Foxo3a和p27kip1在大鼠坐骨神经损伤后背根神经节中的表达

目的 探讨坐骨神经夹伤后Foxo3a和p27kip1在腰段背根神经节(DRG)中表达变化及其意义.方法 将成年SD大鼠随机分为正常对照组和实验组.对实验组实行坐骨神经夹伤术.运用蛋白质印迹、免疫荧光双标,研究大鼠坐骨神经夹伤后,腰段DRG中Foxo3a和p27kip1的表达、分布以及细胞增殖和轴突再生情况.结果 Foxo3a在坐骨神经夹伤后1 d表达值(7.0±3.5)开始明显下降,2 d表达值(6.0±3.8)达到最低值,随之逐渐升高,p27kip1在坐骨神经夹伤后2 d表达值(29.0±3.5)表达开始明显下降,7 d表达值(21.0±3.0)达到最低值,随之逐渐升高;Foxo3a和p27kip1分布于神经元和神经胶质细胞内且在坐骨神经夹伤后2d DRG中,Foxo3a和p27kip1在神经元细胞[(37.8±5.7)%、(43.3±4.3)%]和神经胶质细胞[(22.4±3.9)%、(13.8±3.2)%]中表达较在正常组神经元细胞[(73.6±2.5)%、(84.1±3.7)%]和神经胶质细胞[(61.3±4.4)%、(68.7±5.6)%]减少;细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和神经元生长相关蛋白(GAP-43)在坐骨神经夹伤后2 d DRG中表达值[12±2.6,15±1.9]均开始上调,PCNA在7 d表达值(25.0±3.2)达到最高点,GAP-43则保持较高水平;此外,PCNA与神经胶质细胞共定位明显,与神经元细胞几乎无共定位.结论 大鼠坐骨神经损伤后,Foxo3a和p27kip1在腰段DRG中的表达减少与神经胶质细胞增殖和轴突再生密切相关.     

坐骨神经预损伤后miR-124-3p调节GAP-43表达并促进轴突生长的实验研究

 目的 通过研究坐骨神经预损伤后背根神经节中microRNA表达谱变化,探讨坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复机制。方法 利用微阵列芯片技术和生物信息学方法,研究与坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复有关的microRNA,并用RT-qPCR技术、Western blot技术、免疫荧光染色、反义miRNA寡核苷酸抑制剂等技术验证。结果 单纯脊髓后索损伤组miR-124-3p在大鼠脊髓后索损伤后7 d、14 d明显上调;坐骨神经预损伤组,脊髓后索损伤后7 d、14 d背根神经节中miR-124-3p明显下调。与正常背根神经节神经元相比,抑制miR-124-3p后GAP-43表达增加,神经元轴突延长。与对照组相比,各组各时间窗STAT3 mRNA表达差异无统计学意义,坐骨神经预损伤组STAT3蛋白在脊髓后索损伤后7 d和14 d表达上调而单纯脊髓后索损伤组脊髓后索损伤后7 d和14 d STAT3蛋白表达下调。与正常背根神经节神经元相比抑制miR-124-3p的神经元STAT3免疫荧光增强、轴突延长,p-STAT3、GAP-43蛋白表达明显上调。与正常背根神经节神经元相比AG490+AMO-124共同处理的神经元轴突长度无明显差异,STAT3表达明显上调,而p- STAT3和GAP-43表达无明显差异。结论 背根神经节神经元中miR-124-3p下调通过STAT3蛋白的上调促使GAP-43蛋白表达增加是坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的机制之一。     

TDZD-8对新生大鼠背根节神经元轴突再生影响的体外实验研究

目的:探讨葡萄糖原合成酶-3β(glycogen synthase kinase 3B,GSK-3β)的抑制剂TDZD-8对新生大鼠背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元轴突生长和延长的影响.方法:取新生(<5d)SD大鼠胸腰段背根节进行原代培养、提纯和鉴定.用WD法制成健康成年雌性SD大鼠T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型.造模7d后取T8～T10节段脊髓制作脊髓提取液.将不同浓度TDZD-8与成年大鼠脊髓提取液和新生大鼠DRG神经元分组培养:A组,DRG神经元+磷酸缓冲液(phosphate-bufered saline,PBS);B组,DRG神经元+正常脊髓提取液;C组,DRG神经元+假手术脊髓提取液:D组,DRG神经元+全瘫脊髓提取液;E组,DRG神经元+全瘫脊髓提取液+不同浓度TDZD-8.培养2d后观察并比较各组新生大鼠DRG神经元轴突平均长度和微管(Tubulin 8Ⅲ)荧光表达强度.结果:A组、B组和C组之间平均神经轴突长度及轴突远端Tubulin βⅢ表达强度比较,无统计学意义,D组明显减小,与A、B和C组分别比较,有统计学意义(P<0.01).0.5～3μM TDZD-8处理组平均轴突长度及Tubulin βⅢ荧光表达强度均明显高于A、B、C组,与D组比较,更为显著,差异均具有统计学意义(P<0.01).5～25μM TDZD-8处理组平均轴突长度与A、B、C组分别比较,明显缩短且有统计学意义(P<0.01),与D组比较无统计学差异(P>0.05);轴突远端Tuburn βⅢ表达比A、B、C、D组及0.5～3μM TDZD-8处理组明显增强,有统计学意义(P<0.01).结论:完全瘫痪脊髓提取液明显抑制DRG神经元轴突生长,轴突回缩.低浓度TDZD-8能促进轴突生长.形成多个轴突或轴突分支,而高浓度TDZD-8明显抑制轴突生长,导致轴突回缩.     

雪旺细胞源性神经细胞黏附分子L1对脊髓轴突再生作用的研究

目的 研究神经细胞黏附分子L1抗体封闭后的雪旺细胞对脊髓损伤后轴突再生的影响。方法 将纯度高于98%的新生SD大鼠坐骨神经源性雪旺细胞，经神经细胞黏附分子L1抗体封闭后的雪旺细胞及生理盐水分别移植于成年SD大鼠T10节段左侧胸髓半横切损伤处（各组大鼠均为24只），8周后采用辣根过氧化物酶（HRP）逆行示踪，NF免疫组化染色及Western blot蛋白定量等方法，观察损伤脊髓的神经轴突再生情况。结果 L1抗体封闭组与应用未封闭雪旺细胞组相比，HRP阳性神经元数目明显减少，再生神经轴突量减少，Western blot显示前者NF量仅为后者的2/3左右。结论 雪旺细胞源性神经细胞黏附分子L1对损伤脊髓的轴突再生具有促进作用。     

大鼠坐骨神经损伤修复后近端轴突再生的初步研究

目的 采用生长相关蛋白-43(GAP-43)对SD大鼠坐骨神经近端新生轴突进行标记,观察坐骨神经损伤修复后近端轴突再生过程.方法 64只SPF级SD大鼠于右侧坐骨神经分叉以上5mm处切断坐骨神经,分别采用原位缝合以及生物可溶性甲壳质套管小间隙(2 mm)缝合方法进行修复,分别于术后1、3、7及14 d取材.观察神经缝合处组织大体形态;套管内坐骨神经生长状态;近端新生轴突形态,并应用图像分析方法对新生轴突数目进行定量分析.结果 套管小间隙缝合组大鼠神经缝合处粘连情况较轻.免疫荧光染色显示:术后14 d,新生纤维神经干形成圆锥形向前生长.形态规则均一.原位缝合组大鼠缝合处粘连较重,新生轴突于7 d左右长过缝合点,坐骨神经远端新生轴突散在分布,形态不规则.免疫荧光染色图像分析结果显示:大鼠坐骨神经损伤修复后,术后3 d原位缝合组新生轴突数目较套管缝合组多.差异有统计学意义(P<0.01);术后7 d套管小间隙缝合组大鼠坐骨神经开始大量再生;术后14 d左右,套管小间隙缝合组新生轴突数目显著高于原位缝合组(P<0.05).结论 甲壳质套管具有良好的生物相容性,套管内新生轴突前沿以圆锥形向前生长,新生轴突形态较原位缝合组好,套管小间隙修复7 d后新生轴突数目开始较原位缝合组多.本实验主要观察了两种术式修复后大鼠坐骨神经新生轴突的生长规律,也从组织学角度解释了生物套管小间隙套接方法的再生效果比原位缝合效果好的可能原因所在.     

Y27632对脊髓损伤微环境下新生大鼠背根节神经元轴突再生的影响

目的:探讨Rho蛋白激酶Ⅱ(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase Ⅱ,ROCK Ⅱ)特异性抑制剂Y-27632对脊髓损伤微环境下新生大鼠背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元轴突冉生和延长的影响.方法:取新生(<5d)SD大鼠胸腰段DRG神经元进行原代培养、提纯和鉴定.将健康雌性SD成年大鼠15只随机分为脊髓损伤组、假手术组和正常组,每组5只;用WD法制成T9平面脊髓损伤动物模型,造模7d后取T8～T10节段脊髓制作脊髓提取液.将新生大鼠DRG神经元分为5组进行培养:A组,DRG神经元+PBS;B组,DRG神经元+正常组脊髓提取液;C组,DRG神经元+假手术组脊髓提取液;D组,DRG神经元+损伤脊髓提取液;E组,DRG神经元+损伤脊髓提取液+不同浓度(5、10、20、30、40、50μmol/L)Y27632.培养2d后观察并比较各组新生大鼠DRG神经元轴突平均长度和微管(Tubulin βⅢ)荧光表达强度.结果:A、B和C组平均神经轴突长度及轴突远端tubulin βⅢ表达强度比较无统计学差异(P>0.05);D组明显减小,与A、B和C组分别比较有统计学差异(P<0.05).5、10μmol/L Y27632治疗组平均轴突长度以及轴突远端和生长锥tubulin μⅢ表达强度比D组有所增加(P<0.05),10μmol/L Y27632治疗组增加更明显,但小于A、B和C组(P<0.05).20～50μmol/L Y27632治疗组平均轴突长度以及轴突远端和生长锥tubulin βⅢ表达强度三组间比较无统计学差异(P>0.05);与5～10μmol/L Y27632治疗组、D组比较明显增加(P<0.05);与A、B、C组比较平均轴突长度无统计学差异(P>0.05),平均荧光密度明显增加(P<0.05).结论:损伤脊髓提取液能明显抑制新生大鼠DRG神经元轴突生长,导致轴突回缩.加入5～10μmol/L Y27632能促进轴突生长,20～50μmol/L Y27632更能明显促进轴突生长.     

补气通络方对大鼠坐骨神经轴突再生的影响

目的观察由黄芪、人参、当归、川芎、丹参等中药组成的补气通络方对促进大鼠损伤坐骨神经再生的效应,为临床用药提供依据.方法用48只雄性清洁级Wistar大鼠,行右坐骨神经切断后即刻神经外膜缝合法造模,后将大鼠随机分成4组补气通络胶囊组、补气通络注射液组、维生素B1+B6组和空白对照组,每组12只.于造模术成功及处置后4周、8周和12周,从每组随机抽取4只大鼠取坐骨神经进行轴突计数,以神经轴突再生恢复率作为观测指标进行验证.结果补气通络胶囊组和补气通络注射液组大鼠坐骨神经轴突再生恢复率均优于维生素B1+B6组及空白对照组(P<0.05或P<0.01).结论补气通络方有助于周围神经损伤后神经轴突的再生.     

腺病毒载体介导的CTLA4Ig基因追踪臂丛神经通路的研究

目的 利用腺病毒载体(Ad)介导的CTLA4Ig基因示踪大鼠臂丛神经轴突及其运动和感觉神经元,探讨转基因产物CTLA4Ig蛋白作为神经通路示踪剂的可行性及其特点.方法 经正中神经或尺神经或肌皮神经近断端导入携带CTLA4Ig或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的Ad(各2×107pfu).在转染后3周内6个不同时间点取标本,行CTLA41g免疫荧光染色,观察标记的运动及感觉神经元所在脊髓和脊髓后根神经节(DRGs)节段、神经根及轴突被标记范围及时间,并与EGFP基因的示踪结果比较.结果 由正中神经、尺神经和肌皮神经所标记的神经元分别在C6～Th1、c7～Th1及C5～C7节段;其相应的神经根及神经干近段轴突亦被标记.CTLA4Ig标记的神经元在转染3周后消失,所标记神经干轴突在转染5周后消失;而EGFP所标记的神经元和神经干分别2周、3周后消失.结论 CTLA4Ig基因能在Ad介导下经外周逆行性、特异性示踪臂丛神经及其靶运动和感觉神经元.     

控释神经生长因子的阵列微管促进神经再生

[目的]制备可控释神经生长因子(nerve growth factor, NGF)的阵列微管神经修复支架,并评价其促神经再生效能。[方法]采用梯度冷凝技术制备复合NGF的阵列微管神经修复支架,检测其机械特性和NGF释放规律。将新生SD大鼠的背根神经节(dorsal root ganglions, DRG)随机分为4组:无序支架组、复合NGF的无序支架组、阵列微管支架组和复合NGF的阵列微管支架组。将DRG植入各组支架中体外培养72 h,观察轴突生长情况。[结果]在机械强度方面,各组在横向压缩过程中的峰值载荷差异无统计学意义(P0.05)。纵向牵拉测试中,神经支架组与自体神经组的应力-应变曲线类似。在NGF释放规律方面,阵列微管组和无序组的释放曲线类似,且不同时间点NGF浓度差异无统计意义(P0.05)。在轴突生长方面,复合NGF的阵列微管支架组轴突长度为(1 025.41±175.33)μm,显著高于阵列微管支架组(857.58±233.14)μm、复合NGF无序支架组(341.73±52.27)μm、无序支架组(225.36±61.62)μm。[结论]复合NGF的阵列微管神经修复支架同时具有营养活性及引导结构,且具有良好的机械性能,在体外环境下可以引导大鼠DRG轴突定向延伸,在周围神经再生领域具有重要前景。     

感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达

临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时 ,神经感觉功能恢复较运动功能好 ,这可能与移植神经取自感觉神经有关 ,这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与[1] ,而神经损伤后最初雪旺细胞是远段神经的唯一成分 ,而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子 (ＮＧＦ)在内的多种神经营养因子[2 ] ,因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象 ,以ＮＧＦ为指标 ,研究两种雪旺细胞与神经元共培养后ＮＧＦｍＲＮＡ的表达是否有差异 ,探讨这种差异对神经特异性再生的作用。一、材料和方法1.雪旺细胞和神经元的体外培养 :感觉性和运…