人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

目的 探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7(BMP7)诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能.方法 成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法,分实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养.CCK-8法检测细胞增殖活性,第5、10、15和20天分别采用Real Time-PCR检测骨钙素基因表达,ELISA法检测上清液碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的水平,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖(GAG),Real Time-PCR检测Ⅱ型胶原基因,比色法检测细胞ALP活性,ALP染色法检测ALP,Yon Kossa染色法检测钙结节.结果 两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨,表达出明显的成骨特异基因,并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能;成骨化过程中,除直接分化成骨外,还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象;经骨膜细胞-BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用.     

新型钽铌多孔支架材料的细胞生物相容性研究

[目的]研究多孔钽铌(Ta-Nb)材料的细胞相容性。[方法]将兔成骨细胞与多孔钽铌材料共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖、扫描电镜观察细胞在材料上的黏附、RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙素基因的表达。[结果]CCK-8检测显示实验组多孔钽铌材料上细胞的增殖与空白对照组没有差异性(P﹥0.05);扫描电镜观察到细胞在多孔钽铌的表面和孔隙内大量黏附、增殖和生长,随着共培养时间的增加,材料表面的细胞数量明显增多;RT-PCR显示随着共培养时间的增加,Ⅰ型胶原基因的表达增强(P﹤0.05),骨钙素的表达无明显差异(P﹥0.05)。[结论]多孔钽铌支架材料适于成骨细胞的黏附、生长和分化,具有良好的细胞相容性。     

低氧通过HIF-1α调控髓核细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达

目的观察低氧环境及低氧诱导因子1α(HIF-1α)对髓核细胞中解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-4和ADAMTS-5启动子活性的影响,探讨可能影响椎间盘退变的分子机制。方法将体外培养的大鼠髓核细胞分别置于常氧和低氧(1%O2)培养箱培养,采用蛋白质印迹分析及PCR方法检测细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达。对获取的ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子片段测序,并使用JASPAR数据库分析其中是否存在HIF-1α的结合位点。将HIF-1α过表达质粒、PGL3-ADAMTS-4质粒和PGL3-ADAMTS-5质粒转染至大鼠髓核细胞中,用双荧光素酶报告基因检测系统检测髓核细胞中HIF-1α对ADAMTS-4和ADAMTS-5基因启动子的调控作用。结果蛋白质印迹分析和PCR结果显示,低氧分别在蛋白质水平和m RNA水平抑制髓核细胞中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达。使用JASPAR软件分析后,发现ADAMTS-4启动子中可能包含1个HIF-1α的结合位点,而ADAMTS-5启动子中可能包含2个HIF-1α的结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示,HIF-1α的过表达能够显著抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子活性。结论低氧可能通过HIF-1α抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达,保持椎间盘内环境的稳态,延缓椎间盘退变的发生。     

低氧与低氧模拟剂对BMSCs成骨分化影响的对比研究

目的对比低氧培养与常氧条件下低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠BMSCs成骨分化的影响。方法原代分离培养健康3~4周龄昆明小鼠BMSCs,采用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测,行成骨、成脂、成软骨诱导分化染色鉴定。取第3代BMSCs分为对照组(A组,常氧条件下培养)、低氧培养组(B组,1%O2低氧条件下培养)及DMOG干预组(C组,常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养)。分别于培养1、2、3、4 d采用MTT法检测BMSCs增殖情况,7、14 d检测ALP含量,24 h后采用Western blot法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)蛋白表达,3、7 d采用实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix基因表达,21 d行茜素红染色观察。结果 BMSCs流式细胞术表面标志鉴定示CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD34(-);成骨、成脂、成软骨诱导分化后茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性。MTT法检测示,培养1 d,3组细胞增殖比较差异无统计学意义(P0.05);2、3、4 d,与A组比较,C组均抑制细胞增殖,但差异无统计学意义(P0.05);而B组则促进细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。培养各时间点,B、C组ALP含量、HIF-1α蛋白相对表达量及RUNX2、Osterix基因相对表达量均显著高于A组,ALP含量及RUNX2、Osterix基因相对表达量C组高于B组,而HIF-1α蛋白相对表达量B组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。培养21 d茜素红染色示,A组可见少许结节状红染物质,B组可见中等量红染物质,而C组可见大量红染物质。结论低氧能明显促进BMSCs增殖,DMOG对BMSCs增殖无明显影响;低氧与DMOG均能促进BMSCs成骨分化,且DMOG促BMSCs成骨分化能力更强。     

低氧环境对椎间盘自发性吸收的影响及其作用机制

目的探讨低氧环境对椎间盘自发性吸收的影响及其作用机制。方法取SPF级成年日本大耳兔9只,雌雄不限,平均体质量2 kg。将兔处死后取脊柱髓核组织,经消化、分离、培养后获得传代髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液。根据不同时效的低氧环境将细胞分为5组对照组(常氧浓度下培养6 h)、低氧6 h组(2%O2浓度下培养6 h)、低氧12 h组(2%O2浓度下培养12 h)、低氧24 h组(2%O2浓度下培养24 h)和低氧48 h组(2%O2浓度下培养48 h)。采用实时聚合酶链反应法检测缺氧诱导因子(HIF)-1α、3型酸敏感离子通道(ASIC3)及水通道蛋白3(AQP3)mRNA表达水平,采用流式细胞仪检测各组髓核细胞凋亡情况。采用SPSS 24.0软件对数据进行分析。结果与对照组比较,低氧各组细胞凋亡率均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);与低氧12、24和48 h组比较,低氧6 h组细胞凋亡率最高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。与对照组比较,低氧各组细胞HIF-1α和ASIC3 mRNA表达水平均明显上升,AQP3 mRNA表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01);与低氧12、24和48 h组比较,低氧6 h组HIF-1α和ASIC3 mRNA表达水平最高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论短时间低氧环境可以促进髓核细胞凋亡,从而加速椎间盘突出组织自发性吸收进程,其机制可能与HIF-1α和ASIC3的表达增加及AQP3的表达下降有关。     

人骨膜细胞生物学特性的实验研究

目的 探讨人骨膜细胞体外培养的生物学特性. 方法 以胫骨骨膜组织为材料,采用组织块法分离细胞,完全培养基培养,通过倒置显微镜观察细胞形态学,锥虫蓝染色计数法检侧细胞增殖能力;流式细胞学分析细胞表面抗原.随机分为3组,成骨实验组和成软骨实验组分别加入不同的定向培养剂,对照组加入完全培养基,采用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测各组细胞的成骨和成软骨分化指标. 结果 骨膜细胞在体外培养条件下呈贴壁生长,细胞生长曲线证实骨膜细胞传至第9代仍保持良好的增殖能力,流式细胞仪检测证实细胞表面抗原CD90及CD105呈阳性;组织化学染色检测证实成骨实验组分化后细胞碱性磷酸酶及钙结节呈阳性,成软骨实验组分化后细胞蛋白聚糖及Ⅱ型胶原呈阳性,对照组各项指标均生阴性.结论 骨膜细胞体外培养细胞增殖能力强,具有间充质干细胞的特性和良好的成骨和成软骨分化潜能,其定向诱导分化的成骨细胞和软骨细胞均具有各自明显的细胞功能表达.     

新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究

[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性。[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况。[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部。细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5)ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6)ng/ml,P<0.05,3周组的II型胶原含量(24.3±1.8)ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5)ng/ml,P<0.05。[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核。     

脊索细胞促进骨髓间充质干细胞增殖及定向诱导分化的研究

目的 分离兔髓核脊索细胞及骨髓间充质干细胞(MSCs),通过共培养观察脊索细胞对MSCs增殖能力及细胞表型的影响.方法 4～6周龄新西兰兔4只,取胸腰段脊柱的髓核,用密度梯度离心法提取脊索细胞,同时取其股骨骨髓用Ficoll液分离得到MSCs,光镜观察脊索细胞和MSCs不同比例(1:2、1:1、2:1)共培养条件下细胞的生长,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖.脊索细胞和MSCs共培养(1:1)后行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色检测MSCs细胞表型的改变.对共培养后的MSCs进行相关基因表达的检测.结果 光镜下观察原代脊索细胞呈圆形或椭圆形,胞体大,细胞增殖不明显.MSCs呈梭形贴壁生长,旋涡状排列.CCK-8检测发现脊索细胞/MSCs1:1组细胞增殖明显高于其余各组.甲苯胺篮染色MSCs单独培养组呈阴性,共培养组呈阳性.Ⅱ型胶原染色MSCs单独培养组呈阴性,共培养组呈阳性.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测发现共培养组蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达分别为脊索细胞的2.00、1.35倍,而单独培养的MSCs则表达阴性.结论 在共培养条件下脊索细胞可以促进MSCs增殖,且细胞比例为1:1时更为显著;同时可以诱导其产生Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖,表现出类软骨细胞表型.     

人退变髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究

[目的]探讨人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)向类髓核细胞(nucleus pulposuslike cells,NPCs)诱导分化的可能性,为椎间盘退变的防治研究提供种子细胞。[方法]收集腰椎间盘退变患者手术中切除的脂肪组织及髓核组织,采用胶原酶消化法提取原代ADSCs和NPCs,倒置显微镜下观察共培养后ADSCs形态学变化。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,采用孔径为0.4μm的Transwell小室建立细胞共培养体系,NPCs置于上层,ADSCs接种于下层,建立2个细胞培养组:ADSCs单独培养组和ADSCs/NPCs共培养组,甲苯胺蓝染色以检测蛋白聚糖表达情况,RT-PCR法检测细胞COL2A1、ACAN和SOX9基因表达水平。[结果]采用胶原酶消化法可较好的分离培养出人脂肪间充质干细胞和髓核细胞。与NPCs共培养后的ADSCs可被甲苯胺蓝染为天蓝色,且Ⅱ型胶原及SOX9基因表达水平上调(P0.05)。[结论]采用胶原酶消化法分离培养的ADSCs活力较好、增殖旺盛,与退变NPCs共培养后,软骨特异性标记物的表达明显增加,细胞表现出向NPCs分化的趋势,可作为椎间盘组织工程研究的种子细胞。     

缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α与自噬相关分子的表达及相关性分析

目的探讨缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达及其相关性。方法取健康成年SD大鼠髓核组织,分离培养髓核细胞并传代。取第3代髓核细胞行HE染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定后,随机分为4组。A组细胞于常氧条件下(37℃、5%CO2、20%O2)培养,B组细胞于缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2)培养,C组细胞转染HIF-1α-小干扰RNA后于缺氧条件下培养,D组细胞加入自噬抑制剂3-MA后于缺氧条件下培养。各组细胞培养8 h后,采用Western blot和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达情况。结果经分离纯化的第3代大鼠髓核细胞HE染色后细胞质呈淡粉色,细胞核呈蓝黑色;Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性。Western blot和qRT-PCR检测示,B组HIF-1α、Beclin1和LC3B蛋白及mRNA相对表达量均显著高于A组(P<0.05),C组均显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。D组HIF-1α蛋白和mRNA相对表达量与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),Beclin1和LC3B蛋白和mRNA相对表达量均较B组显著降低(P<0.05)。结论缺氧条件能诱导大鼠髓核细胞中HIF-1α和自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达,且HIF-1α与自噬相关分子的表达具有相关性,即HIF-1α下调能降低自噬相关分子的表达,而缺氧条件下自噬水平下调对HIF-1α的表达无明显影响。     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

DNT细胞对肿瘤细胞作用的研究进展

DNT细胞(CD4-CD8-double-negative T cells)是新发现的一种免疫细胞,其特点是细胞表而既不表达CD4分子同时也不表达CD8分子.近年来,通过免疫疗法可以使肿瘤患者的愈后及生存质量得到很大的改善和提高.免疫细胞可以通过免疫调节或直接杀伤的途径作用于肿瘤细胞,因此研究DNT细胞对肿瘤细胞的作用将有重要意义.     

干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展

睾丸间质细胞是男性体内产生雄激素的主要细胞。干细胞可被诱导分化为具有雄激素分泌功能的睾丸间质样细胞,从而使其功能受到下丘脑与垂体调控,精确分泌维持生理功能需要的激素。故建立一套可靠高效的将干细胞诱导为雄激素分泌细胞的方法,对于治疗由于睾丸间质细胞异常引起的性腺功能低下意义重大。本文对近年来关于干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展予以综述。     

T cells and B cells in lupus nephritis

T and B lymphocytes play diverse roles at multiple stages in the development and progression of lupus nephritis. Disruption of T- and B-cell regulatory functions by environmental and genetic influences permits pathogenic effectors to emerge in disease. New insights into the biology of these multifunctional cells offer novel targets for intervention in lupus nephritis and systemic autoimmunity.     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

Stem cells and progenitor cells in renal disease

Stem cells and progenitor cells are necessary for repair and regeneration of injured renal tissue. Infiltrating or resident stem cells can contribute to the replacement of lost or damaged tissue. However, the regulation of circulating progenitor cells is not well understood. We have analyzed the effects of erythropoietin on circulating progenitor cells and found that low levels of erythropoietin induce mobilization and differentiation of endothelial progenitor cells. In an animal model of 5/6 nephrectomy we could demonstrate that erythropoietin ameliorates tissue injury. Full regeneration of renal tissue demands the existence of stem cells and an adequate local "milieu," a so-called stem cell niche. We have previously described a stem cell niche in the kidneys of the dogfish, Squalus acanthus. Further analysis revealed that in the regenerating zone of the shark kidney, stem cells exist that can be induced by loss of renal tissue to form new glomeruli. Such animal models improve our understanding of stem cell behavior in the kidney and may eventually contribute to novel therapies.