抗阿尔茨海默病Aβ人源单链抗体基因的筛选和表达

目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础.     

抗阿尔茨海默病Aβ人-鼠嵌合抗体基因的真核载体构建和表达

目的 通过基因工程抗体技术构建和表达抗β-淀粉样多肽(Aβ)人-鼠嵌合抗体,减低鼠源单克隆抗体在临床应用中引起的人体免疫排斥反应.方法从分泌抗Aβ1-42鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增鼠源性抗体全长基因,并通过Blast对其序列进行分析;利用重组PCR技术拼接重轻链可变区及人IgG1的恒定区基因,并对重链Fc段进行定点突变以降低排斥反应;分别构建人-鼠嵌合基因重轻链表达载体,用脂质体法将其同时导入COS-7细胞中表达,并利用ELISA和免疫组织化学(SP法)对分泌的抗体功能和性质进行初步鉴定.结果 Blast比对分析结果显示克隆的基因序列符合小鼠抗体基因序列,将可变区基因与人IgG1的恒定区基因拼接以及Fc定点突变后,成功构建了嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达;ELISA和免疫组织化学方法证实了所分泌抗体的人源性和与Aβ的结合特异性.结论成功地构建和表达了抗阿尔茨海默病Aβ人-鼠嵌合抗体,为其在阿尔茨海默病的临床诊治中应用和进一步改造奠定了基础.     

人抗Aβ42自身抗体的纯化及鉴定

目的纯化并鉴定正常人血清中抗Aβ42自身抗体。方法采集正常人血清标本,测定抗体含量,用饱和硫酸铵沉淀血清得到IgG粗品,用CNBr Sephrose 4B层析柱对粗品IgG进一步纯化,采用PAGE电泳和Westernblot方法鉴定IgG纯度和免疫活性。结果用CNBr活化Sephrose4B柱可纯化出较高纯度的抗AB42自身抗体,纯度可达到90％。结论CNBr活化Sephrose4B层析柱可有效地从人血清中纯化出较高纯度的抗A％自身抗体,便于对自身抗体进一步研究,为AD的免疫治疗提供更多的信息。     

抗人纤维蛋白单链抗体的人源化

目的：人源化抗人纤维蛋白单莲抗体,降低人抗鼠抗体反应。方法：从人免疫球蛋白基因数据库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体ｓｃＦｖ－８Ｅ５重链（ＶＨ－８Ｅ５）同源性最高的序列,作为人源化改造的框架,其中植入ｓｃＦｖ－８Ｅ５的互补决定区。人工合成其ＤＮＡ连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５和ＶＬ－８Ｅ５,构建表达载体,转化ＪＭ１０９后用ＩＰＴＧ诱导表达,ＥＬＩＳＡ测定其抗原结合活性。结果：表达产物分子量     

人抗Aβ_(42)自身抗体的纯化及鉴定

目的纯化并鉴定正常人血清中抗Aβ42自身抗体。方法采集正常人血清标本,测定抗体含量,用饱和硫酸铵沉淀血清得到IgG粗品,用CNBr Sephrose 4B层析柱对粗品IgG进一步纯化,采用PAGE电泳和Western blot方法鉴定IgG纯度和免疫活性。结果用CNBr活化Sephrose 4B柱可纯化出较高纯度的抗Aβ42自身抗体,纯度可达到90%。结论 CNBr活化Sephrose 4B层析柱可有效地从人血清中纯化出较高纯度的抗Aβ42自身抗体,便于对自身抗体进一步研究,为AD的免疫治疗提供更多的信息。     

人源化抗体研制策略分析及应用研究

鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所替代，人源化抗体开辟了抗体治疗临床应用的新时代。本文介绍并比较分析了几种制备人源化抗体的策略和抗体表达系统，并对其临床应用进行了展望。     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的表达

在以前的工作中 ,我们利用本研究室制备的抗胶质瘤单克隆抗体ＳＺ39通过化学偶联的方法制备了抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体 ,并在体外细胞毒及荷瘤动物体内试验中取得较好疗效[1,2 ] ,但存在着分子量大 ,穿透力弱 ,免疫原性强 ,制备困难等缺点。因此 ,研制小分子 ,低免疫原性的人源化抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体是我们正在开展的研究项目之一。目前我们已构建并原核表达了抗胶质瘤单链抗体ＳＺ39 ＳｃＦｖ。本研究构建并表达的人源化抗ＣＤ3单链抗体 ,旨在为下一步制备高效低毒的抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个理想的构件。1　材…     

人源化抗HCMV噬菌体ScFv库的构建

目的　构建抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库 ,以探索制备巨细胞病毒感染治疗用单克隆抗体。方法　巨细胞病毒感染患者外周血淋巴细胞为材料 ,建立噬菌体单链抗体库 ,并对其进行鉴定。结果　构建完成了一个滴度为 6 .5×10 6 CFU mL的抗体库。结论　源化抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库的建立为下一步抗体的筛选、表达奠定了基础     

人源化抗体研制策略分析及应用研究

鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所替代 ,人源化抗体开辟了抗体治疗临床应用的新时代。本文介绍并比较分析了几种制备人源化抗体的策略和抗体表达系统 ,并对其临床应用进行了展望。     

抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化

目的人源化抗人纤维蛋白单链抗体的重链,降低人抗鼠抗体反应。方法从基因文库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链（ＶＨ－８Ｅ５）同源性７１．８％的人源免疫球蛋白ＨＵＭＨＣＨ１０９重链（ＶＨ）序列,作为人源化改造ＶＨ－８Ｅ５的框架。人工合成人源化ＶＨ－８Ｅ５片段,用连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５,构建表达载体ｐＯＰＥ１０１－ＶＨ－８Ｅ５。转化ＪＭ１０９后用异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导表达。结果经聚丙烯酰胺电泳和ＥＬＩＳＡ证明表达产物相对分子质量３０×１０３左右,有特异性识别和结合人纤维蛋白能力,是亲本抗体ＳｃＦｖ－８Ｅ５活性的４／５左右。人源化ＳｃＦｖ－８Ｅ５表达产量为转化菌总蛋白的１１．２％。结论人源化ＶＨ－８Ｅ５仍具有特异性识别人纤维蛋白的活性,ＳｃＦｖ－８Ｅ５重链的人源化基本获得成功     

老年痴呆噬菌体抗体库的构建及抗Aβ肽单链抗体的筛选

目的: 构建人源性的老年痴呆(AD)噬菌体抗体库,筛选1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv).方法: 利用噬菌体展示技术,用20个AD患者的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库.以Aβ40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一个抗Aβ scFv-H1,并对其重链和轻链可变区基因进行测序分析.利用预吸附实验及竞争性ELISA测定该抗体对Aβ40的特异性及结合位点. 结果: 成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106.从库中筛选出1株抗Aβ40的单链噬菌体抗体-H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列.预吸附及竞争性ELISA证实该抗体对Aβ40的结合表位位于蛋白氨基端的1到16个氨基酸内. 结论: 利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性scFv,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径.     

重组四价Aβ1-15蛋白的表达及免疫原性鉴定

目的:制备重组人四价串联Aβ1-15老年性痴呆二代蛋白疫苗,探讨其免疫原性.方法:以本室前期制备的含四价AB1-15基因(4×Aβ15)的重组质粒peDNA-4×Aβ15为模板,PCR扩增4×Aβ15基因并克隆至pGEX-4T-2质粒中,转化大肠杆菌,诱导表达GST-4×Aβ15.经thrombin酶切去除GST后得到纯化的4×Aβ15蛋白.将4×Aβ15免疫BALB/c小鼠,观察其诱导体液免疫反应的能力.结果:经鉴定、测序,获取重组质粒pGEX-4×Aβ15,诱导表达后Western blotting显示在相对分子质量约35×103处有GST-4×Aβ15表达带,thrombin酶切去除GST后得到相对分子质量约9×103的4 xAβ15蛋白.4×Aβ15蛋白免疫小鼠诱导出(964.6+401.3)ms/L抗AB抗体.结论:成功构建了pGEX-4×Aβ15原核表达质粒并表达人重组4×Aβ15蛋白,免疫动物证实该蛋白疫苗有较强的免疫原性.     

抗蓖麻毒素A链人源化单域抗体的设计、原核表达及生物活性检测

目的 运用计算机辅助蛋白质分子设计的方法设计针对蓖麻毒素A链(RTA)的拮抗肽,实现在大肠杆菌B121中的可溶性表达,并对其生物学活性进行评价.方法 根据RTA的晶体结构、RTA-rRNA相互作用复合物模型,在CVFF(consistent-valence force field)、Amber力场下,对RTA的空间构象进行理论模拟,初步确定其生物活性功能域;然后针对该功能域设计小分子拮抗肽,并借助人抗体重链町变区骨架,在CDR3区对拮抗肽进行展示,用重叠延伸PCR全基因合成人源化的单域抗体并克隆至载体pET-32a(+);双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IPrG诱导人源化的单域抗体表达,用镍离子亲和层析纯化,竞争ELISA和MTT法分别进行结合和中和活性检测.结果 从头搭建并设计合成了人源化的单域抗体,实现了其原核表达,并进行了牛物活性检测;建立了基于人源化的单域抗体的RTA和蓖麻毒素检测方法.结论 研究结果为新型蓖麻毒素小分子拮抗剂的研制奠定了理论和实验基础.     

人源化抗人纤维蛋白单链抗体—链亲和素融合蛋白？…

目的 探索人源化抗人纤维蛋白单链抗体－链亲和素融合蛋白的表达和功能。方法 构建人源化抗人纤维蛋白单链抗体（ＳｃＦｖ－８Ｅ５）基因与链亲和素基因的重组表达载体，制备融合蛋白，ＥＬＩＳＡ观察其稳定性、与人及不同动物纤维蛋白的反应。结果 人源化融合蛋白可特异性识别人、大鼠、豚鼠纤维蛋白，同时有生物素的结合位点，且稳定性好，可耐受至少两周４℃保存，数次反复冻融或一定时间的３７℃孵育。结论 此人源化融合蛋白     

抗人APPβ水解位点单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的:制备能特异识别结合人APPβ水解位点的单克隆抗体(mAb)。方法:以APPβ水解位点短序列多抗原肽免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA和有限稀释法进行筛选和亚克隆,获得能分泌针对APPβ水解位点mAb的杂交瘤,采用ELISA、Western blot等方法对其特异性进行检测。结果:获得2株稳定分泌抗人APPβ水解位点mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7和2H10,其Ig亚类分别为IgGl和lgG2b。Western blot显示2株抗体可以与全长APP结合。结论:成功制备了能特异识别结合APPβ水解位点的mAb,为进一步研究其对β位点封闭功能和构建小分子抗体奠定基础。     

重组四价Aβ1-15蛋白的表达及免疫原性鉴定

目的：制备重组人四价串联Aβ1-15 老年性痴呆二代蛋白疫苗, 探讨其免疫原性。方法: 以本室前期制备的含四价Aβ1-15基因(4×Aβ15)的重组质粒pcDNA-4×Aβ15为模板, PCR扩增4×Aβ15基因并克隆至pGEX-4T-2质粒中,转化大肠杆菌,诱导表达GST-4×Aβ15。经thrombin酶切去除GST后得到纯化的4×Aβ15蛋白。将4×Aβ15免疫BALB/c小鼠,观察其诱导体液免疫反应的能力。结果: 经鉴定、测序,获取重组质粒pGEX-4×Aβ15,诱导表达后Western blotting显示在相对分子质量约35×103处有GST-4×Aβ15表达带,thrombin酶切去除GST后得到相对分子质量约9×103的4×Aβ15蛋白。4×Aβ15蛋白免疫小鼠诱导出（964.6±401.3）mg/L抗Aβ抗体。结论: 成功构建了pGEX-4×Aβ15原核表达质粒并表达人重组4×Aβ15蛋白,免疫动物证实该蛋白疫苗有较强的免疫原性。     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的:构建人天然Fab段噬菌体抗体库,为人源抗体的制备建立技术平台。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,构建噬菌体抗体库,酶切鉴定有无插入片段并测序分析,用IL-2和地高辛进行富集筛选。结果:最终构建的抗体库库容约为8.4×107,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率是70%,DNA测序分析证实抗体重链属IgG亚类,轻链为λ链。用IL-2和地高辛进行三轮筛选,抗体库均得到了不同程度的富集。结论:成功构建了一个天然的人源化噬菌体抗体库,可用于下一步胰淀素人源化抗体的筛选、纯化和表达。     

人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定

目的构建人源Fab噬菌体抗体库,筛选抗hPRLR抗体片段并进行初步鉴定。方法从乳腺癌患者外周血提取总RNA,通过RT-PCR扩增人抗体轻链和重链基因,构建抗hPRLR人源Fab抗体库。分别以His-hPRLR融合蛋白、BSA-hPRLR表位多肽融合蛋白和GST-hPRLR融合蛋白作为抗原包板,经过3轮循环的吸附-洗脱-扩增的筛选及1轮交叉筛选,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,将筛选到的阳性克隆FabG2转化至Top10’受体菌,诱导表达可溶性Fab抗体,通过Western blot和ELISA进行特异性的鉴定。结果构建的人源Fab库容为1.0×109,4轮的筛选,获得6株能与hPRLR结合的人源抗体克隆。选取的FabG2能够进行可溶性Fab抗体蛋白的表达,ELISA初步鉴定,能够与hPRLR进行特异性地结合。结论成功构建了人源Fab噬菌体抗体库,筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆。hPRLR特异性Fab抗体的获得将为高表达hPRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。     

人源化抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原单链抗体的设计和表达

目的:应用抗体"框架区重塑"技术,对鼠单克隆抗体(mAb)框架区进行人源化,制备人源化单链抗体(scFv)并检测其活性。方法:在获得抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原鼠mAb(5E1)可变区基因的基础上,保持鼠mAb互补决定区(CDR)不变,选择与框架区同源性最高的人源序列替换鼠mAb的框架区,保留个别关键的鼠源残基。通过融合PCR技术构建人源化的scFv,并在大肠杆菌中进行了表达。表达产物以包涵体形式存在,通过变性、镍柱亲和层析和复性,获得复性后的可溶蛋白。对纯化产物进行了SDS-PAGE、ELISA和抑制炭疽毒素中和活性的检测。结果:人源化后的序列具有与鼠源scFv一致的抗原结合活性和细胞水平的中和炭疽毒素活性。结论:获得了具有功能的人源化的抗体基因序列,为表达具有中和炭疽毒素活性的全分子人源化抗体奠定了基础。     

鼠单克隆抗体人源化

鼠源性单克隆抗体应用于临床由于ＨＡＭＡ反应的存在而受到阻碍。以ＣＤＲ移植为核心，以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案，已成为克服ＨＡＭＡ反应的主要手段。本文结合单克隆抗体人源化的最新进展对该领域的工作作一综述