大鼠下丘脑加压素样神经元的Golgi样PAP染色法

对下丘脑神经分泌细胞的研究,以往多用Nissl法和Gomori法,但这两种方法都不够敏感,且不能将加压素细胞同含其他神经分泌物(如催产素)的细胞区分开来,这在需要专一对含加压素或催产素的细胞之形态、分布与功能的研究中就显得不足了。免疫细胞化学方法则克服了上述方法的不足,而且还能显示一些用传统的神经解剖学方法所未显示的结构。然而,目前所用的免疫细胞化学方法多为使用石腊切片或较薄的冰冻切片染色的,它们虽能显示神经元的胞体与突起,但在同一切片上追踪范围有限,较难反映神经元与神经元之间的相互关系,因此,将特异的免疫细胞化学方法同较厚的切片相结合来研究下丘脑的一些肽类神经元的形态、肽类物质的含量、神经元与神经元之间的关系及神经通路是人们感兴趣的课题,在这方面,国内尚未见报道。     

培养细胞的免疫细胞化学操作体会

对培养的细胞进行免疫细胞化学反应 ,可以在培养皿内直接进行 ,亦可经树脂包埋后 ,在半薄切片上进行。本实验应用上述二种方法 ,对培养的大鼠内耳血管纹的组织细胞进行了免疫细胞化学显示。组织细胞处理 :1 )平皿培养和盖玻片上培养的大鼠内耳血管纹处组织细胞 ,经Bouin固定液固定 4h,0 .0 1 Mol/L PBS浸洗 ,0 .1 %的 Triton x- 1 0 0处理 2 0 min;2 )平皿培养的细胞经酶处理 ,离心收集 ,2 %戊二醛固定液固定 4h,经丙酮脱水与锇酸固定( - 2 0℃ )、树脂包埋、半薄切片。免疫细胞化学反应 :上述处理的细胞或切片进行免疫细胞化学反应 ,其…     

SARS-CoV功能性受体血管紧张素转换酶2在灵长类动物肾脏上皮细胞的表达(英)

目的：研究血管紧张素转换酶2 (ACE2) 在灵长类动物肾脏上皮细胞上的表达。方法：体外培养非洲绿猴肾细胞Vero E6,利用RT-PCR及免疫细胞化学的方法检测细胞ACE2的表达;利用免疫组织化学方法检测2例恒河猴和2例正常人肾组织ACE2的表达分布。结果：RT-PCR显示,从Vero E6细胞提取的总RNA经逆转录可检测出ACE2的扩增条带;免疫细胞化学方法检测到Vero E6细胞胞浆内反应明显阳性;ACE2主要分布在恒河猴和人肾组织近端肾小管上皮细胞的管腔膜和胞浆。结论：ACE2在灵长类动物肾脏上皮细胞的核酸水平和蛋白水平均有表达,主要位于细胞的管腔膜和胞浆;肾脏上皮细胞表达的ACE2为SARS-CoV的入侵提供了条件,有可能是SARS患者并发肾功能损伤的原因之一。     

吡格列酮上调ERK1/2与Bcl-2在心肌细胞缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞的表达

目的研究吡格列酮对ERK1/2与Bcl-2信号转导通路在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法取半日龄到一日龄Wistar大鼠幼鼠心室肌细胞进行体外培养,并建立缺血再灌注模型。体外培养的细胞分为正常对照组(C组)、缺血再灌注组(I组)、缺血再灌注组+吡格列酮处理组(P组)和P组+ERK1/2抑制剂PD98059处理组(P+Pd组)。采用Western-bloting和免疫细胞化学染色法检测细胞内Bcl-2蛋白的含量。结果 Western-bloting与免疫细胞化学法显示,I组Bcl-2蛋白表达水平高于C组(0.05),P组的Bcl-2蛋白表达高于I组,P+Pd组Bcl-2蛋白表达水平低于P组(0.05)。结论吡格列酮对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护可能与下调ERK1/2和Bcl-2转导通路有关。     

人抗菌肽HBD-2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

制备人β-防御素2(HBD-2)多克隆抗体,以用于HBD-2蛋白水平表达的检测。提取人肠腺上皮细胞株Caco-2总RNA,设计引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HBD-2成熟肽cDNA片段,以pGEX-1λT为载体,构建原核表达质粒pGEX-1λT-HBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,并用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,ELISA法显示抗血清对HBD-2的效价为1∶12800,Western印迹显示抗血清可识别HBD-2。本实验结果证明应用重组融合小肽代替白蛋白或甲状腺-肽偶联免疫可获得其高效价的识别HBD-2的多克隆抗体,为今后从蛋白质水平研究HBD-2基因的诱导表达,包括组织分布和基因表达调控等研究打下了基础。     

小鼠生精细胞增殖与凋亡的加龄变化研究

精子发生涉及生精细胞的增殖与凋亡等过程。精子发生中 ,约占潜在成熟精子总数 75 %的生精细胞退化。生精细胞退化通过细胞凋亡实现。本研究采用免疫细胞化学、凋亡细胞原位检测、体视学分析等技术方法对胚胎 15天至生后 10月小鼠生精细胞的增殖、凋亡进行了较系统的研究。选用健康昆明种雄性小鼠 ,分为胚胎 15、18天 ,生后 1、3、5、7天 ,2、3、4、6、8周及 6、10月 13组。增殖细胞核抗原 (PCNA)免疫细胞化学标本用 Bouin液固定 ,免疫细胞化学 SP法染色 ,多聚甲醛固定的标本用于凋亡细胞原位检测。结果表明 :胚胎18天到生后 3天 ,生精小…     

肝再生磷酸酶2缺失促进巨噬细胞的杀菌功能

肝再生磷酸酶2(protein phosphatase of regenerating liver 2,PRL-2)是肝再生磷酸酶家族成员,其在免疫系统中的作用未有研究。文章对免疫器官组织中PRL-2的表达及其在巨噬细胞中的作用进行了初探。研究发现,PRL-2在免疫组织与器官中均高表达,PRL-2~(-/-)小鼠的脾脏与胸腺中免疫细胞的类群及比例与WT小鼠相比无显著差异。体外研究显示,PRL-2的缺失不影响小鼠原代巨噬细胞细胞因子的产生及细菌吞噬能力,但PRL-2缺失后巨噬细胞杀伤细菌的能力显著增强。综上,PRL-2可能通过调控固有免疫细胞的杀菌能力在抗感染免疫中发挥作用。     

GD2免疫细胞化学染色法在检测神经母细胞瘤骨髓微小转移灶中的应用

目的探讨神经节苷脂(disialoganglioside, GD2)免疫细胞化学染色法在检测神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)骨髓微小转移灶中的应用。方法应用GD2免疫细胞化学染色法对56例NB患儿骨髓标本进行检测分析。结果 56例NB标本中,阳性47例,阴性7例,无法诊断2例。阳性结果镜下表现为神经母细胞呈小圆形,胞核圆形,胞质稀少,常聚集成团,经染色后可见围绕细胞的环状红色颗粒样沉淀。结论 GD2免疫细胞化学染色法特异性强,灵敏度高,结果准确,对于检测NB骨髓微小转移灶有重要的应用价值。     

大鼠脊髓内γ-氨基丁酸的免疫组织化学定位

以往对γ-氨基丁酸(GABA)的组织化学定位的研究,大多是应用显示其合成酶或同位素标记GABA等技术进行的。直接采用GABA单克隆抗体观察GABA在脊髓内的免疫细胞化学定位,国内外尚未见报道。本研究以大白鼠为材料,于麻醉下,经心脏灌注含1％多聚甲醛及2.5％戊二醛的固定剂,用脊髓的振动切片(厚50μm),以抗GABA单克隆抗体,按Sternberger的PAP法进行研究。结果发现,脊髓灰质内含有大量GABA能阳     

鲨鱼软骨制剂通过下调Bcl-2诱导K562细胞凋亡

目的探讨鲨鱼软骨制剂(SCP)诱导人红白血病细胞系(K562)凋亡的作用机制。方法以不同浓度SCP加入体外培养的K562细胞中,用MTT比色法检测细胞存活率;Hoechst33342/PI荧光染色,荧光显微镜分析凋亡细胞百分率;流式细胞术进行细胞凋亡定量;免疫细胞化学染色法检测Bcl-2蛋白的表达。结果SCP明显抑制K562细胞生长,IC50值为1mg/ml以下;荧光显微镜下可见50%以上细胞为凋亡细胞的形态学改变;免疫细胞化学检测显示SCP诱导细胞凋亡过程中Bcl-2表达明显降低。结论SCP诱导K562细胞凋亡,可能与下调Bcl-2表达有关。     

P2X7介导的小胶质细胞形态和受体表达的变化

目的:研究P2X7受体介导的小胶质细胞形态和受体表达的变化,探讨P2X7受体信号通路及其下游过程。方法:运用ATP刺激原代小胶质细胞,免疫细胞化学观察P2X7受体介导的细胞形态和受体表达的变化;建立表达P2X7受体的单克隆细胞模型,免疫细胞化学观察ATP刺激下P2X7受体介导的细胞形态和受体表达的变化。结果:ATP刺激下小胶质细胞和P2X7-HEK293细胞的突起变短,形态变圆,体积缩小;随着ATP刺激量的增加,P2X7受体的表达逐渐增加。结论:P2X7受体介导了小胶质细胞形态的变化。     

免疫组化染色中表面活性剂的应用

组织经福尔马林液固定 ,大量抗原决定簇被封闭 ,为了获得满意的结果 ,常用的方法是对组织切片进行抗原修复。而表面活性剂Tween - 2 0和TritonX - 1 0 0的合理应用 ,可以提高免疫组化阳性率以及背景的清晰度 ,现报道如下。1　材料与方法1 1　标本 1 0例SD大鼠空肠 (近十二指肠升部 )标本 ,修剪为 1 5mm×1 5mm。所有组织均用 1 0 %福尔马林液固定、脱水、透明、常规石蜡包埋 ,6μm厚连续切片。1 2　试剂P物质 (SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、血管活性肠肽 (VIP)等抗体为Sigma公司产品 ,免疫组化ABC试剂购于武汉博士德生物技术有限…     

降钙素基因相关肽对内皮细胞细胞间黏附分子1、NOS和组织金属蛋白酶抑制剂2表达的影响

目的：探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对内皮细胞的保护作用机制。方法：用 CGRP 分别作用于培养的正常内皮细胞和经联胺诱导的内皮细胞后,收集细胞用免疫细胞化学和 RT-PCR 方法检测细胞间黏附分子1 (ICAM-1)、一氧化氮合酶(NOS)和组织金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达。结果：联胺诱导的内皮细胞可使 ICAM-1的表达增强,而使 NOS 和 TIMP-2的表达下降。当 CGRP 作用于正常内皮细胞和联胺诱导后的内皮细胞,对 ICAM-1的表达有明显的下调作用,对 NOS 和 TIMP-2的表达则有明显的上调作用。结论：CGRP 对内皮细胞的保护调节作用可通过下调 ICAM-1和上调 NOS 和 TIMP-2的表达来实现,提示 CGRP 在动脉粥样硬化防治方面可能发挥重要作用。     

一种显示肾组织结构的新染色法——酸性复红银染法

对肾小球和其他肾脏疾病的诊断,主要依赖于对活检标本的光镜、电镜观察,或利用免疫细胞化学技术进行诊断,但电镜及免疫组化方法并非在所有病理实验室都可施行,大部分诊断仍需依赖常规福尔马林固定、石蜡包埋组织进行普通染色和一系列特殊染色.如过碘酸雪夫氏反应,Masson染色法、地衣红弹性蛋白染色和银染法等.许多肾小球的异常取决于光镜的鉴别,因此,肾组织各种结构的清晰显示与分辨至关重要,我们将常规染色与一些特殊染色相结合,建立一种显示肾组织各种结构的染色方法.     

用原位杂交检测PHM/VIP mRNA在人胃肠道的分布

Vasoactive intestinal polypeptide(VIP)和peptide histidine methionine(PHM)在人胃肠道的基因表达用PHM/VIP mRNA原位杂交法、Northern印迹法以及用抗PHM和VIP生物活性肽特异性抗血清的免疫细胞化学方法进行研究。在乙状结肠免疫细胞化学染色包括5种前原-VIP衍生肽。 取人胃窦、十二指肠、末端回肠、升结肠、横结肠、乙状结肠、直肠,标本来自外科手术病人,病例分别为胃溃疡、胃癌、结肠癌、结肠息肉、胰腺癌等。这些病例手术前均未进行过化疗和放疗。所取标本为     

OR-VB显示脂质和弹力纤维的组合染色法及其应用

在实验动物脂质代谢模型的建立中 ,分别对组织的脂质代谢和纤维进行染色与组合对照染色。本实验选用改进的ＯｉｌｒｅｄＯ乙醇饱和液 ,能较好的显示脂质成分 ,Ｖｉｃｔｏｒｉａｂｌｕｅ改造染色液 ,能显示冰冻切片组织中的弹力纤维。经过二种试剂组合染色后 ,能够同时显示血管组织内的脂质和管壁弹力纤维成分 ,色彩鲜艳 ,是较为理想的组合染色方法。1　材料和方法1 1　材料选用　材料来源于本学校实验动物中心的兔脂质代谢模型组织 ,经过 1 5 %中性甲醛固定液 ,能够使组织得到充分的固定[1] ,再进行冰冻切片和染色。1 2　试剂配制　 (1 )…     

SARS-CoV功能性受体血管紧张素转换酶2在灵长类动物肾脏上皮细胞的表达(英文)

目的:研究血管紧张素转换酶2(ACE2)在灵长类动物肾脏上皮细胞上的表达。方法:体外培养非洲绿猴肾细胞VeroE6,利用RT-PCR及免疫细胞化学的方法检测细胞ACE2的表达;利用免疫组织化学方法检测2例恒河猴和2例正常人肾组织ACE2的表达分布。结果:RT-PCR显示,从VeroE6细胞提取的总RNA经逆转录可检测出ACE2的扩增条带;免疫细胞化学方法检测到VeroE6细胞胞浆内反应明显阳性;ACE2主要分布在恒河猴和人肾组织近端肾小管上皮细胞的管腔膜和胞浆。结论:ACE2在灵长类动物肾脏上皮细胞的核酸水平和蛋白水平均有表达,主要位于细胞的管腔膜和胞浆;肾脏上皮细胞表达的ACE2为SARS-CoV的入侵提供了条件,有可能是SARS患者并发肾功能损伤的原因之一。     

sH-2Kd肽复合物的构建及多克隆抗体的制备

目的 构建可溶性的H-2Kd肽复合物,并制备抗MHC-I(H-2Kd)分子多克隆抗体.方法 原核高效表达的sH-2Kd-BSP和β2m蛋白,在抗原肽(乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc131-139)的存在下,体外复性折叠成可溶性的H-2Kd-β2m-抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体.应用纯化的该复合物单体免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体.结果 ①Western blot检测显示获得了生物素化的sH-2Kd-HBe复合物单体.②Western blot检测显示抗MHC-I(H2Kd)分子多克隆抗体与复合物单体有很好的抗原抗体反应;Balb/C小鼠脾脏冰冻切片的免疫组化结果:在细胞膜表面见棕色着色.③Dot-ELISA检测该多克隆抗体的滴度可以达到1:3 200.结论 成功构建了具有完整构象的生物素化sH-2Kd-HBc复合物单体,制备了抗MHC-I(H-2Kd)分子多克隆抗体.     

HPVL1保守序列肽段诱导多型别HPV抗体的初步研究

为探索一段人类乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白中长12个氨基酸残基的保守序列是否能诱导产生多型别HPV抗体,我们通过B细胞表位预测和多序列对比,筛选出一条HPV L1蛋白保守肽段,并人工合成此肽段,加弗氏佐剂后免疫家兔,对照组只用弗氏佐剂。先用ELISA的方法检测免疫家兔血清中抗体滴度;再用免疫细胞化学、免疫细胞荧光、Western blot和免疫组织化学的方法检测此抗血清与HPV阳性的宫颈癌细胞株和宫颈组织的反应情况。结果发现,用ELISA法检测抗血清效价在1∶25600以上,而免疫细胞化学、细胞免疫荧光、Western blot和免疫组织化学等方法均检测出抗血清能与多型别HPV进行反应,而对照组呈阴性。此结果表明,该多肽可诱导产生针对多型别HPV的抗体,对于研发制备HPV、HPV L1诊断试剂盒有重要意义。     

带标签的高迁移率蛋白N2(HMGN2)重组质粒用于亚细胞定位分析

为进行HMGN2的亚细胞定位分析,提取人LAK细胞总RNA,设计合成相应引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HMGN2cDNA,以pcDNA3.1-myc-his和pEGFP-N1为载体,成功构建出HMGN2真核表达载体,转染HeLa细胞,转染效率达70%~80%,用抗六组氨酸臂的单克隆抗体经免疫细胞化学染色显示经pcDNA3.1-myc-his-HMGN2转染的HeLa细胞除细胞核外,胞浆亦明显着色,未转染的Hela细胞无论细胞核还是细胞浆均显阴性;用兔抗人HMGN2多克隆抗体进行的免疫细胞化学染色显示转染的HeLa细胞与用抗六组氨酸臂的单克隆抗体检测结果相同,而未转染的Hela细胞核内和胞浆也均有着色。用两种抗体行ELISA分析在细胞培养上清亦检测到HMGN2。激光共聚焦显微镜下观察pEGFP-N1-HMGN2转染的HeLa细胞发现绿色荧光主要在核内,但核外也同样存在。本实验结果证明HMGN2不仅存在于细胞核中,而且分布于细胞浆,亦可分泌到细胞外。