基因芯片的制备研究

目的：建立基因芯片的制备技术。方法：基因样本准备,将带荧光标记的ＰＣＲ产物用点样仪点于玻片介质上,并经过点样后处理制备成基因芯片,用扫描仪测定前后芯片上荧光强度的变化,计算ＤＮＡ固定率,分别设计了５种玻片３种固定条件和６种点样后处理方法的固定率测定。结果：对芯片制备的各种条件和方法优化实验表明,ｃＤＮＡ的氨基修复,点样后的ＵＶ交联和芯片室温干燥处理能有效提高ＤＮＡ的固定率。结论：本研究建立的基因芯     

微阵列芯片技术在耐多药结核病临床诊断中的应用研究

目的 探讨微阵列芯片技术在耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis,MDR-TB）临床诊断中的应用。方法 收集2020年6月至2021年5月经滨州市中心医院确诊的245例住院肺结核患者的标本（痰液标本125例和痰培养分离菌株120例）。痰液标本同时采用DNA微阵列芯片技术和传统培养法检测其结核杆菌阳性率。痰液标本和分离菌株均采用DNA微阵列芯片技术进行肺结核耐多药检测和分枝杆菌菌种鉴定。结果 125例痰液标本经DNA微阵列芯片技术和痰培养法检测,阳性率分别为58.4%（73/125）和24.8%（31/125）,两种方法比较差异有统计学意义（2=14.520,P<0.001）。采用DNA微阵列芯片技术检测125例痰液标本和120例分离菌株,共检出结核分枝杆菌复合群192例,非结核分枝杆菌7例。结核分枝杆菌复合群192例检出耐药者41例,其中耐异烟肼15例,耐利福平19例,同时耐两种药物7例。非结核分枝杆菌包括胞内分枝杆菌4例,堪萨斯分枝杆菌2例,鸟分枝杆菌1例。结论 DNA微阵列芯片技术检测周期短,能同时进行结核分枝杆菌耐多药检测和菌种鉴定,对MDR-TB的早期诊断和治疗有较大的临床应用价值。     

应用PCR方法扩增IS6110保守片段快速鉴定结核分支杆菌

目的：了解PCR方法快速鉴定结核分支杆菌的可靠性，探索快速诊断结核病的实验方法。方法：应用PCR方法扩增149株结核分支杆菌临床分离株的IS6110保守片段，并与结核分支杆菌H37Rv标准株进行比较。结果：149株临床分离株中，140株可以扩增出与结核分支杆菌H37Rv标准株相同的123bp DNA片段(敏感性达93．9％)，而阴性对照均不能扩增出该片段。结论：应用PCR方法扩增IS6110保守片段来鉴定结核分支杆菌，结果准确可靠，且具有方便和快速等优点，有较大的临床应用价值。     

戊型肝炎病毒诊断基因芯片制备的初步研究

目的制备戊型肝炎病毒诊断基因芯片并进行杂交验证。方法利用Oligo6.0软件针对戊型肝炎病毒诊断基因保守区域设计多对寡核苷酸探针,用芯片点样仪将其按照阵列设计打印在玻片上制备成基因芯片。样品标记采用限制性显示技术,样品标记后进行杂交,进而在芯片扫描仪中对得到的探针数据进行分析并实验验证。结果芯片杂交后得到的探针荧光强度好,信噪比高,符合临床样品的基因亚型,RT-PCR验证后得到的电泳结果与芯片实验一致。结论实验设计并制备的寡核苷酸戊型肝炎病毒诊断芯片能用于戊肝的检测,为这项疾病的实验室诊断提供了一种快速平行的检测方法。     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

应用寡核苷酸探针阵列法快速鉴定临床分离株中的分支杆菌

目的:建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法:通过16S rRNA聚合酶链反应(polym erase chain reaction,PCR)-单链构象多态性(single-stranded conform ation polymorph ism,SSCP)分析鉴定253株分支杆菌临床分离株;应用16S rRNA PCR-寡核苷酸探针与待测菌株生物素标记的16S rRNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果:分析28种分支杆菌标准菌株和9种非分支杆菌菌株,结果显示寡核苷酸探针是特异的。253株分支杆菌临床分离株,198株为结核分支杆菌复合群,55株为非结核分支杆菌。经寡核苷酸探针阵列法分析,198株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,36株鉴定为非结核分支杆菌,分别与相对应的特异探针杂交,另19株与分析探针杂交阴性。结论:16S rRNA PCR-寡核苷酸探针阵列法灵敏度高、特异性强、简便、快速,可用于鉴定临床分离株分支杆菌菌种。     

临床肺结核治疗中耐药性分析及对策

目的:了解从分离自肺结核患者的结核分枝杆菌耐药基因突变率及耐药情况,以利抗结核治疗中药物的合理选用。方法:对痰涂片阳性的新发初治和复治肺结核患者进行痰结核分枝杆菌培养,阳性菌株采用高、低两种药物浓度,四种抗结核药物耐药性测试,同时用实时PCR法对结核分枝杆菌的耐药基因和突变进行检测。结果:127例痰培养阳性菌株总耐药率为14.2%,其中初治耐药率8.1%,复治耐药率35.7%,对四种抗结核药物的耐药率依次为异烟肼8.7%,利福平2.4%,链霉素2.4%,乙胺丁醇0.8%。耐药基因检测结果,在初治组中rpoB和katG的突变率为12.1%(12/99)和10.1%(10/99);复治组中rpoB和katG的突变率为32.1%(9/28)和21.4%(6/28)。结论:分离自肺结核患者的结核分枝杆菌在初始治疗时已存在耐药性,而药物治疗有可能使其耐药性增加。结果表明抗结核治疗前及在治疗过程中对结核分枝杆菌进行耐药性及耐药基因检测对指导临床抗结核治疗很有实际意义。     

H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核模型的研究

目的探索利用H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核病理模型的方法。方法对经过福氏佐剂免疫和致敏的豚鼠,行膝关节腔H37Rv菌株两种菌量(1×107/mL,50μL及100μL)的注射感染,观察豚鼠感染结核菌后膝关节滑膜组织及关节软骨与骨的病理变化,并行膝关节滑膜集菌培养。结果豚鼠膝关节在行两种菌量的H37Rv菌株感染后,局部肿胀均较明显,但动物的全身反应都较轻微。两组动物的膝关节滑膜病理切片均显示有典型的结核结节及其内的干酪样坏死灶形成;切片抗酸染色均检出有抗酸染色阳性的分枝杆菌;两组动物的关节滑膜匀浆培养均有结核分枝杆菌生长。结论通过在经预先免疫与致敏豚鼠的膝关节局部进行适当剂量的H37Rv结核菌株的注射感染,可以构建出与人类滑膜结核病理变化相似的豚鼠膝关节滑膜结核。     

依赖利福平结核分枝杆菌Rv0341抗体阳性初治肺结核患者的临床特点分析

目的 探讨依赖利福平结核分枝杆菌(简称依R菌)Rv0341抗体阳性初治肺结核患者的临床特点.方法 纳入42例依R菌Rv0341抗体阳性的初治肺结核患者作为研究组,45例依R菌Rv0341抗体阴性的初治肺结核患者作为对照组,对两组的临床症状、X线影像学表现、痰结核分枝杆菌和依R菌培养阳性率、治疗效果等方面进行对比分析.结果 研究组咳痰、咯血、气促的发生率明显高于对照组(P＜0.05);X线影像学表现研究组病变更多累及双肺及多个肺野(P＜o.05),对照组病变更多局限于单肺和一个肺野(P＜o.05),且研究组出现空洞的比率高于对照组(P＜o.05);在痰结核分枝杆菌培养阳性率上两组差异无统计学意义(P＞0.05),但研究组痰依R菌培养阳性率组明显高于对照组(P＜0.05);对照组的治愈、好转率高于研究组(P＜0.05),对照组治疗无效的比例也低于研究组.结论 依R菌Rv0341抗体阳性初治肺结核患者具有临床症状重,病变范围广,易出现空洞,依R菌培养阳性率较高,治疗效果欠佳的特点、.     

结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定

目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒进行序列测定。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP6 5。结论 :以HSP6 5编码基因为基础的真核表达载体构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础     

DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因的研究

目的采用DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌INH耐药基因,为临床诊治提供实验依据。方法应用DNA微阵列芯片法和改良罗氏培养加比例法药敏试验对疑似结核病患者的150份痰液标本进行检测,并对检测的结果进行比较分析。结果 150份痰液标本的涂阳率为60.0%(90/150),DNA微阵列芯片法检测到结核分枝杆菌阳性率为62.7%(94/150),改良罗氏培养法阳性率为60.0%(90/150),比例法药敏试验异烟肼的耐药率为43.9%(36/82),异烟肼的kat G/inh A基因总突变率为35.1%(33/94);以改良罗氏培养加比例法药敏试验为标准,DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌阳性、异烟肼耐药性和敏感性的符合率分别为97.7%、86.1%和100.0%。结论 DNA微阵列法可快速准确地检测大部分疑似结核病临床标本的kat G和inh A基因突变,可用于临床耐药性的检测从而指导临床用药,也可用于临床诊断中的推广。     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

Poly-L-Lysine玻片在寡核苷酸芯片制备中的改进

目的 为了制得适合固定未修饰寡核苷酸的芯片，提高检测灵敏性，对Patrick Brown实验室的多聚左旋赖氨酸包被玻片的方法进行改进。方法 玻片经清洗后用缩水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷进行硅烷化，然后应用Poly-L-Lysine在玻片表面形成聚合物涂层，经次亚苯基二异硫氰酸盐表面活化后可使寡核苷酸共价连接在芯片表面。设计了各种实验考察方法改进前后芯片表面的性能，并将改进后的玻片初步应用于SARS冠状病毒寡核苷酸芯片检测中。结果 方法改进后芯片表面性能优良：固定效率高、点的同一性好、杂交效率和热稳定性好、寡核苷酸结合牢固、芯片可以重复利用。结论 利用共价连接，方法改进后的芯片表面适合固定未修饰的寡核苷酸，解决了寡核苷酸与玻片之间物理结合不稳定、易剥离的缺陷，提高了芯片检测的灵敏性。     

HIV/AIDS患者合并分枝杆菌感染及耐药性分析

目的了解HIV/AIDS患者合并分枝杆菌感染及其耐药状况。方法对601例HIV/AIDS患者标本用中性改良罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基和BacT/ALERT 3D 240全自动培养仪同时进行分枝杆菌培养;培养阳性者用硝基苯甲酸（PNB）培养基、噻吩-2-羧酸肼（TCH）培养基进行菌种初步鉴定和用绝对浓度间接法进行8种抗结核药物敏感性试验。结果分枝杆菌培养阳性116例,检出率为19.30%;其中结核分枝杆菌93株,检出率为15.41%,非结核分枝杆菌23株,检出率为3.89%;93株结核分枝杆菌总耐药率为26.88%,耐多药率（MDR-TB）为7.53%,广泛耐药率（XDR-TB）为1.08%;23株非结核分枝杆菌总耐药率为100%。并且多数呈多重耐药。结论HIV/AIDS患者并发分枝杆菌感染率及其耐药率较高,尤其是非结核分枝杆菌耐药率更高,对HIV/AIDS患者疑为分枝杆菌合并感染时,应对相关标本进行分枝杆菌培养、鉴定和药敏试验,以便指导临床合理用药。     

非结核分枝杆菌临床分离株的流行病学及临床特征分析

目的 分析台州市非结核分枝杆菌临床分离株的流行病学及临床特征，为非结核分枝杆菌病的疫情监测和诊断治疗提供参考依据。方法 回顾统计分析我院于2015 年1 月～2019 年12 月间检到的非结核分枝杆菌的分离率、菌种分布、混合感染情况、性别年龄构成和临床特征等。应用DNA 微阵列芯片法对分枝杆菌进行菌种鉴定。结果 5年间共检到非结核分枝杆菌331 株，分离率为19.0%，且逐年增加。检到的主要为胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌，以胞内分枝杆菌最为常见，占57.7%。男性高于女性，50 岁以上高发。非结核分枝杆菌感染者常合并有肺结核、支气管扩张、肺部感染和慢性阻塞性肺疾病，临床表现多以咳嗽、咳痰首次就诊。结论 台州市非结核分枝杆菌的分离率和患病率逐年增加，以胞内分枝杆菌最为常见，DNA 微阵列芯片法可以用于分枝杆菌的快速鉴定。     

巢式聚合酶链反应在支气管内膜结核诊断的价值

目的：了解巢式聚合酶链反应(NPCR)技术对支气管内膜结核(EBTB)的诊断价值。方法：应用巢式聚合酶链反应(NPCR)对22例支气管内膜活检组织进行结核分支杆菌DNA检测，并与病理检查、刷检涂片、支气管镜检后痰涂片结果比较。对照为26例支气管肺癌患者。结果：22例EBTB活检组织病理检查、刷检涂片、支气管镜检“漱惹”后痰涂片及NPCR检测阳性率分别为9％、18％、27％和64％，后者与前三者相比差异有显著性(P均＜0．01)。22例支气管肺癌患者结核分支杆菌DNA的NPCR均阴性。结论：巢式PCR技术有利于EBTB患者的诊断，尤其对胸片(或CT)正常、痰菌阴性、支气管内膜活检组织未发现结核特异性病理变化者。     

聚合酶链反应—微孔板杂交法检测结核杆菌的临床应用及其评价

OBJECTIVE: To evaluate the clinical application and feasibility of polymerase chain reaction-microwell plate hybridization assay in the detection of Mycobacterium tuberculosis. METHODS: 1130 specimens with strong suspicion for mycobacterium tuberculosis were collected from the hospitals and were detected by fast bacilli stain, culture, PCR-electrophoresis and PCR-microwell plate hybridization respectively. The laboratory results were analyzed in combination with the symptoms and signs of patients and the observations on treatment. Also detected were 100 samples from the clinically evidenced non-tuberculosis patients. RESULTS: In the 100 samples collected from the patients without tuberculosis, the PCR-hybridization method and culture method did not detect Mycobacterium tuberculosis, but the fast bacilli stain method and PCR-electrophoresis method brought out one and two false-positive results respectively. The results of testing the 1030 clinical samples which probably contained Mycobacterium tuberculosis demonstrated that the PCR-hybridization method had the highest positive rate (481/1030) among the four methods, and the positive rates of the other three methods were PCR-electrophoresis (406/1030), culture (365/1030) and fast bacilli stain (256/1030) in proper order. The chi-square test showed that there were significant difference between the PCR-hybridization method and the other three methods respectively (P < 0.0083 or P < 0.0017). CONCLUSION: PCR-Hybridization method is specific, sensitive, accurate and fast in detecting mycobacterium tuberculosis; it is worthy to be used clinically.     

实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用及价值.方法:以我院确诊为结核病且未经治疗的患者392 例作为实验组,同时选取健康体检人群100 例作为对照组.分别对两组患者取静脉血,并对其血浆中结核分枝杆菌DNA 采用实时荧光定量PCR 法进行检测,同时对实验组患者进行痰涂片检查.结果:对照组患者实时荧光定量PCR 法检测全为阴性;实验组患者采用痰涂片检查,结果显示有80 例为阴性,其实时荧光定量PCR 法检测结果显示,痰涂片阳性的患者全为阳性,其阴性患者中有24 例为阳性,在对阳性患者抗痨治疗后有12 例患者转为阴性.实验组患者MTB DNA 为1.76×109 copies/mL.结论:本实验表明结核患者血浆中存在MTB DNA,采用实时荧光定量PCR 法可有效的对痰涂片阴性以及无痰患者进行诊断,有较好的利益价值.     

肺结核患者外周血中结核杆菌DNA检测的意义

用ＰＣＲ技术对肺强核患者外周血１０８例和痰９６例中结核杆菌ＤＮＡ进行检测，结果患者外周血和痰中结核杆菌ＤＮＡ阳性率分别为７７．７８％和５７．２９％；其中５２例患者外周血和痰标本配对同时检测总阳性率达９２．３％，提示外周血结核杆菌ＤＮＡ检测可提高肺结核诊断敏感性和阳性检出率，可作为肺结核诊断有用的指标。     

Tuberculin conversion in HIV seropositives

The human immunodeficiency virus (HIV) epidemic is associated with increased incidence of tuberculosis. There is a need to provide prophylaxis for the same. Mycobacterium w, a non-pathogenic, atypical mycobacterium, shares antigenic determinants with Mycobacterium leprae and Mycobacterium tuberculosis. The tuberculin response, which is a delayed hypersensitivity reaction, indicates the status of cellular immunity against tuberculosis. The objective of this study was to evaluate potential of mycobacterium w for tuberculin conversion in HIV seropositives. Fifty HIV positives (tuberculin negative) were enrolled in this study and were administered intradermal mycobacterium w. In all the patients, Mantoux test was performed to determine tuberculin like delayed type hypersensitivity reaction, by measuring the area of erythema and induration at baseline and then after ninety days. The results of the study revealed that forty-eight out of fifty, had tuberculin conversion after ninety days.