JAK/STAT信号途径参与高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化

目的：观察Janus激酶/信号转导和转录活化因子(JAK/STAT) 信号的激活对高糖诱导肾小管上皮细胞转分化的影响。方法:体外培养人肾近曲小管上皮细胞株（HKCs）,分别给予高糖和JAK拮抗剂AG490干预,采用免疫沉淀和Western印迹检测JAK2的磷酸化;Western印迹检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)及信号蛋白STAT1、STAT3、磷酸化STAT1 (phospho-STAT1, p-STAT1) 和p-STAT3的水平; 酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中转化生长因子β₁(TGF-β₁)和I型胶原的分泌,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β₁mRNA表达。结果:与低糖对照组比较,高糖培养的HKCs中α-SMA 的水平及p-JAK2 、p-STAT1 和p-STAT3 比例明显上调；E-cadherin表达明显下调；TGF-β₁ mRNA 表达增加；细胞培养上清液中TGF-β₁、Ⅰ型胶原分泌增加。AG490明显抑制JAK2磷酸化、下调p－STAT1 和p-STAT3的同时,明显抑制高糖刺激HKCs中α-SMA表达的升高，减轻E-cadherin表达下降程度；降低TGF-β₁ mRNA 表达及TGF-β₁、Ⅰ型胶原的分泌。结论:JAK/STAT信号途径参与高糖诱导的HKCs转分化，并刺激TGF-β₁和细胞外基质的分泌。     

血小板反应蛋白1在转化生长因子β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞中的作用

目的：观察血小板反应蛋白1（TSP-1）在转化生长因子β₁(TGF-β₁)诱导大鼠心肌成纤维细胞中的作用。方法: 差速贴壁法分离新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌成纤维细胞(CFs)。MTT法测CFs生长,羟脯氨酸法测CFs胶原含量,RT-PCR 法测TSP-1mRNA表达。结果: TGF-β₁诱导CFs TSP-1的表达呈浓度-时间依赖性增加(P<0.01)。TGF-β₁（20 μg/L）作用下24 h可诱导CFs增殖和胶原合成(P<0.01)。TSP-1反义寡核苷酸作用后的CFs的MTT A值、胶原含量减少(P<0.01)。结论: TGF-β₁可诱导新生大鼠CFs TSP-1表达,TSP-1反义寡核苷酸对TGF-β1诱导大鼠CFs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用,TSP-1在TGF-β₁诱导大鼠心肌纤维化中可能具有重要的作用。     

内外源性结缔组织生长因子对肾小管上皮细胞胶原合成的比较研究

目的：探讨内外源性结缔组织生长因子（CTGF）对人肾小管上皮细胞（HK2）胶原合成的作用。方法：将HK2细胞分为5组：（1）对照组；（2）TGF-β₁ 5 μg/L刺激组；（3）CTGF 5 μg/L刺激组；（4）TGF-β₁ 5 μg/L刺激＋CTGF反义ODN 3 mmol/L干预组；（5）TGF-β₁ 5 μg/L刺激＋CTGF正义ODN 3 mmol/L干预组。采用 RT-PCR 和Western blotting检测胶原Iα₁（Col Iα₁）、胶原IVα₁（Col IVα₁） mRNA水平和蛋白水平表达。 结果：TGF-β₁刺激可使HK2细胞Col Iα₁、Col IVα₁ mRNA和蛋白表达显著升高，而CTGF刺激则无此作用，CTGF反义ODN可拮抗TGF-β₁刺激引起Col Iα₁、Col IVα₁ mRNA和蛋白表达升高，正义ODN无拮抗作用。 结论：内源性CTGF介导了TGF-β₁刺激引起的HK2细胞胶原合成，外源性CTGF对HK2细胞胶原合成无影响。     

心肌细胞结缔组织生长因子的表达及TGF-β1对其表达的影响

目的： 研究纯化的心肌细胞中结缔组织生长因子（CTGF）基因及蛋白的表达，并探讨转化生长因子β1（TGF-β₁）对其表达的影响。方法: 分离培养乳鼠心肌细胞，48 h后用流式分选方法（FACS）分选纯化心肌细胞，纯化的心肌细胞继续培养48 h。分为对照组（空白纯化心肌细胞组）和TGF-β₁刺激组，用RT-PCR方法测定两组细胞中TGF-β₁、CTGF、纤维连接蛋白（FN） mRNA的含量， 用Western blotting法检测两组细胞胞浆蛋白中CTGF、FN含量。结果: 心肌细胞中有较低水平的CTGF表达，在予以 TGF-β₁刺激后细胞内CTGF mRNA与蛋白含量分别提高 2.49 倍(P<0.01) 和3.63 倍（P<0.01），FN mRNA与蛋白含量分别提高 1倍(P<0.01)和4.18倍（P<0.01），而TGF-β1mRNA水平减少34%（P<0.01）。结论: 纯化的心肌细胞有CTGF的基础表达，并且TGF-β1可以明显上调其表达，提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化过程。     

银杏叶提取物对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响及其机制

目的：研究银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba, EGB)对转化生长因子β₁(transforming growth factor-β₁ TGF-β₁)诱导的人肾小管上皮细胞HK2(human tubular epithelial cells)转分化的影响及其机制。方法:复苏并传代培养HK2细胞，应用10 μg/L TGF-β₁诱导HK2细胞向间充质的转分化，给予EGB干预。应用Western印记法检测HK2细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α- 平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、NADPH氧化酶p67phox以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的表达，检测细胞培养液上清中丙二醛（malondialdehyde, MDA）的含量。结果:EGB显著抑制TGF-β₁诱导的E-cadherin下调(P＜0.05)和α-SMA上调(P＜0.05)； EGB显著抑制TGF-β₁诱导的p67phox表达增加(P＜0.05)，显著抑制TGF-β₁诱导的SOD表达降低(P＜0.05);同时，TGF-β₁显著促进了MDA的产生(P＜0.05),EGB可以部分抑制TGF-β₁刺激的MDA浓度的升高(P＜0.05)。结论:EGB显著抑制TGF-β₁诱导的HK2细胞转分化，其机制可能是EGB 抑制了TGF-β₁诱导的p67phox上调并上调SOD的表达。     

沙利度胺抑制TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系转分化为肌成纤维细胞

目的 研究沙利度胺(THD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-F)向肌成纤维细胞(MF)转分化和对已分化MF的作用。方法 体外培养HFL-F,以TGF-β1(5μg/L)诱导HFL-F向MF转分化,通过碱水解法测定羟脯氨酸含量(Hyp),免疫印迹法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,半定量RT-PCR测定α-SMA mRNA和Ⅲ型胶原(COL Ⅲ)mRNA,观察THD(50μg/L)对HFL-F向MF转分化的过程及已分化MF的影响。结果 TGF-β1诱导HFL-F 96h,诱导分化同时加入THD可抑制Hyp含量增高和COL Ⅲ mRNA表达上调(p均<0.05),可抑制α-SMA蛋白表达增加,但对于α-SMA mRNA表达没有影响。TGF-β1诱导HFL-F 96h后再加入THD可抑制COL Ⅲ mRNA的表达(p<0.05),但对Hyp含量、α-SMA蛋白表达量和α-SMA mRNA表达无明显影响。结论 TGF-β1可诱导HFL-F向MF转分化,THD可抑制这一过程中α-SMA蛋白与胶原合成。对TGF-β1诱导下已分化的MF,THD可抑制其COL Ⅲ mRNA的表达。     

结缔组织生长因子在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中的表达及其意义

目的： 观察结缔组织生长因子（CTGF）在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型中的动态表达，探讨CTGF在肾小管间质纤维化中的作用机制。方法： 将48 只Wistar大鼠随机分为UUO组和假手术（SO）组，采用左输尿管结扎术复制UUO模型，于术后1、3、7、14 d分别处死2组大鼠取左肾。采用Masson染色评定肾小管间质损伤程度；逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 方法检测肾组织转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、CTGF、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）mRNA表达；免疫组织化学方法测定TGF-β₁、CTGF、ColⅠ、PAI-1表达；Western blotting方法检测CTGF蛋白表达量的变化。结果: UUO术后1d，梗阻肾TGF-β₁ mRNA表达开始升高，第3-14d时升高更显著（P<0.01），CTGF、ColⅠ、PAI-1 mRNA水平随之逐渐升高。免疫组织化学染色发现，UUO大鼠肾小管和间质区域CTGF表达随病程进展逐渐增强；相关分析显示，UUO术后第7d，CTGF表达量与肾小管间质损伤指数、肾小管间质TGF-β₁、ColⅠ、PAI-1表达强度均呈正相关，相关系数（r）分别为0.62、0.85、0.78和0.76（均P<0.01）。Western blotting结果显示，CTGF蛋白水平在术后第3d开始上升，随病程进展更显著。结论: CTGF可通过促进细胞外基质产生和抑制细胞外基质降解双重途径诱导肾小管间质纤维化的发生和进展。     

槲皮素对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞细胞外基质积聚的影响

目的：观察转化生长因子（TGF）-β₁对大鼠肾小管上皮细胞MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ表达的影响，并探讨槲皮素的作用。方法:以大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）为研究对象，采用TGF-β₁(10 μg/L)刺激，部分实验中培养的细胞在刺激前用槲皮素(50 μmol/L)预处理90 min。MCP-1及COL-Ⅰ mRNA的表达采用RT-PCR检测。PAI-1mRNA和蛋白的表达分别采用RT-PCR和Western blotting 法检测。结果:NRK-52E 细胞在TGF-β₁刺激后MCP-1 mRNA显著上调，在2 h开始升高，8 h达高峰，呈时间依赖性；PAI-1 mRNA和蛋白的表达也显著增加；同时，TGF-β₁还显著上调Col-ⅠmRNA的表达，24 h为正常的2.4倍（P<0.05）。槲皮素预处理后，TGF-β₁诱导的MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的上调表达均受到明显抑制（P<0.05）。结论:槲皮素能够通过抑制MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的表达而部分逆转TGF-β₁诱导的肾小管上皮细胞细胞外基质的积聚，这可能有利于延缓肾间质纤维化的发生和发展。     

结缔组织生长因子在转化生长因子β诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞表型转化中的可能作用。方法： 将NRK52E肾小管上皮细胞分组处理，光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态的改变，细胞免疫组化检测ɑ-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和细胞角蛋白-18的表达，RT-PCR和Western blot检测Ⅰ型胶原的表达。 结果：TGF-β1 10 μg/L作用3 d，NRK52E小管上皮细胞失去正常的椭圆形，变得肥大，胞体拉长，扫描电镜下，见成纤维细胞状，失去上皮细胞特有的顶端-基底极性和表面的微绒毛结构，透射电镜下胞浆中见到微丝和致密体结构，骨架标志上肾小管上皮细胞较具特征性的细胞角蛋白-18表达减少,肌成纤维细胞标志性的α-SMA表达增多，Ⅰ型胶原分泌增多；加入TGF-β1中和抗体和CTGF反义寡核苷酸可以大部分阻断TGF-β的作用，而正义的CTGF寡核苷酸不能阻断TGF-β的作用。 结论： NRK52E细胞中，CTGF作为TGF-β的下游效应因子，介导了TGF-β诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

AGEs对肾小管上皮细胞转分化、1型胶原合成及smad信号通路的影响

目的:观察终末期糖基化终产物(AGEs)对正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E ）转分化、collagenⅠ合成及Smads信号通路的影响。 方法:应用自制的AGEs（AGE-BSA）刺激NRK52E细胞，采用免疫细胞化学方法检测pmad2/3核表达情况；ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β₁的浓度；RT-PCR检测TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；Western印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙粘着糖蛋白（cadherin）和1型胶原（collagenⅠ）蛋白的表达。 结果: AGE-BSA刺激15 min后pSmad2/3核表达明显增加，于30 min（68%）和24 h（76%）出现两个高峰，与刺激前及时间匹配的BSA对照组比较均有显著差异（P<0.05）；AGE-BSA以时间依赖方式上调TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；NRK52E细胞α-SMA和collagenⅠ蛋白表达高于对照组（P<0.01），E-cadherin蛋白表达低于对照组（P<0.01），细胞上清液TGF-β₁的浓度高于对照组（P<0.01）。 结论:AGEs可诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质collagenⅠ的合成。     

抗纤灵方对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路的影响

目的： 研究中药复方抗纤灵对单侧输尿管梗阻（UUO）所致肾纤维化大鼠TGF-β₁-Smad通路的影响，借以初步探讨其发挥疗效的作用机制。方法: 雄性SD大鼠18只随机分为3组，假手术组、模型组、中药治疗组。用单侧输尿管结扎术建立大鼠肾纤维化模型，抗纤灵治疗两周后检测梗阻肾羟脯氨酸含量；HE染色和电镜观察肾组织病变；采用RT-PCR检测肾组织TGF-β₁ mRNA水平；蛋白免疫印迹法检测肾组织转化生长因子I型受体（TβRI）、转化生长因子II型受体（TβRII）、Smad2蛋白表达及磷酸化变化。结果: 与假手术组比较，模型组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显增多；病理观察可见肾小球毛细血管基底膜明显增厚，间质成纤维细胞和胶原沉积明显增多；肾组织TGF-β₁ mRNA及TβRI、TβRII蛋白表达显著增多，Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均显著增多。与模型组比较，中药干预组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显减少；肾小球和肾小管基底膜仅见轻度增厚，间质成纤维细胞和胶原沉积较模型组减轻；肾组织TβRI、TβRII蛋白表达明显下调，Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均明显下调。结论: 抗纤灵可抑制单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β₁-Smad通路，抑制梗阻肾TβRI、TβRII、Smad2蛋白表达及Smad2蛋白磷酸化，从而改善梗阻性大鼠的肾间质纤维化，减少纤维化肾脏中胶原蛋白含量。     

ROCKⅠ及TGF-β1在慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠肺小动脉的表达

目的：观察Rho激酶（ROCKⅠ）及转化生长因子β₁ (TGF-β₁)在慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠肺小动脉表达的动态变化。方法: 雄性Wistar大鼠64只,随机分为8组,每组8只：初始对照组、栓塞3 d组、1周组、2周组、4周组、8周组、12周组、终末对照组。采血制备血栓,颈静脉注入,2周后第2次栓塞,全程腹腔注射氨甲环酸。达实验设定日期后,测各组大鼠平均肺动脉压（mPAP）、肺动脉相对中膜厚度（PAMT）、管壁面积/管总面积(WA/TA) 、右室肥厚指数（RVHI）,原位杂交检测ROCKⅠmRNA表达,免疫组化检测TGF-β1蛋白表达。结果: 栓塞4周组至12周组大鼠随时间延长mPAP明显增高（均P<0.01）;PAMT、WA/TA在4周后随时间延长显著增高（4周组P<0.05,8周、12周组P<0.01）;8周后RVHI较对照组明显增高(8周组P<0.05,12周组P<0.01);栓塞后ROCKⅠmRNA原位杂交染色强度随时间延长出现增高趋势（3 d组至2周组P<0.05,4周组至12周组P<0.01）, TGF-β₁蛋白免疫组化染色强度随时间延长出现增高趋势（1周组、2周组P<0.05,4周组至12周组P<0.01）。相关分析表明,ROCKⅠmRNA 及TGF-β₁蛋白与mPAP、RVHI及血管重构指标均呈正相关(均P<0.01);ROCKⅠmRNA与TGF-β₁蛋白表达呈正相关(r=0.612,P<0.01) 。结论: ROCKⅠ和TGF-β₁均可能参与慢性血栓栓塞性肺动脉高压、肺血管重构的病理生理过程,此过程中Rho/Rho激酶信号通路可能是TGF-β1发挥生物学效应的重要途径之一。     

四逆汤对兔髂动脉球囊损伤病变区TGF-β1表达的影响

目的:通过球囊损伤兔髂动脉造成动脉损伤的模型，观察四逆汤对损伤后动脉内膜的保护和修复作用以及对转化生长因子β1（TGF-β₁）的影响。 方法:雄性新西兰兔24只，随机分为对照组、模型组、四逆汤治疗组（四逆汤组），每组8只。对照组给予普通饲料，模型组和四逆汤组给予高脂饮食。饲养2周后模型组、四逆汤组兔行髂动脉内膜剥脱术。术后4周处死各组实验兔，采用ELISA方法检测血清TGF-β₁水平；HE染色观察髂动脉内膜增生情况，通过免疫组化观察TGF-β₁蛋白在血管壁的表达；采用RT-PCR方法检测血管壁TGF-β₁ mRNA的表达。 结果:病理观察可见对照组兔髂动脉管腔和管壁厚度正常，管壁光滑；模型组的管壁明显增厚、管腔明显狭窄，内膜增厚；而治疗组管壁增厚较轻，管腔狭窄较轻，内膜增厚程度减轻。对照组兔血清TGF-β₁水平明显低于模型组和四逆汤组，四逆汤组又明显低于模型组（P<0.05）。免疫组化发现对照组兔髂动脉内膜TGF-β₁的染色灰度和染色阳性面积比明显小于模型组和四逆汤组，而四逆汤组TGF-β₁的染色灰度和染色阳性面积比明显小于模型组（P<0.05）。对照组兔髂动脉TGF-β₁ mRNA表达明显低于四逆汤组和模型组，而四逆汤组TGF-β₁ mRNA的表达少于模型组（P<0.05）。 结论:四逆汤可减轻兔髂动脉剥脱术后的内膜增生和血管的狭窄, 其机制可能与抑制髂动脉损伤后内膜TGF-β₁的基因和蛋白的表达，减少TGF-β₁的产生有关。     

红霉素对吸烟大鼠肺内TGF-β1和γ-GCS表达的影响

目的： 探讨红霉素对吸烟大鼠肺内转化生长因子-β₁（TGF-β₁）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的影响以及在慢性阻塞性肺疾病治疗中的抗氧化作用。方法: Wistar大鼠30只，随机抽取20只被动吸烟4周后，10只继续吸烟8周作为吸烟组、10只吸烟加红霉素灌胃作红霉素治疗组，另10只作对照组。测定气道阻力和肺顺应性，采用免疫组织化学法、免疫细胞化学法和原位杂交法检测气道上皮细胞TGF-β₁和γ-GCS蛋白、肺泡巨噬细胞两者蛋白及其mRNA表达。结果: 吸烟组大鼠气道阻力增高，肺顺应性降低，TGF-β₁和γ-GCS蛋白及其mRNA表达均明显增高（P<0.05），红霉素治疗组气道阻力有所降低、肺顺应性增高，TGF-β₁和γ-GCS蛋白及其mRNA表达均低于吸烟组，但高于对照组（P<0.05）。吸烟组TGF-β₁与γ-GCS表达呈正相关（P<0.05），而红霉素治疗组无明显相关性。结论: 红霉素干预后吸烟大鼠肺内TGF-β₁和γ-GCS表达降低，提示红霉素可能在COPD治疗中发挥一定的抗氧化作用。     

糖尿病大鼠肾皮质细胞表型转化的探讨

目的： 探讨糖尿病大鼠肾皮质中波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）和转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达的变化规律及其相互关系。 方法： 建立STZ诱导的SD大鼠糖尿病模型；用RT-PCR法检测造模成功后第3、7、14、30、60和90 d糖尿病大鼠肾皮质中vimentin、desmin和TGF-β₁ mRNA的表达水平。结果： ①糖尿病大鼠肾皮质TGF-β₁和vimentin mRNA的表达分别从模型建立后第7 d和第14 d起逐渐增多，desmin mRNA的表达从第14 d起逐渐减少，糖尿病大鼠和对照组大鼠相比差异显著（P<0.05,P<0.01）。②糖尿病大鼠肾皮质TGF-β₁和vimentin 的mRNA表达呈显著正相关，TGF-β₁和desmin的mRNA表达却呈显著负相关,desmin和vimentin 的mRNA表达也呈显著负相关。 结论： 糖尿病大鼠TGF-β₁在肾皮质局部表达增多可能促进肾小管上皮细胞向成纤维细胞转化。     

IGFBP2、IGFBP6在TGF-β1活化的肝星状细胞中表达

目的： 观察胰岛素样生长因子结合蛋白2、6（IGFBP2、IGFBP6）在转化生长因子β₁（TGF-β₁）诱导活化后的肝星状细胞中的表达变化。方法：大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）体外培养，分别设立空白对照组（加入等量PBS）、不同浓度的TGF-β₁ 处理组，处理因素作用24 h，采用免疫细胞化学染色、Western blotting检测IGFBP2、IGFBP6在HSC-T6中的表达。结果：免疫细胞化学染色及Western blotting结果发现，TGF-β₁各处理组IGFBP2、IGFBP6的表达均较空白对照组显著增强。结论：IGFBP2、IGFBP6在TGF-β₁诱导活化后的HSC-T6中表达明显增强，IGFBP2、IGFBP 6可能参与了肝纤维化的形成。     

三氧化二砷对皮肤成纤维细胞、中性粒细胞MMPs活性,TIMP-1及TGF-β1表达的影响

目的：砒石是化腐生肌的常用中药，其主要成分是三氧化二砷（As₂O₃）。本研究通过观察As₂O₃对基质金属蛋白酶（MMPs）活性、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）及转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达影响，探讨化腐中药能否调节胶原代谢，从而治疗慢性皮肤溃疡。方法:明胶酶谱法检测大鼠中性粒细胞（PMNs）来源的MMP-9活性、人成纤维细胞（hFb）分泌的MMP-1、MMP-2的活性，免疫细胞化学法检测hFb TIMP-1、TGF-β₁的表达。结果:As₂O₃浓度在50 mg/L时可以提高大鼠PMNs来源的MMP-9的活性（P<0.01）；在0.8 mg/L可以提高hFb分泌的MMP-1、MMP-2的活性（分别P<0.01）；同时As₂O₃作用于hFb 6 h、12 h、18 h后，TIMP-1、TGF-β₁表达持续降低（P<0.01）。结论:As₂O₃在一定范围内可提高PMNs来源的MMP-9的活性；也可提高hFb分泌的MMP-1、MMP-2的活性，同时抑制hFbTIMP-1、TGF-β₁的表达。提示砷类制剂可通过提高多种MMPs的活性，降低TIMP-1的表达从而发挥化腐作用。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。     

白细胞介素1β刺激对脑微血管内皮细胞COX活性、mRNA表达和PGE2释放的影响

目的： 探讨白细胞介素1β（IL-1β）刺激不同时间对大鼠脑微血管内皮细胞（rCMEC）的环氧合酶（COX）活性及其mRNA表达和PGE₂释放的影响。 方法: 建立rCMEC培养，进行Ⅷ因子相关抗原鉴定。细胞长至融合状态后加入IL-1β（30 μg/L），分别刺激0.5、1、2、4、8、12、24 h，ELISA测定细胞内COX-1、COX-2的活性及细胞外液PGE₂含量，荧光实时定量PCR检测COX-1、COX-2的mRNA表达量，扩增产物进行熔解曲线图及琼脂糖电泳分析，并与未刺激的rCMEC作比较。 结果: ①Ⅷ因子抗体免疫组化染色可见90％以上的培养细胞呈阳性，确认为rCMEC。②IL-1β刺激4 h时细胞培养液PGE₂含量已明显高于未刺激组（P<0.05）；12 h时PGE₂含量达到最大值（P<0.01）；24 h时PGE₂含量有所回降，但与未刺激组比较仍有显著差异（P<0.05）。③IL-1β刺激不同时间rCMEC内COX-1活性与未刺激组相比无统计学差异（P>0.05）；COX-2活性在第8 h时已明显高于未刺激组（P<0.05），12 h活性达峰值（P<0.01），24 h活性有所回降，但仍具显著差异（P<0.05）。④IL-1β刺激不同时间COX-1 mRNA表达与未刺激组比较无明显差异（P>0.05）；未刺激组在本实验条件下未检测到COX-2 mRNA表达，IL-1β刺激1h时可见COX-2 mRNA表达，4 h时COX-2 mRNA表达至峰值，而后开始回降，第12 h时已未见表达。熔解曲线图显示无非特异性扩增；琼脂糖电泳可见扩增基因与目的基因长度相符，结果与荧光定量PCR一致。 结论: IL-1β作用下，rCMEC释放的PGE₂持续增加并于12h达峰值，这一过程主要与COX-2 mRNA表达激活及COX-2活性增加有关。     

莫索尼定及贝那普利对肾脏致纤维化因子影响的对比研究

目的： 应用莫索尼定(moxonidine)及贝那普利(benazepril)干预阿霉素肾病（ADR）大鼠，比较二者对致纤维化生长因子的影响。方法： 大鼠右肾切除加尾静脉注射阿霉素复制肾病模型，随机分为模型组、莫索尼定组(1.5 mg·kg^-1·d^-1)、贝那普利组(10 mg·kg^-1·d^-1)、假手术对照组，每组10只。12周测蛋白尿、血压及血生化水平；显微镜下观察肾组织改变；免疫组化检测肾组织转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、 血小板源性生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达；原位杂交测TGF-β₁ mRNA、PDGF mRNA表达。结果： 模型组大鼠尿蛋白、血压、血浆NE、AngⅡ水平、肾间质纤维化面积、肾小球体积、肾重/体重比值均显著高于对照组（P<0.01）；肾组织内TGF-β₁、PDGF、CTGF蛋白及TGF-β₁ mRNA、PDGF mRNA表达均显著高于对照组（P<0.01）；莫索尼定及贝那普利干预组，上述上调指标除血压无明显改变之外，其余都被显著抑制（P<0.01）。2种药物之间比较，贝那普利较莫索尼定更明显降低蛋白尿、血浆AngⅡ水平及下调PDGF及CTGF蛋白、PDGF mRNA表达；莫索尼定下调TGF-β₁ mRNA表达较贝那普利明显。结论： 莫索尼定及贝那普利通过抑制交感神经活性，调节致纤维化因子的表达而起肾保护作用。