环介导等温扩增检测弓形虫方法的建立

目的建立环介导等温扩增（LAMP）检测弓形虫DNA的方法。方法以构建的弓形虫B1基因质粒为阳性模板,建立LAMP检测弓形虫的方法,并进行特异性和敏感性评估,在此基础上建立LAMP检测弓形虫的定量体系及通过显色反应直接判断结果的简便方法,最后应用建立的方法对57例孕妇外周血标本进行检测。结果建立的方法仅对弓形虫DNA扩增出特有的梯状条带,酶切结果与预期相符;检测下限为每反应管10拷贝。以重组质粒制作的标准曲线,阳性反应时间与模板浓度有良好的线性关系。57例孕妇标本检测,发现2例阳性。结论本方法特异性强、敏感性高、简便快速且成本低,有望在临床检测中发挥一定的作用。     

可视化环介导等温扩增技术在肺炎支原体检测中的应用

目的建立可视化肺炎支原体环介导等温扩增(LAMP)检测体系,并对其敏感性和特异性进行验证,以期开发出适合各级医院和现场高通量检测的肺炎支原体试剂盒。方法克隆肺炎支原体P1基因质粒,并以此为模板建立LAMP体系,优化肺炎支原体LAMP体系的各组分和反应参数,添加反应指示剂羟基萘酚蓝,用已知浓度的肺炎支原体P1质粒检测体系敏感性;以相近种类支原体和细菌检测体系特异性。结果建立的可视化肺炎支原体LAMP体系能特异性检测肺炎支原体,检测限为2×102copies/m L。结论建立的可视化肺炎支原体LAMP检测体系可应用于人肺炎支原体检测,价格低廉,无需贵重仪器设备,操作简便,适合各级医院和现场高通量肺炎支原体检测。     

环介导等温扩增技术快速检测脑膜炎奈瑟菌属方法的建立

目的应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种快速敏感的脑膜炎奈瑟氏菌属检测方法。方法针对脑膜炎奈瑟菌属(ctrA)基因序列的6个区域设计4条LAMP引物(2条内引物、2条外引物),同时设计2条环引物,并对反应条件和反应体系进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性,并与普通PCR进行了比较。结果在适宜反应条件所设计引物对脑膜炎奈瑟菌的扩增的特异性及敏感性均较好,与普通PCR方法比较,LAMP敏感性比普通PCR高10倍。结论 LAMP检测速度相比PCR更快速,在60 min内即可完成扩增反应。实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测脑膜炎奈瑟氏菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用。     

环介导等温扩增技术的应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温65℃左右保温几十分钟快速进行核酸扩增的方法.由于其具有快速、简便、特异性好、灵敏度高、成本低等优...     

环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

目的 建立环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测临床标本中金黄色葡萄球菌(SA)的方法.方法 基于金黄色葡萄球菌femA基因部分序列设计一套(共4条)特异性引物,包括特异性识别靶序列上6个不同区域的两条内引物和两条外引物.通过条件优化,建立检测SA的LAMP方法.用该法检测临床分离的40株SA、12种其他革兰阳性球菌和...     

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。     

环介导等温扩增技术检测粪便幽门螺杆菌方法的建立及应用

目的:建立一种快速、简单的检测粪便幽门螺杆菌的环介导等温扩增方法(loop-medi atedisotherma lamplification,LAMP)。方法:针对幽门螺杆菌的16SrRNA基因设计4条特异性引物(2条内引物和2条外引物),优化反应条件后,对方法的敏感性、特异性进行评估,并评估检测粪便模拟标本的敏感性。结果:使用LAMP方法可以在2h内得到检测结果,加入染料后阳性结果为绿色,电泳后有明显的阶梯状条带。幽门螺杆菌的基因组DNA检测敏感性为12pg,是普通PCR的10倍,对模拟粪便标本进行检测,检测限为102CFU/mL。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌的检测结果均为阴性。结论:本研究建立的检测幽门螺杆菌的LAMP方法敏感性高、特异性强,操作简单,不需要特殊设备,是一种很有前景的检测方法。     

环介导等温扩增在病原诊断中应用

经典的病原检测和诊断方法是体外培养和显微镜技术,这种方法在临床实验室仍然是一项核心技术。但由于临床上很多病原体难以被选择培养,从而限制了它们的诊断。尤其在发展中国家,这种敏感性较低的抹片显微镜检查往往会延误治     

逆转录环介导等温扩增检测人星状病毒1型

目的:建立一种快速检测人星状病毒1型的逆转录环介导等温扩增方法.方法:针对人星状病毒ORF1a序列设计特异引物,并优化反应条件.对1株人星状病毒1型实验株和7株其他肠道病毒对照株,及80份临床粪便标本进行检测,并与RT-PCR法比较,确定该方法的特异性、灵敏性和实用性.结果:60℃反应需时1.5 h,可通过肉眼目测或电泳检测判定结果.该方法特异性较好,粪便标本中人星状病毒1型检出限为5 pg/管.临床粪便标本检测结果与RT-PCR法一致.结论:本方法实用性强,有望用于人星状病毒1型现场监测和流行病学调查.     

恙虫病东方体环介导等温扩增可视化快速检测方法的建立

目的 利用环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术,建立一种灵敏、特异和简便的恙虫病检测方法。方法 利用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V4,以恙虫病东方体热休克蛋白groEL基因作为靶序列,设计扩增引物,优化反应条件。利用恙虫病东方体标准株评估灵敏度和特异度;收集42份恙虫病血样,分别采用LAMP、普通PCR和实时荧光定量PCR方法进行验证。结果 建立的LAMP方法可在61～65℃80 min内完成恙虫病东方体的快速检测,最低检测限为10拷贝/μL,高于普通PCR方法 2个数量级,高于荧光定量PCR方法 1个数量级;对8种常见的自然疫源性疾病病原体检测均为阴性,特异度为100%;对42份恙虫病血样采用3种方法检测,阳性率一致,均为21.4%(9/42)。结论 本研究建立的恙虫病东方体LAMP可视化检测反应快速,操作简便,灵敏特异,可在基层医疗卫生机构运用推广。     

基于环介导恒温扩增法快速检测破伤风梭菌

目的 利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测破伤风梭菌的方法,以便对破伤风梭菌感染进行快速检测.方法 (1)设计针对破伤风梭菌的环介导恒温扩增检测方法.(2)对破伤风梭菌恒温扩增法进行特异性试验.(3)对破伤风梭菌恒温扩增法进行灵敏度试验.结果 (1)设计出针对破伤风梭菌的恒温扩增检测方法.(2)本恒温扩增检测方法只扩增...     

环介导等温扩增技术快速检测结核分枝杆菌核酸

摘要:目的：建立一种快速准确的检测结核分枝杆菌（MTB）核酸的环介导等温扩增（LAMP）方法。 方法：以重复插入序列IS6110为目的基因,设计LAMP引物,特异检测MTB核酸。用本法与痰涂片抗酸染色镜检法、实时荧光PCR法对100例可疑患者痰标本进行对比检查。 结果：LAMP法特异性强,仅扩增MTB复合群核酸;灵敏度高,检测限达100 fg;而实时荧光PCR检测限为1 pg。对100例疑似结核病患者痰液标本检测,涂片抗酸染色法、LAMP法、实时荧光PCR法的阳性率分别为28%、39%和38%。 结论：本研究建立的LAMP方法检测MTB核酸特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为临床快速检测MTB的新方法。     

利用环介导恒温扩增法快速检测溶组织梭菌

目的利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测溶组织梭菌的方法,研究其反应特性,以期能应用于气性坏疽临床现场检验。方法通过基因比对与引物设计,设计针对溶组织梭菌的环介导恒温扩增检测(LAMP)方法。检测该LAMP方法对溶组织梭菌及其他干扰菌的扩增情况,对其特异性进行评价。(3)检测该LAMP方法对不同浓度溶组织梭菌的扩增情况,观察其最低检测限,对其灵敏度进行评价。结果设计出针对溶组织梭菌的LAMP检测方法。该LAMP检测方法只针对溶组织梭菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性。该LAMP检测方法对溶组织梭菌的最低检测限为1×101CFU/mL,显示其灵敏度较高。结论该试验设计出了针对溶组织梭菌的LAMP检测方法,该LAMP检测方法具有良好的特异性较高的灵敏度,能够用于溶组织梭菌的临床现场检验。     

环介导等温扩增技术在下呼吸道感染常见病原体检测中的应用

目的应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测下呼吸道感染患者标本中的13种病原体,为临床快速诊断感染性疾病提供依据。方法收集疑似下呼吸道感染患者痰标本103例、肺泡灌洗液45例,常规培养分离细菌、真菌,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行细菌鉴定,同时采用LAMP技术检测13种常见病原体(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、结核分枝杆菌复合群),实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测45例肺泡灌洗液标本中肺炎支原体,LAMP法检出的结核分枝杆菌阳性标本用二代测序(NGS)技术验证。结果 148例标本中,质谱法检出率为42.6%(63/148),分离出病原菌81株;LAMP法检出率为68.2%(101/148),共检测出175种病原体。质谱法和LAMP法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的检出率差异无统计学意义(P>0.05),但LAMP法对肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌的检出率高于质谱法(P<0.05)。LAMP法从45例肺泡灌洗液中检出26例肺炎支原体,而采用RT-qPCR检出23例。148例样本中,LAMP法检出2例结核分枝杆菌复合群,并使用NGS验证为阳性。结论与传统细菌培养鉴定相比,LAMP技术具有检测快速、准确、操作简便等优势,可为临床诊疗提供可靠依据。     

海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因作为靶基因,根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物;对47株细菌(包括20株弧菌属细菌)进行LAMP和聚合酶链式反应(PCR)扩增,并做特异性比较;对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释,提取DNA后进行灵敏度的检测,并与常规PCR作比较;构建含vvhA基因片段的重组质粒,作为LAMP反应体系的标准阳性对照。结果常规PCR实验出现假阳性结果,而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增,其他样品均为阴性,无假阳性和假阴性结果,表明引物的特异性较好,加入钙黄绿素和电泳结果相一致;针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10CFU,是常规PCR(每个反应4×10~2 CFU)的10倍,呈现较好的灵敏度。重复实验过程两遍,PCR和LAMP技术检测结果稳定。结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,特别适合用于现场和床旁的快速检测。     

基于单一基因的反转录-环介导等温核酸扩增技术快速检测甲型副伤寒沙门菌

目的建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测甲型副伤寒沙门菌。方法针对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP体系。利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株DNA评价该方法的特异性及敏感性。同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本及粪便模拟标本进行敏感性检测,并利用临床样本进行初步验证。结果等温65℃条件下,30~60 min内完成RTLAMP反应,利用该方法检测130株甲型副伤寒沙门菌均为阳性,其他非甲型副伤寒沙门菌均扩增阴性。对纯菌RNA检测中检测下限为50 pg/反应,约为19 000个拷贝/反应。在以全血模拟样本的检测中,敏感性达80 cfu/ml,略高于PCR检测低限。对粪便模拟标本的检测中,对原始样品检测下限为500 cfu/g;增菌后样品检测下限为0.8 cfu/g,比PCR检测低限高2~10倍。临床样本中甲型副伤寒患者血液标本检测均阳性,而伤寒样本检测均阴性。结论建立了敏感性高、特异性好的检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP方法,为甲型副伤寒沙门菌感染的快速诊断提供了简易手段,可试用于甲型副伤寒的早期诊断。     

高灵敏度等温扩增法可视化检测血液中的病毒核酸

目的探讨便携式、可灵敏、快速检测血液标本中病毒核酸的方法。方法以HBV病毒为例,针对其基因组保守序列设计特异性引物,采用环介导等温扩增法(LAMP)对待测HBV标本做核酸目标序列扩增,以高灵敏双链DNA嵌合荧光染料为指示剂,根据荧光信号指示扩增反应产物的有无;将本法与实时荧光PCR法对临床标本做HBV检测的对照分析。结果建立了血液病毒核酸的可视化检测方法,研制出扩增检测一体化仪器;灵敏度达到可在<1 h完成10 cp/管的HBV核酸扩增反应和产物检测。62例实时荧光PCR检测为HBV阳性的临床标本,本法亦都检测为阳性;而从42例实时荧光PCR检测为HBV阴性的临床标本中,本法检出了6例HBV阳性。结论所建立的方法和装置可实现高灵敏度单管快速检测血液病毒核酸,为特殊现场环境中的血液安全性筛查提供了新的手段。     

Validation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid diagnosis of pertussis infection in nasopharyngeal samples

Objective: To develop and validate a novel loop-mediated amplification (LAMP) assay for rapid diagnosis (<1 hour) of whooping cough in nasopharyngeal samples versus the gold standard: real-time PCR.

Methods: The study included all nasopharyngeal samples (n = 213) collected from children with clinical suspicion of pertussis admitted to Children’s University Hospital Sant Joan de Déu (Barcelona, Spain) during July–December 2014. Fresh samples were routinely analyzed by real-time PCR and stored for retrospective LAMP analysis, following an easy 30 minute DNA extraction step by Chelex-100.

Results: Performance results of the LAMP assay were: linearity, 10⁵–10¹ CFU/ml; Limit of Detection, 2 CFU/ml; precision (mean CV), 7.38%; diagnostic sensitivity, 96.55%; diagnostic specificity, 99.46%; time to detection, 12–30 minutes.

Conclusion: The new test was shown to be 2.5-fold faster than real-time PCR while maintaining similar levels of analytical and clinical performance. Therefore it could become a useful diagnostic tool for molecular point-of-care testing.