GFP基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用

目的 :实现绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)报告基因在骨髓基质细胞 (BMSC)中的高效、稳定、持久表达 ,直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化。方法 :构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆、G4 18筛选及扩增 ,获得大量含GFP基因的假病毒液 ,并直接转染BMSC。将含有GFP基因转染标记的BMSC与生物可降解材料复合后 ,植入猪自体关节软骨缺损处 ,7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSC的分布及分化。结果 :经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV GFP构建成功 ,转染PT6 7细胞后可在荧光激发波长下 ,发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～ 5 0 % ,经G4 18筛选后可达 10 0 %。筛选、扩增后 ,PT6 7细胞的上清培养液可成功地转染BMSC ,筛选后能稳定、持久、高效表达GFP。将标记的BMSC植入关节软骨缺损 7个月后 ,修复组织仍能高效表达GFP ,激光共聚焦显微镜下显示 ,多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论 :构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,能持久标记骨髓基质细胞 ,用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪 ,该方法简便、灵敏、可靠、直观。标记的BMSC可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞 ,并在软骨缺损的修复中发挥重要作用     

小鼠Wnt-1基因真核表达载体构建及其在大鼠成肌细胞中的表达

目的：构建p-EGFP-C3-Wnt-1真核表达载体并转染体外培养大鼠成肌细胞,观察Wnt-1在其中的表达。方法：利用RT-PCR方法从小鼠胚脑中扩增获得Wnt-1基因编码区全长序列,克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体p-EGFP-C3上,形成重组载体p-EGFP-C3-Wnt-1。大鼠成肌细胞原代培养及desmin免疫荧光染色鉴定。利用Lipofectamine TM2000脂质体将重组质粒p-EGFP-C3-Wnt-1转染成肌细胞。结果：重组质粒p-EGFP-C3-Wnt-1构建成功;将其转染成肌细胞72 h后,观察到EGFP报告基因和目的基因Wnt-1表达。结论：成功构建了小鼠胚脑Wnt-1基因的真核表达载体p-EGFP-C3-Wnt-1,并可转染成肌细胞。     

起搏基因质粒的构建及体外转染心肌细胞的研究

目的:构建重组起搏基因质粒pIRES2-EGFP-HCN2, 并检测其在体外心房肌细胞中的表达, 探讨其构建生物起搏器的可行性.方法:对含mHCN2 cDNA的Pm载体进行转化和扩增, 将所得mHCN2基因定向克隆到真核表达载体plRES2-EGFP中, 进行双酶切来鉴定克隆的正确性.将重组质粒用电穿孔法转染心房肌细胞, 通过免疫荧光及RTPCR检测重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2在体外心房肌细胞中的表达情况.而对照组仅转染pIRES2-EGFP.结果:构建了重组质粒plRES2-EGFP-HCN2.荧光显微镜下可见转染起搏基因后的心房肌细胞呈绿色荧光, 其搏动频率较未转染的细胞及对照组明显增快(180士11次/分vs140±14次/分vs143±12次/分, P<0. 05).实验组RT-PCR及免疫荧光显示 了mHCN2 mRNA基因及蛋白的表达, 而对照组未见到该基因片段及其荧光表达.结论:成功地构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2, 并在体外心房肌细胞中成功表达, 为生物起搏的研究奠定基础.     

人心肌肌球蛋白轻链基因启动子驱动的GFP和Luc报告基因在人心肌细胞系中的表达

目的:构建人肌球蛋白2v基因启动子(pMLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体并观察其在人心肌细胞系(HCM)和人肺癌细胞株A549中的整合表达特征。方法:应用去毒化的人类I型免疫缺陷病毒和pMLC2v-GFP或pMLC2v-Luc报告基因构建慢病毒示踪载体,转染HCM和A549细胞,激光共聚焦显微镜及生物发光检测仪观察2种报告基因在不同细胞生长进程中的表达特征。非特异性启动子驱动的GFP(GFP_C)和红色荧光蛋白(RFP_C)报告基因作为对照。结果:2种细胞转染GFP_C和RFP_C后第3 d,都表达GFP和RFP;而HCM只在转染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc 21 d后表达GFP和Luc,A549细胞不表达。结论:pMLC2v主要在培养21 d后新增殖的人心肌细胞中驱动GFP和Luc报告基因表达,这为监测干细胞向心肌细胞的分化进程提供了可靠的病理及活体示踪工具。     

Sofast介导增强性绿色荧光蛋白基因转染骨髓间充质干细胞

目的:研究新型阳离子聚合物Sofast基因转染试剂(Sofast)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行基因修饰的可行性.方法:在体外分离和扩增MSCs,在Sofast介导下行pEGFP-N1转染BMSCs,倒置荧光显微镜下观察转染效率及瞬时表达情况,MTT试验检测转染细胞的存活率.结果:增强性绿色荧光蛋白(EGFP)在基因转染24 h后开始表达,48～72 h最高.1周后表达逐渐减弱;质粒与Sofast体积比例为3:1时,pEGFP-N1转染BMSCs的效率为85%,细胞存活率为94.2%.结论:Sofast介导EGFP转染BMSCs是一种较好的转染标记方法.     

阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用

阳离子脂质体已经成为基因转移使用最广泛的载体之一。本文从阳离子脂质体的理化特性、质粒/阳离子脂质复合体与生物大分子的相互作用、质粒/脂质复合体的基因转移机制等方面,对阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用进行了综述。     

人胰岛素样生长因子1基因转染对大鼠骨骼肌成肌细胞缺血再灌注损伤的影响

目的: 探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对大鼠骨骼肌成肌细胞体外缺血再灌注损伤的影响及机制。方法: 分别用pLghIGF-1SN质粒(IGF组)和对照质粒pLgGFPSN(GFP 组)转染大鼠成肌细胞。未转染的成肌细胞(control组)作为细胞对照。转染后用免疫细胞化学、RT-PCR及ELISA检测基因表达。转染后3~14 d检测各组细胞的扩增率。转染的细胞接受缺血再灌注损伤后7 d,TUNEL法检测各组细胞的凋亡百分数,RT-PCR 检测各组细胞的bax和bcl-2 mRNA的表达,Western blotting检测各组细胞caspase-3的表达。结果: 基因转染后免疫细胞化学和RT-PCR 检测发现IGF组细胞有hIGF-1表达,GFP组和control组细胞未见hIGF-1表达;IGF组细胞上清中可检测到hIGF-1的蛋白表达,control组和GFP组细胞上清中未检测到hIGF-1蛋白表达。转染后14 d,IGF组细胞的扩增率显著大于control组和GFP组(P< 0.05);细胞经缺血再灌注损伤后,TUNEL染色检测结果显示:与GFP组相比,IGF组细胞的凋亡百分比显著降低(P< 0.05);RT-PCR 检测结果显示:与GFP组相比,IGF组细胞的bax mRNA表达显著降低,bcl-2 mRNA的表达显著增加(P< 0.05);Western blotting检测结果显示:与GFP组相比,IGF组细胞caspase-3蛋白表达显著降低。结论: IGF-1基因转染可增加成肌细胞的抗凋亡能力,其机制可能和降低Bax和caspase-3表达,增加Bcl-2的表达有关。     

负载转基因成肌细胞和骨形态发生蛋白组织工程化骨修复骨缺损

背景：近年来有报道提出了睫状神经营养因子能够抑制成肌细胞体外成肌分化,可保持成肌细胞去分化状态的理论。两者可通过基因工程技术结合为组织工程化骨的构建提供种子细胞,联合骨形态发生蛋白在一定条件下促进骨缺损的修复。 目的：探讨转染睫状神经营养因子基因成肌细胞与骨形态发生蛋白通过透明质酸钠凝胶载体结合修复兔桡骨节段性缺损的效果。 方法：新西兰大白兔制备左侧桡骨中段造成1.0 cm的节段性骨缺损,缺损处以1.4 cm硅胶管桥接固定,管内植入负载骨形态发生蛋白与转睫状神经营养因子基因成肌细胞的透明质酸凝胶(实验组)、仅复合骨形态发生蛋白的透明质酸凝胶(对照组)或仅植入透明质酸凝胶(空白组)。 结果与结论：动物体内实验表明实验组的X射线阻射密度、大体标本以及病理组织学观察情况均优于对照组和空白组,对照组也优于空白组。说明应用透明质酸钠凝胶复合转基因成肌细胞和骨形态发生蛋白因子作为膜内填充物构建组织工程化骨具有可行性,其应用于修复兔桡骨节段性缺损效果理想。     

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的：构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体，建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系（human hepatocellular carcinoma cell line，HHCC）。方法：利用分子生物学方法，构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3，经脂质体法转染HHCC后，用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达，用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3 mRNA的表达。结果：成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后，经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3 mRNA转录和EGFP的表达。结论：建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC，为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。     

含RGD肽基因导入系统介导绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测

目的评价以整合素为靶向的新型非病毒载体系统——含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(记作K16R-GD)作为基因转染载体的可行性。方法固相合成法合成K16R-GD,以其为载体与不同比例的增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)混合转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),72h后用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况。结果转染效率与K16R-GD和质粒的比例有关,转染体系中K16R-GD(μg):pEGFP(μg)为3:1时EG FP有最高的表达效率。结论含RGD肽K16R-GD能有效介导外源基因在BM-SCs内的转染和表达,为下一步利用K16R-GD作为载体构建载基因仿生基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础。     

GFP mRNA在树突状细胞中的转染及其影响因素分析

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)mRNA在树突状细胞(DC)中的转染及其影响因素。方法:选用gfp报告基因,在体外利用含T7RNA聚合酶的mMESSAGERNA转录试剂盒,合成含有帽子结构的GFPmRNA,通过酵母多聚A聚合酶加尾,制备结构完整的GFPmRNA。与此同时,从人的外周血液中分离单核细胞,并在体外经GM-CSF和IL-4刺激分化为DC。通过转染试剂介导将合成的GFPmRNA转染到DC内并使其表达。采用流式细胞术检测其转染效率和表达水平。结果:体外合成GFPmRNA,经转染试剂介导,实现了gfp基因在DC中的表达。不同的转染试剂、mRNA用量和细胞密度对mRNA的转染效率有较大的影响。采用Transmes-sengerTransfectionKit转染试剂,1μgGFPmRNA在200μLX-VIVO-15无血清培养基中的转染密度为2.5×109/L的DC,可获得较好的转染效果(转染效率达27%以上)。结论:在适当的条件下,通过mRNA转染DC可获得较高的转染效率。     

大鼠成肌细胞向神经细胞的分化

目的:探讨大鼠成肌细胞转分化为神经细胞的可能性。方法:体外分离培养大鼠成肌细胞并克隆纯化,培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和二甲基亚砜(DMSO)的培养液诱导分化,进行RT-PCR分析和免疫荧光细胞化学染色鉴定。结果:经诱导后,成肌细胞在形态上类似于神经元和星形胶质细胞。RT-PCR分析显示诱导后的成肌细胞有神经丝蛋白(NF 68)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因表达。免疫荧光细胞化学检测到诱导后的成肌细胞含NF 68和GFAP免疫反应阳性产物。结论:成肌细胞在体外可以诱导转分化为神经元和星形胶质细胞。     

重组腺相关病毒对大鼠神经干细胞的体外转染及其对细胞生长的影响

目的 研究重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体对原代培养的神经干细胞（neural stemcells，Nsc）的体外转染及其对细胞增殖、分化和迁移能力的影响。方法 取新生24h内的Wistar大鼠的海马进行神经干细胞原代培养，用不同滴度的rAAV为载体，以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因作为报告基因进行体外转染NSC，通过观察有绿色荧光的NSC的数量，测定rAAV对NSC的体外转染情况；用MTT法测定不同病毒滴度下rAAV对NSC增殖能力的影响，用免疫组化法鉴定NSC、神经元及神经胶质细胞，并在倒置荧光显微镜下直接测定细胞的迁移距离。结果 rAAV对NSC的体外转染效率随着病毒滴度的增加而提高，在转染后的第11天表达水平最高，用MOI为10^4、10^5、10^6的rAAV转染后第11天的转导率分别是9．81％、56．30％、64．67％；不同滴度rAAV转染NSC后不同时间点的MTT测定A值随着病毒滴度的增加而明显减小，差异均有统计学意义；但不同滴度rAAV转染NSC，其分化为神经元和神经胶质细胞的比率以及迁移的距离未见差异。结论 较高滴度（MOI为10^5和10^6）的rAAV可以在体外有效地转染神经干细胞，且不影响神经干细胞的分化和迁移能力，但对其增殖能力有明显抑制，并表现为病毒滴度依赖性。     

用免疫组化方法鉴定转染基因nm-23-H1蛋白表达的实验体会

作者通过转染细胞(ACC-m／nm23-H1)蛋白表达经免疫组化方法分析鉴定获得满意效果这一方法．将该法与蛋白印迹方法加以比较，并进行分析评价，重新认识到该法具有许多优势。     

电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞的影响

背景：课题组早期研究表明体外一定剂量酸性成纤维细胞生长因子对骨骼肌卫星细胞增殖有促进作用。 目的：进一步验证电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞生长、增殖及分化的影响。 方法：原代培养、纯化骨骼肌卫星细胞,将带有酸性成纤维细胞生长因子基因的质粒pSectag-GFP-aFGF通过电转染的方法转染大鼠骨骼肌卫星细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率,以流式细胞仪分析转染后细胞周期,绘制细胞生长曲线,观察转染后肌管形成情况,Western Bloting检测酸性成纤维细胞生长因子基因的表达。 结果与结论：①免疫细胞化学检测：骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达。②转染效率：pSectag-aFGF质粒电转染12 h后即可看见散在发绿色荧光的卫星细胞,72-96 h达高峰,阳性表达率约90%。③细胞周期检测：电转染后S期所占的百分比明显多于未转染对照组(P < 0.05)。④细胞生长曲线检测：电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第5天后开始减少。⑤分化能力观察：电转染组肌管较未转染对照组明显减少,老化细胞较少。⑥Western-blot：酸性成纤维细胞生长因子基因在转染骨骼肌卫星细胞中表达。结果表明,通过电穿孔法可以将酸性成纤维细胞生长因子基因转染进骨骼肌卫星细胞并获得高效持久的表达,并有促进骨骼肌卫星细胞增殖及抑制分化为肌管的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

鸭乙型肝炎病毒DNA体内转染的研究

利用两种鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ双体质粒及环化的ＤＨＢＶＤＮＡ体内转染２ｄ龄鸭及４～２０ｄ龄鸭，大多数鸭产生了短暂病毒血症，少数鸭产持续病毒血症，转染鸭血清中检测得ＤＨＢｓ／ｐｒｅＳＡｇ，ＤＨＢＶＤＮＡ及ＤＨＢＶ病毒颗粒，转染鸭血清腹腔注射１ｄ龄鸭可感染成功，转染鸭肝组织检测到复制型ＤＨＢＶＤＮＡ，提示转染后既有抗原有的表达，又有病毒的复制。另外，用两种ＤＨＢＶＤＮＡ单体质粒体内转染２ｄｘ     

靶向性脂质体P-MMA-DOSPER介导pEGFP-C2脑内转染

本研究以衍生化单克隆抗体偶合脂质体脑内寻靶提高基因转移效率，探讨将脂质体构建成更理想的脑内基因转移载体的方法。将MMA（抗Lex／SSEA-1单克隆抗体）衍生化后偶联于阳离子脂质体DOSPER上构建靶向性脂质体P—MMA-DOSPER，分别使用P—MMA-IX）SPER与IX）SPER包封pEGFP—C2（增强型绿色荧光蛋白质粒），分两组注入大鼠侧脑室后第1、3、7、14d取脑制备冰冻切片，抗nestin抗体免疫荧光染色，荧光显微镜下观察基因表达情况。结果显示两组大鼠侧脑室周围均可见绿色荧光蛋白（GFP）表达，各时间点P—MMA-DOSPER组的GFP＋／nestin＋细胞在nestin＋细胞中比率均高于130SPER组，差别具有统计学意义（P〈0．01）。本研究表明P—MMA-EK）SPER能够透过脑室管膜屏障高效安全地向脑内原位神经干细胞转移基因。     

体内IFN-γ基因转染小鼠腹腔巨噬细胞抗肿瘤作用的研究

采用磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法，将ｐＲＥＰ－８－ＩＦＮ－表达质粒直接注射至小鼠腹腔，可成功地转染腹腔巨噬细胞（ＭΦ），并表达其基因产物，能有效地抑制肿瘤生长；再次基因转染，可获得增强的抗肿瘤效应。还发现转基因ＭΦ所分泌的激活因子能激活未转基因的ＭΦ；增加腹腔ＭΦ的数量；增强ＭΦ的杀瘤活性；并使ＭΦ分泌一定水平的ＮＯ、ＩＬ－１和ＴＮＦ等，进一步增强抗肿瘤作用。转基因ＭΦ及其表达产物可使脾细胞ＮＫ活性和内源性ＬＡＫ活性增强，提高机体抗肿瘤功能，为肿瘤的细胞因子基因治疗提供了一种简便而有效的抗肿瘤新途径。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体构建、转染及活性鉴定

目的 构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞,鉴定所表达蛋白活性。方法 从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序。按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,观察荧光蛋白表达,随机视野下计数转染效率。测定激光共聚焦显微镜下胞膜与胞质的荧光强度比值,鉴定其活化转位。结果 构建的真核表达质粒测序与GenBank公布的序列一致。转染后48h,荧光蛋白表达最佳,转染率为18.6%±1.6%。从胞膜与胞质的荧光强度比值,观察到蛋白的活化转位。结论 成功构建真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达及蛋白的转位,为筛选稳定表达人蛋白激酶C 2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具。     

MIP—1α基因转染的肿瘤细胞对免疫细胞的体内外趋化作用

ＭＩＰ－１α是一种对多种免疫效应细胞包括Ｔ细胞、Ｂ细胞、单核细胞及中性粒细胞等具有显趋化作用的趋化因子，通过重组腺病毒载体将ＭＩＰ－１α基因导入Ｂ１６黑色素瘤细胞后，对其体内外生物学特性进行了初步研究，结果表明。ＭＩＰ－１α基因转染后Ｂ１６黑色素瘤细胞体外生长特性无明显变化，其培养上清中ＭＩＰ－１α的分泌水平可达３６８±２４ｎｇ／ｍｌ／１０＾６／２４ｈ，上清对ＮＫ细胞，ＣＤ４＾＋细胞、ＣＤ８＾＋