几种不同提取方法对Hela细胞总蛋白双向电泳结果的影响

目的比较几种不同的提取方法对Hela细胞总蛋白双向电泳图谱的影响。方法采用反复冻融裂解法、超声加冰浴裂解法、室温振摇及试剂盒纯化法提取Hela细胞总蛋白,进行双向凝胶电泳(2-DE)。以7cmpH3-10NL固相pH梯度胶条做一向等电聚焦,上样量为300μg,SDS-PAGE做二向垂直电泳,改进的胶体考马斯亮蓝染色,ImageMaster2D Platinum软件分析电泳图谱。结果反复冻融裂解法得到的2-DE图谱条纹很多,蛋白点数较少(400±);超声加冰浴裂解和室温振摇法得到的2-DE图谱横向条纹明显减少,蛋白点数明显增加(分别为700±和800±);进一步用试剂盒纯化法得到的2-DE图谱基本上没有蛋白拖尾现象,且加Destreak试剂后蛋白点数有所增加(由800±→900±),但纯化的同时有低丰度蛋白的丢失。结论超声加冰浴裂解和室温振摇法处理细胞,可得到条纹较少、蛋白点数较多较全的2-DE图谱;进一步用蛋白纯化试剂盒和Destreak试剂纯化样品能更好地解决碱性端的横向拖尾,得到较多的蛋白点。     

大鼠脑组织蛋白质双向电泳技术的建立

目的：建立大鼠脑组织蛋白质双向电泳技术。方法：利用不同体积的裂解液提取大鼠脑组织中的蛋白质,并通过不同的蛋白质上样量（1mg,2mg,3mg）,进行双向电泳,考马斯亮蓝染色,图谱分析。结果：在等电点3～10,分子量6．5～200ku范围内分离得到蛋白质斑点为,1mg蛋白质上样量为546个蛋白质斑点,2mg为780个,3mg为805个斑点。2mg蛋白质上样量的双向电泳图谱更清晰,分离更好。结论：成功建立了大鼠脑组织蛋白质的双向电泳技术。     

结肠癌蛋白质双向电泳技术的建立

目的:建立结肠癌双向电泳技术.方法:利用不同体积的裂解液提取结肠癌中的蛋白质,并通过不同的蛋白质上样量(1mg,2mg,3mg),不同样品制备方式,进行双向电泳,考马斯亮蓝染色,图谱分析.结果:在等电点3～10,分子量6.5～200ku范围内分离得到蛋白质斑点为,1mg蛋白质上样量为658个蛋白质斑点,2mg为820个,3mg为845个斑点.2mg蛋白质上样量的双向电泳图谱更清晰,分离更好.制备方式2可以满足双相电泳的需要.结论:成功建立了结肠癌蛋白质的双向电泳技术.     

3种方法提取胸腺组织蛋白双向电泳纯化结果比较

目的:选择合适的胸腺组织蛋白质提取和纯化方法.方法:分别采用组织裂解液法、丙酮沉淀法和蛋白纯化试剂3种方法提取7例重症肌无力患者胸腺组织蛋白质,上样量为1 mg蛋白,以17 cm pI 3～10 固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳(2-DE),考马斯亮蓝染色,图像分析软件分析电泳图谱.结果:利用蛋白纯化试剂法提取的胸腺组织蛋白2-DE凝胶图像纵条纹、横条纹以及背景都明显减少,获得蛋白点数量较其他2种方法增加(P均＜0.05).结论:采用蛋白纯化试剂法提取胸腺组织蛋白,能够获得较好2-DE凝胶图像,为胸腺组织蛋白质组学的研究打下基础.     

LuxS基因缺失对变形链球菌蛋白表达的影响

目的通过双向电泳技术对比研究变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白质的表达差异,为进一步研究LuxS信号系统对变形链球菌致龋毒力的调控机制奠定基础。方法提取变形链球菌标准株及LuxS突变株的菌体总蛋白质,采用双向电泳技术对比研究两者蛋白质的表达差异,找出差异蛋白点。结果与标准株菌体总蛋白2-DE图谱相比较,LuxS突变株菌体总蛋白2-DE图谱中有61个斑点的蛋白质表达量发生了改变:36个点蛋白质表达量升高,25个点蛋白质表达量降低。结论变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白存在明显的差异,表现为2-DE图谱蛋白斑点染色的深浅不同,提示LuxS突变株菌体总蛋白发生了量的变化。     

霍乱弧菌菌体蛋白双向电泳技术的建立

目的 建立霍乱弧菌全菌体蛋白的双向电泳技术,获得分辨度高、重复性好的双向电泳图谱.方法 利用适当的裂解液处理霍乱弧菌,提取全菌蛋白;采用pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳;考马斯亮蓝染色后获得的双向电泳图谱,并利用ImageMaster 2D Elite 5.0图象分析软件进行分析,所得的数据用SPSS15.0进行统计分析.结果 得到了(1081±16)个蛋白斑点,蛋白主要集中在pI 4.24～7.20之间,重复胶的匹配点数为(1057±28),匹配率为97.85%.结论 建立了霍乱弧菌全菌双向电泳分析方法,2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性非常高,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础.     

对卵巢恶性肿瘤组织蛋白质双向电泳图谱的初步分析

目的构建卵巢恶性肿瘤组织的蛋白质表达谱,为进行卵巢良、恶性肿瘤组织蛋白质表达的差异分析及临床早期诊断奠定基础。方法取人卵巢恶性肿瘤组织,提取蛋白质,进行双向电泳分离,银染获得其蛋白质电泳分离图谱,利用PDQuest 2D分析软件进行图像分析,结合Swiss-Prot蛋白质数据库对蛋白质斑点进行初步鉴定。结果双向电泳图谱显示2-DE图谱上有212个蛋白质斑点,主要集中在pH 4.75~9.21之间,其中高丰度蛋白有36个点,低丰度的蛋白质斑点有176个,对其中3个高丰度蛋白质斑点初步鉴定可知这些蛋白质为:E2F6I、I2A、EZH1。结论本实验构建了人卵巢恶性肿瘤组织蛋白质的双向电泳图谱,其分离、染色效果好,能满足2-DE专业软件分析的要求,为后续卵巢良、恶性肿瘤组织的蛋白质组研究奠定了基础。     

卵巢恶性肿瘤组织蛋白质的双向电泳及初步分析

目的:初步构建卵巢恶性肿瘤组织细胞的蛋白质表达谱,为进行卵巢良、恶性肿瘤组织细胞蛋白质表达的差异分析及临床早期诊断奠定基础.方法:取人卵巢恶性肿瘤组织,提取蛋白质,双向电泳分离,银染获得全细胞蛋白质的电泳分离图谱,利用PDQuest 2D分析软件进行图像分析,结合Swiss-Prot蛋白质数据库对蛋白质斑点进行初步鉴定.结果:双向电泳图谱显示2-DE图谱上有212个蛋白质斑点,主要集中在pH 4.95～6.81之间,其中高丰度蛋白有36个点,低丰度的蛋白质有176个,对其中3个高丰度蛋白质斑点初步鉴定可知这些蛋白质分别为:PSE1,IRX5,RN5A.结论:本实验构建了人卵巢恶性肿瘤组织细胞蛋白质的双向电泳图谱,其分离、染色效果好,能满足2-DE专业软件分析的要求,为后续卵巢良、恶性肿瘤组织细胞的蛋白质组研究奠定了基础.     

中医证侯血浆蛋白质双向凝胶电泳方法的建立及优化

目的建立中医证侯血浆蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)方法并对其进行优化。方法以正常人血浆样品为研究对象,对白蛋白/IgG球蛋白去除后血浆样品、全血浆和热SDS法全血浆样品进行pH梯度2-DE分离,凝胶经硝酸银染色后,利用PDQuest软件对2-DE图谱进行重复性分析,并对不同处理方法的全血浆2-DE图像的结果进行比较。结果与全血浆直接上样2-DE凝胶图谱比较,白蛋白/IgG球蛋白去除后血浆上样双向电泳蛋白有所增多,但由于白蛋白/IgG球蛋白去除过程中的非特异性吸附,造成了同一样品在蛋白质图谱上的明显差异;与全血浆直接上样和白蛋白/IgG球蛋白去除后血浆样品上样2-DE凝胶图谱比较,热SDS法处理血浆样品可以得到更多的蛋白质,且重复性好(P<0.05),凝胶硝酸银染色显示蛋白质点染色深、分散清楚。结论热SDS法全血浆上样2-DE分析法具有蛋白丢失少、操作简便、重复性好的特性,是证侯血浆蛋白质组学研究的有效手段。     

鱼腥草叶片总蛋白的提取及双向电泳体系的建立

[目的]比较鱼腥草叶片蛋白质提取方法,建立适用于鱼腥草蛋白质组双向电泳分析方法.[方法]以鱼腥草叶片为材料,分别采用凯基试剂盒、三氯乙酸/丙酮沉淀法、尿素/硫脲提取法及酚法4种方法提取鱼腥草叶片总蛋白,使用Bradford 法测定蛋白质浓度,计算蛋白提取率,并对所提取的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)分析,所得2-DE凝胶图片采用PDQuest软件进行分析.[结果]4种方法的提取率分别为2.90、2.55、3.90、3.80 mg/g,分别检测到186、153、356、315个蛋白点,酚法提取蛋白质的2-DE图谱效果较好,结果的重复性较好.[结论]不同方法提取鱼腥草叶片总蛋白的2-DE结果存在差异,以酚法提取的2-DE效果较好,适用于鱼腥草叶片蛋白质组分析.     

HeLa细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的:建立和优化HeLa细胞蛋白质组分析所需的样品处理方法和双向电泳技术.方法:用三种不同配方的裂解液提取HeLa细胞中的蛋白质,进行双向凝胶电泳,用Amersham ImageMaster VDS-CL型凝胶成像系统获取凝胶图像,以PDQuest(7.4.0)软件进行比较分析.结果:联合使用硫脲和尿素有利于蛋白质的提取,增加碱性蛋白点的检出数量;广谱蛋白酶抑制剂的使用可大大增加双向电泳可检出的蛋白点数,同时使可检出的碱性蛋白点明显增加.结论:本文建立了HeLa细胞双向电泳分析方法,提高了2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为其蛋白质组学进一步研究奠定了基础.     

重症肌无力胸腺组织蛋白质组双向电泳方法的建立

目的:建立和优化重症肌无力(MG)胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法.方法:提取MG患者(n=3)增生型胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向.在以上过程中分别对蛋白提取、等电聚焦程序(A、B、C、D)和凝胶染色方法等各个实验环节进行控制和优化,利用PDQuest 7.1.1软件分析获得的二维凝胶图像.结果:①采用一步法提取胸腺组织蛋白质,第一向等电聚焦采用7cm IPG胶条,聚焦程序选择B,硝酸银染色.3例标本重复4次,共获12幅二维凝胶图像.随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅中的蛋白点进行匹配,匹配率为82.1%;3份样品共12幅凝胶图像的对比,获得3个共同存在的标志蛋白点,相对分子质量和等电点分别为:A点(82 700,7.0)、B点(50 700,5.76)和C点(33 300,5.02).②进一步优化上述实验条件,选择1例标本,采用两步法提取胸腺组织蛋白质,选用17 cm IPG胶条,聚焦采用程序D,考马斯亮蓝染色,获得的二维凝胶图像与一步法(其他条件相同)比较.一步法可检测到蛋白质点326个,两步法可检测到562个蛋白点.结论:①建立了MG胸腺组织蛋白质组提取的方法.采用两步法可以更有效地提取胸腺组织蛋白质组.②利用优化后的实验方法,获得了MG胸腺组织蛋白二维凝胶图像,为开展MG胸腺组织蛋白质组学研究打下了基础.     

人骨肉瘤蛋白质组双向凝胶电泳图像分析方法的建立与应用

目的： 建立人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法。方法： 组织标本分为骨肉瘤组和肿瘤旁组。对第一向双向电泳的关键因素与环节进行一系列优化。分离骨肉瘤总蛋白，银染，用ImageMasLer 2D Elite 3.01分析软件分析图谱，使用基质辅助电离解析飞行时间质谱仪主要高丰度部分差异蛋白质进行鉴定。结果：获得分辨率和重复性好的双向电泳图谱。变异系数平均值（%）和变异系数范围（%）：骨肉瘤组为23.00±10.11和3.80～6.89，肿瘤旁组为20.33±9.90和2.70～6.89。同一蛋白质斑点在3次实验中等电点、分子量的相对标准差分别为（8.93±1.17）%、（10.16±2.02）%和（10.87±3.86）%。初步鉴定11个蛋白，其中9个蛋白质只在骨肉瘤中特异高峰度上调表达，分别为转甲状腺素蛋白、磷酸甘油醛异构酶、慢收缩骨骼肌钙蛋白T、心肌钙蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、膜联蛋白-5、 热休克蛋白-1及Fanconi anemia groupD2蛋白；鉴定2个蛋白，锰超氧化物歧化酶、碳酸酐酶蛋白质下调表达。结论：成功构建了用于研究骨肉瘤蛋白质组双向凝胶图谱分析方法，认为初步鉴定的部分差异蛋白可能为骨肉瘤的关联蛋白，其在骨肉瘤发生和进展的病理过程中具有重要作用。     

鼻息肉的2-DE图谱建立和蛋白质组学分析

目的:建立鼻息肉及鼻黏膜双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)图谱,鉴定差异表达蛋白质。方法:收集鼻息肉及鼻黏膜样本各7例,采用固相pH梯度2-DE,凝胶银染,扫描图像,ImageMaster2-DE软件比较分析等方法,识别差异表达蛋白质,通过质谱分析得到相应肽质指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),采用PeptIdent软件查询Swiss-Protand TreMBL数据库,鉴定差异表达蛋白质。结果:建立了鼻息肉和鼻黏膜蛋白质的2-DE图谱。鼻息肉和鼻黏膜3块凝胶的平均蛋白质点数分别为825±78和936±62;平均匹配点数为682±96和821±78,匹配百分率为82.7%和87.7%;同一鼻息肉的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(IEF)方向偏差为(1.06±0.14)mm,在SDS-PAGE方向偏差为(1.45±0.21)mm。比较分析两种组织各7例样本的2-DE图谱,鼻息肉和鼻黏膜蛋白质点数为1458个和1617个,平均匹配点数为1026个。质谱分析差异蛋白质点40个,获取34张PMF,查询数据库鉴定出蛋白质24个。结论:建立了分辨率高和重复性好的鼻息肉及鼻黏膜2-DE图谱,识别鉴定出一些与鼻息肉病变相关的蛋白质。     

联用2-DE和MALDI-TOF-MS技术筛查胃癌组织和血清中的差异蛋白质

目的 分别建立肠型、弥漫型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,从中发现有意义的胃癌肿瘤相关标志物.方法 采用双向凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE）分离组织和血清总蛋白,经硝酸银染色,分析选取有表达差异的蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白.结果 获得重复性和分辨率较好的胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,经MALDI-TOF-MS鉴定得到20种蛋白,在7例（58.3%）肠型胃癌组织中均有硒结合蛋白1（SBP1）表达,KIAA基因家族蛋白在弥漫型胃癌组织和血清中均有表达.结论 建立了弥漫型肠型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,获得了差异蛋白质点,为寻找胃癌的特异蛋白质作为胃癌肿瘤标志物奠定了基础.     

白念珠菌总蛋白质组二维电泳条件的建立和优化

目的:建立并优化白念珠菌总蛋白质组分析的二维电泳条件.方法:以白念珠菌国际标准菌株SC5314为材料,制备其总蛋白质组样品.以真菌细胞破碎方法、裂解液成分、上样量、固相pH梯度胶条的选择为侧重点,通过不同条件下电泳图谱的比较建立最佳二维电泳技术条件.结果:成功建立白念珠菌总蛋白质制备方法,优化了白念珠菌蛋白质组分析的二维凝胶电泳技术,获得重复性和分辨率都较理想的白念珠菌总蛋白质二维电泳图谱.结论:优化后的二维电泳条件符合白念珠菌的特点,为白念珠菌蛋白质组分析奠定基础.     

Hela细胞蛋白质分离和肽质量指纹谱鉴定方法的建立

目的研究Hela细胞总蛋白质的分离及利用肽质量指纹谱对蛋白质进行鉴定的方法。方法提取了Hela细胞的总蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行了分离,并应用图像扫描仪及图像分析软件获取蛋白质点的数字化信息。对其中不同丰度的蛋白质点,进行胶内酶切后,通过基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱(MALDIO-TOF-MS)分析,再将检测出的多肽质量数通过Mascot搜索引擎检索NCBInr数据库。结果获得了Hela细胞总蛋白质双向电泳图谱及蛋白质点的数字化信息,通过MALDIO-TOF-MS检测得到的肽质量指纹谱再经过网上公共数据的检索从而获得3个蛋白质点分别是α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、γ-肌动蛋白(γ-actin)和过氧化物酶2(peroxiredoxin 2)。结论Hela细胞总蛋白质双向电泳的分离效果较好,肽质量指纹谱法能有效地对Hela细胞的蛋白质斑点进行鉴定。     

脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证蛋白质组学比较研究

目的 建立脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,初步分析其差异蛋白质表达情况.方法 双向凝胶电泳(2-DE)分离脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清标本,考马斯亮兰染色,PD-QUEST图像分析系统分析,从凝胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质量指纹图谱(PMF),Mascot软件搜索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质,对差异蛋白质进行组间对比.结果 获得了分辨率较好的脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证双向凝胶电泳图谱,质谱分析了29个差异蛋白质点,获取了87张肽质量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了29个蛋白质,其中部分蛋白质与肝阳化风证及阴虚风动证发生发展有关.结论 建立了脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分差异蛋白质点,为脑梗死肝阳上亢证与阴虚风动证与正常组血清双向凝胶电泳图谱血清蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据,并认为蛋白质组学能在脑梗死不同证型具有代表意义.     

单种群杆菌简单波动生长的数学模型

目的：量化探讨单种群杆菌简单波动生长的过程，定量认识单种群杆菌产生简单波动的原因。方法：以奇异变形杆菌为研究对象，以生物实验研究方法和数学研究和数学演绎推理二者结合进行讨论。结果：在经典Ｌｏｇｉｓｔｉｃ模型基础上，得到描述单种群杆菌简单波动生长的推广Ｌｏｇｉｓｔｉｓ模型。结论：该模型及解定量直观地反映了细菌增殖－扩散、增殖的自组织过程。     

奇异变形杆菌质粒转化方法的比较研究

目的 对非工程菌奇异变形杆菌的质粒转化方法及质粒载体的选择进行探讨。方法 采用了3种不同的转化方法：氯化钙法、硫酸镁法和高压电穿孔法;两种不同的质粒：pUC19和pMD101,对工程菌大肠杆菌HB101及非工程菌奇异变形杆菌进行质粒转化试验。结果 3种转化方法的比较试验说明,高压电穿孔法受菌株间差异的影响最小,可作为不同菌株间通用的转化方法;细菌传代及质粒丢失试验显示,广宿主质粒pMD101在大肠杆菌及奇异变形杆菌体内均可稳定复制。结论 选择高压电穿孔转化法及广宿主质粒是非工程菌参考菌株构建成功的关键。