酸对其生长无影响,吸光度值比较差异无显著意义(P > 0.05).②微囊化HepG2细胞:0.6,0.8 mmol/L牛磺酸对微囊化肝细胞的生长亦无影响(P > 0.05);但1.2 mmol/L牛磺酸可以显著改善微囊化肝细胞的生长,其吸光度值高于0 mmol/L牛磺酸组(P < 0.05),并促进细胞的聚集.结论:1.2 mmol/L牛磺酸可以改善微囊化肝细胞的生长并抵制微囊内的高渗透压胁迫对细胞的生长抑制作用.     

体外培养和冷冻保存对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响

背景：微囊化基因工程细胞移植治疗需要制备大量的细胞活性良好、重组蛋白表达量高的生物微胶囊，体外培养和冷冻保存足生物微胶囊制备过程中两个重要的环节。目的：考察体外培养时间和冷冻保存对微囊化细胞在动物体内生长和内皮抑素表达的影响及体外培养时间对微囊化细胞冷冻保存的影响。设计、时间及地点：于2006—04／10在大连化学物理研究所生物医用材料实验室完成实验。材料：海藻酸钠与聚赖氨酸为美困Sigma公司产品。方法：将微囊化的重组内皮抑素绌胞分装于24孔板中；每孔分装0．1mL微胶囊，加入DMEM／F12培养液2mL。微囊化细胞在37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中培养。每2d采用MTT法测微囊内的活细胞密度，并收集培养上清测内皮抑素表达量。主要观察指标：微囊化细胞生长情况和内皮抑素表达量。结果：体外培养时阃对微囊化细胞在动物体内生长、内皮抑素表达和微囊稳定性具有较大的影响，体外不培养和培养4d的微囊化细胞在小鼠腹腔内生长良好、内皮抑素表达量高，并且微囊稳定性好，而体外培养8d的微囊化细胞在移植后的第26天破裂。体外培养时问对微囊化细胞冷冻保存也具有较大的影响，体外培养4和8d的微囊化细胞存液氮中冷冻保存40d，复蓐后细胞生长良好、内皮抑素表达量高，而冻存前未经过体外培养的微囊化细胞，复苏后细胞几乎全部死亡。结论：生物微胶囊在体外比较适宜的培养时间为4d。并且冷冻保存对微囊化细胞在动物体内生长、内皮抑素表达和微囊稳定性没有显著的影响。     

海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植改善帕金森病模型鼠的旋转行为

背景:细胞组织的微囊化移植是近年来帕金森病治疗的研究热点之一,目前发展较成熟、应用较多的是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊,但其易于囊周纤维化、易破碎等缺点,使其临床应用受到了限制。应用国内研制的新型微胶囊材料海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊将PC12细胞微囊化后移植入帕金森病模型鼠纹状体内,观察其作用。目的:观察海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植治疗,改善帕金森病模型大鼠旋转行为的作用。设计:随机对照动物实验。单位:吉林大学第二医院和中国科学院大连化学物理研究所。材料:成年雄性Wistar大鼠40只,体质量(220±10)g;海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊;PC12细胞。方法:实验于2002-05/12在吉林大学第二医院动物实验室和中国科学院大连化学物理研究所完成。①应用国产新型材料壳聚糖制成的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞。②将成功建立的23只帕金森病大鼠模型随机分为3组,微囊化PC12细胞组10只、裸PC12细胞组7只、空微胶囊组6只。分别将海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞、裸PC12细胞、空微胶囊移植入帕金森病模型鼠损伤侧纹状体内。③以阿朴吗啡检测移植前后大鼠旋转行为的差异。观察黑质及纹状体内微包囊的形态并检测微胶囊内细胞的活性。主要观察指标:①移植前后大鼠的旋转行为。②黑质和纹状体的病理形态。③回收的微包囊的完整性及囊内PC12细胞的活性。结果:①微囊化PC12细胞移植组在移植4周时旋转行为显著低于移植前和空微囊移植组犤(6.9±2.8),(11.7±5.5),(10.5±1.6)r/min,P<0.05犦,症状改善至少持续3个月;裸PC12细胞移植组大鼠的旋转行为与移植前相比也有改善犤(5.6±1.1),(9.5±1.5)r/min,P<0.05犦,但仅持续了2个月,且部分大鼠颅内有致死性肿瘤形成。空微囊移植组移植前后大鼠的旋转行为无明显差异。②回收微胶囊内的PC12细胞再培养生长良好,并且具有生物活性。结论:微囊化PC12细胞脑内移植能够改善阿朴吗啡诱发的帕金森病模型鼠的旋转症状,海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠新型微胶囊具有免疫隔离和抑制肿瘤形成的作用,有着广泛的临床应用前景。     

微囊化人肝细胞移植对小鼠急性肝衰竭的治疗作用

目的：评价微囊化人源性肝细胞腹腔内移植对四氯化碳诱导的小鼠急性肝功能衰竭的治疗作用，为微囊化异种肝细胞在肝细胞移植的临床应用提供实验依据。 方法：实验于2005-02／2006-01在中国科学院大连化学物理研究所，生物技术部生物医学材料工程实验室完成。①采用自制静电液滴发生器制备海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠胶囊，应用四氯化碳腹腔注射建立急性肝功能衰竭动物模型，以谷草转氨酶、谷丙转氨酶高出正常值10倍以上作为判定肝功能衰竭的具体标准。②取造模成功的急性肝衰竭小鼠90只，随机分为空囊组、微囊化细胞组、游离细胞组，30只／组。各组均于注射四氯化碳24h后进行移植实验：空囊组腹腔注射含有空囊的生理盐水，微囊化细胞组腹腔注射微囊化肝细胞悬液，游离肝细胞组腹腔注射游离肝细胞悬液，均1mL／只。③每组随机取出10只用于观察8d存活率，其余小鼠分别于移植后1，2，4，8d经眼球后静脉丛采血，进行肝功能检测谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，每组5只／次。并回收微胶囊观察其形态，对回收的微囊化细胞进行组织切片细胞活性观察。 结果：成功建立急性肝衰竭模型的90只小鼠全部进入结果分析。①移植后不同时间点各组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平的变化：移植后第1，2天，微囊化细胞组的两种转氨酶水平均显著低于游离细胞组和空囊组（P〈0．05）。到移植后第8天各组间转氨酶水平基本相似（P〉0．05）。②各组小鼠移植8d存活率的比较：微囊化细胞组小鼠的存活率显著高于空囊组、游离细胞组（90．0％，50．0％，60．0％，P〈0．05）。③腹腔移植微胶囊的形态及囊内细胞活性观察结果：回收的微胶囊形态完整光滑，未见明显的纤维包裹，囊内细胞呈圆形，细胞膜完整光滑，胞浆饱满，仍有90％以上肝细胞存活。 结论：微囊化人源性肝细胞腹腔内移植可以提高药物诱导急性肝衰竭小鼠的存活率，改善急性肝衰小鼠的肝脏功能。提示生物微胶囊可以有效阻断免疫排斥作用，保护移植的肝细胞，有利于其发挥生物功能。     

微囊微环境体外扩增人脐血造血干/祖细胞

背景:由于单份脐血所含的造血细胞数量有限,目前只能用于儿童或低体质量成人血液病和急性辐射损伤等疾病患者,有效扩增脐血造血干,祖细胞已成为研究热点.目的:观察微囊微环境对脐血造血干,祖细胞扩增的影响,以及此过程中可否使造血干,祖细胞在扩增的同时仍维持其未分化状态.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-09在中国科学院大连化学物理研究所完成.材料:正常足月产新生儿脐带血由大连市妇产医院提供,提供者知情同意.方法:Ficoll法梯度分离人脐血单个核细胞,采用静电液滴法在生理条件下进行微囊化包封和体外培养.以同条件平面培养的脐血单个核细胞作为对照.主要观察指标:观察微囊化脐血细胞的生长特点及脐血细胞总数的变化;流式细胞仪检测培养过程中CD34+细胞扩增情况:应用甲基纤维素半固体培养法观察扩增细胞的集落形成能力.结果:脐血细胞在微胶囊内持续增殖,并以聚集成团的三维方式生长,两种培养方式对脐血细胞总数均无明显影响(P>0.05).对比CD34+细胞扩增和细胞集落的生成发现,微囊化培养脐血细胞的CD34+细胞数量和集落密度均在培养第6天达到高峰,明显高于平面培养3 d时所达到的峰值:之后逐渐下降,至12 d后平面培养细胞的CD34+细胞和集落形成能力几乎检测不到,而此时微囊化培养的CD34+细胞数量和集落密度仍与平面培养的扩增高峰相近.结论:微囊化培养能有效扩增人脐血造血干/祖细胞,并显著减缓造血干/祖细胞的分化进程,维持其多分化潜能,提示微囊为造血干/祖细胞维持未分化状态的扩增提供了特殊的微环境.     

海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PCI2细胞脑内移植改善帕金森病模型鼠的旋转行为

背景：细胞组织的微囊化移植是近年来帕金森病治疗的研究热点之一。目前发展较成熟、应用较多的是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊，但其易于囊周纤维化、易破碎等缺点，使其临床应用受到了限制。应用国内研制的新型微胶囊材料海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊将PC12细胞微囊化后移植入帕金森病模型鼠纹状体内，观察其作用。目的：观察海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植治疗，改善帕金森病模型大鼠旋转行为的作用。设计：随机对照动物实验。单位：吉林大学第二医院和中国科学院大连化学物理研究所。材料：成年雄性Wistar大鼠40只，体质量（220&;#177;10）g；海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊；PC12细胞。方法：实验于2002—05／12在吉林大学第二医院动物实验室和中国科学院大连化学物理研究所完成。①应用国产新型材料壳聚糖制成的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞。②将成功建立的23只帕金森病大鼠模型随机分为3组，微囊化PC12细胞组10只、裸PC12细胞组7只、空微胶囊组6只。分别将海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞、裸PC12细胞、空微胶囊移植入帕金森病模型鼠损伤侧纹状体内。③以阿朴吗啡检测移植前后大鼠旋转行为的差异。观察黑质及纹状体内微包囊的形态并检测微胶囊内细胞的活性。主要观察指标：①移植前后大鼠的旋转行为。②黑质和纹状体的病理形态。（3）回收的微包囊的完整性及囊内PC12细胞的活性。结果：①微囊化PC12细胞移植组在移植4周时旋转行为显著低于移植前和空微囊移植组【（6．9&;#177;2．8），（11．7&;#177;5．5），（10．5&;#177;1．6）r／min，P〈0．05】，症状改善至少持续3个月；裸PC12细胞移植组大鼠的旋转行为与移植前相比也有改善【（5．6&;#177;1．1），（9．5&;#177;1．5）r／min,P〈0．05]，但仅持续了2个月，且部分大鼠颅内有致死性肿瘤形成。空微囊移植组移植前后大鼠的旋转行为无明显差异。（爹回收微胶囊内的PC12细胞再培养生长良好，并且具有生物活性。结论：微囊化PC12细胞脑内移植能够改善阿朴吗啡诱发的帕金森病模型鼠的旋转症状。海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠新型微胶囊具有免疫隔离和抑制肿瘤形成的作用，有着广泛的临床应用前景。     

海藻酸钠/壳聚糖微胶囊小鼠腹腔移植的生物学评价

目的:实验证明海藻酸钠/壳聚糖微胶囊具有一定的通透性和免疫隔离特性,用于体外细胞培养取得了较好的效果,但植入体内出现了不同程度的细胞黏附和纤维化现象,因此对海藻酸钠/壳聚糖微胶囊作为细胞移植用的免疫隔离载体在体内的移植效应进行评价。方法:实验于2004-03/07中国科学院大连化学物理研究所,生物技术部生物医用材料工程实验室完成。采用自制静电液滴发生器制备海藻酸钙凝胶微球,以一定浓度海藻酸钠溶液中和成膜后的海藻酸钙微球即得到海藻酸钠/壳聚糖微囊。将对数生长的L929细胞消化后与海藻酸钠溶液混匀,转移至静电液滴发生器,制备包封细胞微囊。取小鼠84只,雌雄各半,随机分为7组,每组12只。①对比观察材料对移植的影响:取3组小鼠,每组小鼠分别腹腔注射移植单纯的海藻酸钙胶珠、壳聚糖成膜的海藻酸钠微囊和最外层用海藻酸钠中和的壳聚糖/海藻酸钠微囊,在移植后的第7天和14天观察微囊回收率。②对比观察粒径对移植的影响:另取两组小鼠,分别移植粒径为200μm左右和粒径为500μm左右的海藻酸钠/壳聚糖微囊,于移植后1,4,14d观察微囊回收率。③对比观察细胞的存在对移植的影响:取两组小鼠分别移植空的微胶囊和包封有L929细胞的微胶囊。于移植后4,14d观察微囊回收率。回收率=(回收微囊体积/移植微囊体积)×100%。结果:84只小鼠均进入结果分析。①不同材料微囊回收率:壳聚糖成膜的胶珠引发的黏附最重,外层以海藻酸钠中和后的微囊其次,而单纯的海藻酸钠胶珠在所考察的时间内基本没有引起黏附。②不同粒径微囊回收率:粒径为200μm左右的微囊相对于粒径为500μm的微囊引发的黏附略有增加,但差别不明显,粒径200μm左右的微囊彼此聚集的特点导致回收率低于粒径为500μm左右的微囊。③在细胞微囊与空微囊回收率:与空胶囊比较,包封细胞的微囊黏附程度明显增加。结论:黏附程度随着粒径的增加而略有增加,壳聚糖是引发黏附的主要原因,细胞的存在提高了黏附程度。     

半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠何种质量比可保障微胶囊的力学稳定？

背景：大量研究表明经过半乳糖修饰的材料可以显著改善肝细胞的黏附能力,进而影响肝细胞的形态和功能。静电复合制备的微胶囊被广泛应用于细胞包裹、酶固定和药物包埋等诸多领域,但国内外未见以壳低聚糖和海藻酸钠制备微胶囊用于肝细胞包裹的研究。目的：制备一种新型用于肝细胞包裹的半乳糖化海藻酸钠一壳低聚糖微胶囊。方法：对海藻酸钠进行半乳糖化修饰,红外光谱、核磁共振谱和元素分析表征半乳糖化海藻酸钠的合成。浊度法研究壳低聚糖的水溶性。采用一步法制备半乳糖化海藻酸钠-壳低聚糖微胶囊,研究制备过程中半乳糖化海藻酸钠含量（半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠的质量比分别为100％,50％,30％,0）和静电反应成膜时间（5,10,20rain）对微胶囊的影响。结果与结论：对于半乳糖化海藻酸钠的合成,红外光谱表明了羧基峰的消失和C．N键的形成;核磁共振谱表明产物中不但出现了乳糖酸中对应的峰,而且还偶合了一部分碳二亚胺的分子链;元素分析计算出半乳糖接枝含量为20％,偶合到海藻酸钠分子链中的碳二亚胺含量为8％。半乳糖修饰对微胶囊制备的影响为：半乳糖的引入在一定程度上削弱了海藻酸钠分子链上负电荷的密度,影响了静电复合成膜的过程。结果表明只有当半乳糖化海藻酸钠与海藻酸钠以小于1：1的质量比混合时,才能得到力学稳定的微胶囊。     

人嗜铬细胞微囊化处理对大鼠异种移植的免疫隔离作用

背景:课题组前期在建立海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊包裹活细胞制备技术的基础上,已证明微囊化嗜铬细胞有良好的镇痛效果,而该微囊包被材料的免疫隔离作用尚需明确.目的:观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化嗜铬细胞移植到大鼠眼前房和足胝部的免疫排斥反应,评价微囊化技术的免疫隔离作用.设计:随机对照动物实验.单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室.材料:选用雌性 SD大鼠48只,鼠龄3个月,由华中科技大学同济医学院实验动物部提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.实验所用海藻酸钠、多聚赖氨酸为美国Sigma公司产品,微囊发生器为德国赠送.方法:实验于2002-09/2003-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室完成.①取6名脑死亡健康成人的肾上腺髓质,经分离、消化、培养后,制备成人嗜铬细胞悬液.供者家属对实验知情同意,实验方案通过医院伦理委员会批准.采用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠法制作空微囊和微囊化细胞.②48只大鼠被随机分为3组:人嗜铬细胞移植组、空微囊移植组、微囊化人嗜铬细胞移植组,每组分眼前房和足胝部两个部位进行移植,每个部位8只.人嗜铬细胞移植组分别将2×1010 L-1细胞悬液注入大鼠右眼前房和左足胝部.空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞组分别吸取空微囊(100个微囊)或ME-HCC(100个微囊,每个微囊包裹400～500个细胞)注入大鼠右眼前房和左足胝部.主要观察指标:于移植术后第7天采用ELISA法测定血清白细胞介素2水平.采用激光散射比浊仪测定血清IgG和IgM水平.移植术后第28天取大鼠右侧眼球及左侧足组织作常规切片,苏木精-伊红染色,40倍光镜下观察组织形态.结果:大鼠48只均进入结果分析.①血清白细胞介素2,IgG,IgM水平:空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞移植组均低于人嗜铬细胞移植组,差异有显著性意义(t=8.544～21.64,P < 0.01).②大鼠眼前房和足胝部组织形态:人嗜铬细胞移植组大鼠的眼前房内和足胝部可见大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润.空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞移植组大鼠眼前房和足胝部仅见少量淋巴细胞和中性粒细胞.结论:海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化所产生的良好生物相容性及其机械稳定性,使之有效地发挥了免疫排斥隔离作用.     

微囊二氯异氰尿酸钠复方消毒剂杀灭微生物作用与稳定性的试验观察

用微囊二氯异氰尿酸钠加洗衣粉制成复方消毒剂。经检测，以其含９０ｍｇ／Ｌ有效氯溶液对大肠杆菌悬液作用１０ｍｉｎ，杀灭率为９９９７％。以其含４５０ｍｇ／Ｌ有效氯溶液作用１５ｍｉｎ，可破坏悬液中ＨＢｓＡｇ抗原性。其溶液配制后１０ｍｉｎ，微囊中有效氯即充分释出。该复方粉剂在５６℃放置２周，有效氯下降５３４％。     

壳聚糖对肝素微胶囊性能的影响

背景:壳聚糖、海藻酸钠是良好的天然的微胶囊制备材料,在组织工程中应用广泛。本课题组以往制备的抗凝血材料主要是运用材料的惰性以及模仿血管内壁的液晶态,而本实验是在此基础上,利用低分子肝素的生物抗凝活性及其他特异性能,对肝素进行微胶囊化,以期使肝素在体内的释放达到一种缓释的效果。目的:以天然的壳聚糖、海藻酸钠为微胶囊的包囊材料,对低分子肝素进行微胶囊化,以保证肝素在体内的稳定性,分析壳聚糖含量对肝素微胶囊性能的影响。设计:开放性实验。单位:广州暨南大学材料科学与工程系。材料:实验于2004-10/2005-06在暨南大学材料科学与工程系生物材料实验室完成。肝素(山东福瑞达生物化工有限公司,分子量<5000);壳聚糖(脱乙酰度≥90%,黏度<100cps,上海伯奥生物科技有限公司);海藻酸钠(青岛明月海藻工业有限公司);乳化剂为Span80,CaCl2均为国产化学纯。方法:①肝素-壳聚糖微胶囊的制备:取一定量肝素水溶液乳化于石蜡油中,充分搅拌使反应体系呈乳液状,然后使整个体系升温到50℃并维持20min。然后缓慢滴加20g/L壳聚糖水溶液,使体系升温到60℃,再滴加戊二醛,并使反应体系于80℃保持1h。离心分离,过滤洗涤,除去残留有机物,烘干。②肝素-海藻酸钠-壳聚糖微胶囊的制备:取一定量的海藻酸钠和肝素水溶液乳化于石蜡油中,充分搅拌使反应体系呈乳状液,维持20min。然后缓慢滴加含有不同浓度壳聚糖的CaCl2水溶液,保持30min。离心分离,过滤洗涤,除去残留有机物,烘干。③测定药物含量与包封率,确定肝素标准曲线,测定肝素微胶囊体外缓释情况。主要观察指标:①壳聚糖溶液浓度对肝素-壳聚糖微胶囊制备的影响。②戊二醛用量对肝素-壳聚糖微胶囊制备的影响。③海藻酸钠溶液浓度对肝素-海藻酸钠的影响。④壳聚糖浓度对肝素-海藻酸钠-壳聚糖微胶囊制备的影响。⑤不同材料包裹的肝素微胶囊的体外释放情况。⑥肝素含量与包封率的测定结果。⑦肝素微胶囊扫描电镜观察结果。结果:①随着壳聚糖溶液初始的增大,产物颜色加深,颗粒度增大,但颗粒的均匀性和成球性提高。②戊二醛用量增大,产物颜色加深,且使产物相互黏着严重。未与壳聚糖作用的戊二醛也可以自身固化而呈不规则颗粒物。③随着海藻酸钠浓度的改变,产物的成球特性没有明显的变化。④随着壳聚糖浓度的增加,成球性好,但当浓度达到一定程度时,微球之间有相互黏结的现象。将壳聚糖的浓度控制在质量比为2%较好。⑤随着壳聚糖含量的增大,肝素的释放速度变慢。⑥当微囊中的壳聚糖含量质量比达到20%时,肝素的包封率可以达到58%。单纯利用壳聚糖包埋肝素,肝素的包封率可以达到79.9%。⑦含有壳聚糖的微胶囊表面比较致密,同时随着戊二醛含量的增大,微胶囊会粘连在一起。结论:壳聚糖在一定浓度下对微胶囊的均匀性和成球性存在影响,壳聚糖的用量可以改变肝素的包封率,且随着壳聚糖用量的增加肝素的包封率随之提高,同时肝素的缓释速率相应降低。     

Factors affecting protein release from alginate-chitosan coacervate microcapsules during production and gastric/intestinal simulation.

A series of experiments was performed to evaluate the influence of a number of physico-chemical factors on the diffusion of a model protein, bovine serum albumin (BSA), from dried chitosan-coated alginate microcapsules. Diffusion of BSA was quantified during the microcapsule manufacture processes (gelation, washing, rinsing) and during incubation in conditions simulating the pH encountered during the gastric (0.1 N HCl; pH 1.5) and intestinal (200 mM Tris-HCl; pH 7.5) phases of digestion. Factors tested included alginate and chitosan concentration, calcium chloride (CaCl2) concentration in the gelation medium, loading rate, chitosan molecular mass and pH of the gelation medium. Microcapsule size and gelation time were altered in order to determine their effects on protein retention. Alginate and chitosan concentration significantly influenced BSA retention during microcapsule manufacture and acid incubation, as did calcium chloride concentration in the gelation medium (P<0.05). BSA retention during manufacture was not significantly altered by protein loading rate or pH of the encapsulation medium, however, protein retention during acid incubation decreased significantly with increasing protein loading rate and encapsulation medium pH (P<0.05). Microcapsules that were washed with acetone following manufacture demonstrated significantly increased protein retention during acid incubation (P<0.05). In microcapsules that had been acetone-dried to a point whereby their mass was reduced to 10% of that immediately following encapsulation, protein retention was over 80% following 24-h acid incubation vs. only 20% protein retention from non acetone-dried microcapsules. The presence of calcium in the neutral buffer medium significantly reduced BSA diffusion in a concentration-dependent manner (P<0.05).     

Covalent binding of metabolites of 4-ipomeanol to rabbit pulmonary and hepatic microsomal proteins and to the enzymes of the pulmonary cytochrome P-450-dependent monooxygenase system

The covalent binding of metabolites of 4-ipomeanol, a potent lung toxin, to proteins in rabbit pulmonary and hepatic microsomal preparations and in purified monooxygenase systems was investigated. The rate of binding was 12-fold greater in pulmonary preparations than in hepatic preparations. Covalent binding in pulmonary microsomal fractions was inhibited 39 to 49% by antibodies to rabbit pulmonary cytochrome P-450II or P-450I and 90% by antibodies to cytochrome P-450 reductase. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and scintillation autoradiography of pulmonary microsomal proteins revealed the presence of heavily labeled bands throughout the molecular weight range (Mr) examined. Two of these bands corresponded in mobility to pulmonary cytochrome P-450I (Mr 52,000) and P-450II (Mr 58,000). In addition, there was a great deal of binding associated with very high molecular weight proteins, probably in the form of cross-linked aggregates which were unable to penetrate the gel matrix. In the absence of cofactor, no binding was observed. Binding was decreased by the addition of the following: antireductase greater than glutathione = NADH (without NADPH) greater than anti-II greater than anti-I. The electrophoretic patterns of the proteins from incubation of [3H]-4-ipomeanol with purified pulmonary P-450-dependent monooxygenase enzymes were also examined. In the complete system, the majority of the binding was associated with high molecular weight species located at the origin and with low molecular weight species that migrated with the tracking dye. In the absence of cofactor, some binding to proteins that corresponded with cytochrome P-450 and P-450 reductase was observed. Protease digestion of incubation mixtures resulted in the migration of all bound material at the dye front.     

Depression of cytochrome P-450-dependent drug biotransformation in hepatocytes after the activation of the reticuloendothelial system by dextran sulfate

Cytochrome P-450 and aryl hydrocarbon hydroxylase were depressed in microsomes prepared from the livers of mice treated with dextran sulfate. Unlike some other immune modulating drugs which decrease cytochrome P-450, dextran sulfate did not induce interferon production in the serum of these animals. Dextran sulfate had no effect on cytochrome P-450 when incubated with isolated hepatocytes alone but with mixtures of hepatocytes and Kupffer cells both cytochrome P-450 and aryl hydrocarbon hydroxylase were significantly depressed. Kupffer cells were then incubated at 37 degrees C for 30 min with dextran sulfate. After centrifugation the resulting cell-free supernatant decreased cytochrome P-450 and aryl hydrocarbon hydroxylase when incubated with hepatocytes. These experiments suggest that dextran sulfate stimulates the release of a factor by Kupffer cells which can decrease cytochrome P-450 in hepatocytes. This was confirmed by incubating cells in a membrane partitioned double-chambered Marbrook vessel to separate cell types and prevent passage of dextran sulfate. When dextran sulfate was added to the chamber containing Kupffer cells a factor was released which crossed a semipermeable membrane and depressed cytochrome P-450 levels in the hepatocytes in the other chamber. It is concluded that dextran sulfate depresses drug biotransformation in the liver via a factor which is released from Kupffer cells.     

The release of model macromolecules may be controlled by the hydrophobicity of palmitoyl glycol chitosan hydrogels

A non-covalently cross-linked palmitoyl glycol chitosan (GCP) hydrogel has been evaluated as an erodible controlled release system for the delivery of hydrophilic macromolecules. Samples of GCP with hydrophobicity decreasing in the order GCP12>GCP11>GCP21 were synthesised and characterised by ¹H NMR. Hydrogels were prepared by freeze-drying an aqueous dispersion of the polymer in the presence or absence of either a model macromolecule fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, MW 4400), and/or amphiphilic derivatives Gelucire 50/13 or vitamin E d--tocopherol polyethylene glycol succinate. Gels were analysed for aqueous hydration, FITC-dextran release, and bioadhesion, and imaged by scanning electron microscopy. The gels were highly porous and could be hydrated to up to 95× their original weight without an appreciable volume change and most gels eventually eroded. Hydration and erosion were governed by the hydrophobicity of the gel and the presence of the amphiphilic additives. GCP gels could be loaded with up to 27.5% (w/w) of FITC-dextran by freeze-drying a dispersion of GCP in a solution of FITC-dextran. The controlled release of FITC-dextran was governed by the hydrophobicity of the gel following the trend GCP21>GCP11>GCP12. GCP gels were bioadhesive but less so than hydroxypropylmethylcellulose, Carbopol 974NF (7:3) tablets.