新发现的伤寒杆菌ⅣB型菌毛致病性研究

目的 :研究伤寒杆菌菌株ⅣB型菌毛的致病特性。方法 :本研究将表达ⅣB型菌毛的的伤寒杆菌J341及另一插有强启动子Tac并表达ⅣB型菌毛的重组伤寒杆菌菌株TyphiA2 1 6和不表达ⅣB型菌毛的伤寒杆菌菌株TyphipilS∶∶kmr 分别攻击人的THP 1细胞和小鼠腹腔巨噬细胞 (MΦ) ,利用细胞毒检测试剂盒检测细胞受到伤寒杆菌攻击后 ,伤寒杆菌对细胞的毒性作用 ;同时进一步采用实时荧光定量PCR法检测伤寒杆菌毒力岛上的ⅣB菌毛对人单核细胞的侵袭作用 ,分析表达ⅣB菌毛的伤寒杆菌菌株J341及TyphiA2 1 6和不表达ⅣB型菌毛的伤寒杆菌菌株TyphipilS∶∶kmr 分别对THP 1细胞的侵袭作用 ,通过对细胞内侵入的伤寒杆菌的ⅣB菌毛基因 (pilS)和伤寒杆菌O抗原的聚合酶基因 (rfc)DNA的含量的检测 ,来比较进入胞内细菌含量的差别。结果 :比较发现J341及TyphiA2 1 6比TyphipilS∶∶kmr 对人的细胞有更强的毒性以及侵袭性 ,而对鼠的细胞毒性和侵袭性没有明显差异。结论 :说明伤寒杆菌ⅣB型菌毛与细菌侵入人体细胞的毒性和侵袭性密切相关 ;并且伤寒杆菌ⅣB型菌毛的侵袭性和细胞毒性具有种属特异性 ,即对人的单核细胞等细胞有致病性 ,而对鼠的巨噬细胞无致病性。     

野生型KLF6对前列腺癌LNCaP细胞的作用

目的:探讨野生型抑癌基因KLF6对前列腺癌LNCaP细胞的生长增殖、细胞周期和侵袭转移能力的影响及其可能的作用机制.方法:利用RT-PCR法克隆目的基因KLF6,并将含KLF6的pEGFP-C1质粒转染入LNCaP细胞.分为转染组和对照组分别进行MTT法观察LNCaP细胞的生长抑制率,流式细胞仪观察细胞周期比例变化和凋亡率,细胞爬片划痕法观察LNCaP细胞的侵袭转移能力变化.结果:转染了野生型抑癌基因KLF6的前列腺癌LNCaP细胞生长抑制率为(31.9±4.7)%,对照组为0%,差异有统计学意义(P＜0.01),细胞周期比例表现为G2/M期减少,G0/G1期比例增加为(75.0±8.8)%,对照组为(55.9±7.1)%,差异有统计学意义(P＜0.05),细胞凋亡峰为(29.3±3.7)% ,对照组为(8.6±0.9)%,差异有统计学意义(P＜0.01);每毫米划痕区内迁移入的细胞数为102.8±15.4,对照组为(192.7±25.2),差异有统计学意义(P＜0.05).结论:野生型抑癌基因KLF6的转染可以明显抑制前列腺癌LNCaP细胞的生长增殖,并诱导其调亡,使其侵袭转移能力下降,其机制可能与野生型抑癌基因KLF6部分地逆转LNCaP细胞的恶性表型有关.     

Bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体形态学变化

目的研究野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体显微和超微结构变化。方法用扫描电镜和光镜对诱导排卵后野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体结构上的变化进行观察。结果 （1）光镜显示,野生型小鼠中,卵丘细胞紧密围绕在卵母细胞周围;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞松散地分布在卵母细胞周围。（2）电镜显示,野生型小鼠可见大量的纤维网格状结构,卵丘细胞亦可见;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞之间未见有网状结构,卵丘细胞紧密连接少。（3）bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞数明显低于野生型。结论 bikunin基因敲除小鼠卵丘细胞之间、卵丘细胞与卵母细胞之间结构发生变化,卵丘-卵母细胞数明显下降,该现象可能与卵丘-卵母细胞复合体的功能密切相关。     

体外转染PTEN基因对人结肠癌细胞生长的影响

目的 探讨野生型PTEN基因表达对结肠癌细胞体外生长的影响.方法 应用脂质体转导技术,将含野生型PTEN基因重组真核表达质粒pBp-PTEN转染Lovo细胞并稳定表达.Western blotting鉴定后,观察Lovo细胞转染前后生长、细胞周期、凋亡的改变.结果 转染后细胞生长曲线提示转染组曲线平缓,无明显对数生长期,生长速度较对照组明显降低(P《0.01);细胞周期测定显示转染组细胞G1期比例上升,提示PTEN可能对G1/S期转换点起阻滞作用;转染组细胞凋亡比率增高(P《0.01),尤其是早期凋亡.结论 外源性PTEN基因的转染可以抑制结肠癌细胞的体外生长.     

沉默CXCR4基因表达抑制胰腺癌增殖和侵袭的体外研究

目的 利用RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,观察CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖及侵袭能力的变化.方法 在不同分化程度胰腺癌细胞株中筛选出CXCR4高表达胰腺癌细胞株,RNAi技术构建CXCR4shRNA表达载体,转染胰腺癌CXCR4高表达细胞Miapaca-2并应用G418筛选出稳定表达株,Real-time PCR、Western blot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;MTT实验检测CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖,应用Transwell侵袭小室观察CXCR4干扰对胰腺癌细胞侵袭转移力的影响.结果 胰腺癌细胞株Miapaca-2 CXCR4表达异常增高,特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70％以上.特异性CXCR4 shRNA能够抑制细胞生长,细胞达到对数生长期的时间延长(P＜0.05).Transwell实验证明CXCR4基因干扰后细胞侵袭能力减低(P＜0.05),即使SDF-1的刺激也不能够使细胞侵袭能力增加.结论 成功构建了针对胰腺癌细胞CXCR4的siRNA载体;CXCR4基因沉默能抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和成瘤能力.     

粘细菌转录因子FruA结合蛋白敲除分析

目的：构建粘细菌发育特异性转录因子FruA相关蛋白FruB的敲除菌株，初步阐明FruB在粘细菌发育周期中的作用。方法：在fruB基因中央编码区插入四环素抗性基因。导入野生型粘细菌DZF1后通过双交叉同源重组途径阻断基因组内fruB的功能。结果：抗性筛选和PCR检测显示分离出了fruB基因阻断菌株fruB∷TcΩ2,fruB功能缺失延缓子实体的发育及营养细胞向粘孢子分化。结论：fruB与粘细菌发育分化存在相关性。     

体外转染PTEN基因对人结肠癌细胞生长的影响

目的探讨野生型PTEN基因表达对结肠癌细胞体外生长的影响。方法应用脂质体转导技术,将含野生型PTEN基因重组真核表达质粒pBp-PTEN转染Lovo细胞并稳定表达。Western blotting鉴定后,观察Lovo细胞转染前后生长、细胞周期、凋亡的改变。结果转染后细胞生长曲线提示转染组曲线平缓,无明显对数生长期,生长速度较对照组明显降低(P<0.01);细胞周期测定显示转染组细胞G1期比例上升,提示PTEN可能对G1/S期转换点起阻滞作用;转染组细胞凋亡比率增高(P<0.01),尤其是早期凋亡。结论外源性PTEN基因的转染可以抑制结肠癌细胞的体外生长。     

尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白T敲除株的构建及功能评价

目的探索外膜蛋白T(OmpT)基因在尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)CFT073致尿路感染中的作用。方法利用RED重组技术构建UPEC CFT073 ompT基因缺失株(命名为COTD),并建立小鼠急性尿路感染模型,体内外实验比较野生株与敲除株之间在膀胱组织的定植能力。结果 PCR分析及测序鉴定证实ompT基因缺失株构建成功;体外实验结果显示野生株粘附率为(8.3±1.9)%,敲除株粘附率为(6.7±2.2)%,敲除株粘附率明显低于野生株(P<0.05)。体内实验膀胱组织内,野生株定植细菌数为(7±2)×105cfu,敲除株定植细菌数为(17±8)×104cfu,ompT敲除株定植于膀胱组织的能力明显降低(P<0.05)。结论证实OmpT作为毒力因子参与细菌定植膀胱组织,在UPEC致尿路感染的过程中发挥重要作用。     

贵阳市在校学生主要活动场所室内环境细菌密度调查

目的: 了解在校学生主要活动场所室内环境细菌密度情况.方法: 用自然沉降法监测室内空气细菌密度,涂抹法监测室内物体表面细菌密度. 结果: 网络中心空气细菌密度最大,平均菌落数为15.2 cfu/皿,教室的平均菌落数最少,为6.1 cfu/皿;室内物体表面细菌密度,以食堂玻璃平均菌落数最多,为4.0 cfu/cm2,墙面次之,为3.5 cfu/cm2;键盘按键平均菌落数最多为28.8 cfu/cm2,鼠标8.2 cfu/cm2;教室桌面细菌密度使用前未超出标准,使用后超出标准.结论: 学生主要活动场所室内环境空气中细菌密度达到我国公共场所卫生标准,而物体表面细菌密度多数超过国家相关标准应引起重视.     

表皮葡萄球菌mscL 基因突变株的构建及其生物学功能

目的初步探讨表皮葡萄球菌mscL 基因的生物学功能。方法构建含有壮观霉素抗性基因（spc）的同源重组质粒
pMAD-ΔmscL,电转入表皮葡萄球菌1457,在42 ℃条件下振荡培养,利用蓝白斑和抗生素抗性筛选表皮葡萄球菌mscL基因敲除
突变株（SE1457-ΔmscL）。通过检测低渗胁迫前后突变株和野生株D600值及CFU的变化观察mscL基因对渗透压的调节作用。
采用微量板半定量方法检测不同条件下mscL 敲除突变对细菌生物膜形成的影响。结果成功构建同源重组质粒pMAD-
ΔmscL,经PCR扩增和测序验证获得了表皮葡萄球菌mscL基因敲除突变株,并通过RT-PCR在转录水平上得到进一步验证。处
于对数生长期的mscL突变株在低渗胁迫下的生存能力显著降低,但其生物膜形成能力与野生株相比无显著差异。结论表皮
葡萄球菌mscL基因可在对数生长期参与渗透压的调节,但对生物膜的形成无影响。
     

非编码小RNA T64对伤寒沙门菌基因表达的影响

目的: 对由转录组测序获得的伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)非编码小RNA(small non-coding RNA,snRNA)T64的表达进行验证,并对其功能进行初步探讨。方法: 选取特异性引物采用反转录PCR(RT-PCR)和普通PCR确认T64在S.Typhi中的表达;将含有T64 snRNA序列的重组质粒导入S.Typhi野生株构建T64高表达株;结合应用S.Typhi全基因组芯片分析技术,比较S.Typhi T64高表达株和空载体对照株在对数期基因表达谱差异,并对部分基因芯片结果进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果：RT-PCR结果显示,snRNA T64在S. Typhi确有表达;基因芯片分析结果显示,与空载体对照株比,snRNA T64高表达株在对数期有20个基因表达上调,7个下调;4个被选基因表达的qRT-PCR结果与芯片分析结果相符。结论： snRNA T64在S. Typhi中表达,可能在基因的表达调节中发挥重要作用。     

减毒鼠伤寒沙门菌作基因递呈载体的体外试验

目的　体外情况下验证鼠伤寒沙门菌作为基因递呈载体 ,将基因转染入真核细胞的能力 .方法　构建增强绿色荧光蛋白 (EGFP)真核表达载体 pc DNA3.1(+) / EGFP,将重组 pc DNA3.1(+) / EGFP质粒和 pc DNA3.1(+)空载体用电穿孔法分别转入减毒鼠伤寒沙门菌 .分别用 2种重组细菌体外情况下感染小鼠腹腔灌洗巨噬细胞 ,培养 4 8h后 ,流式细胞仪检测两组小鼠巨噬细胞荧光强度 ,验证鼠伤寒沙门菌作为基因递呈载体的能力 .结果　成功构建了 pc DNA3.1(+) /EGFP重组鼠伤寒沙门菌 ;感染细胞培养 4 8h后 ,流式细胞仪检测表明 pc DNA3.1(+) / EGFP重组减毒鼠伤寒沙门菌感染的小鼠巨噬细胞荧光细胞百分比为 4 0 .6 % ,荧光强度为0 .92 7,均明显高于对照组 (分别为 3.8% ,0 .345 ,P<0 .0 1) .结论　减毒鼠伤寒沙门菌是一种有效的基因递呈工具 ,可将外源基因转入真核细胞并在其中表达 ,为进一步应用其研制口服 DNA疫苗奠定了基础 .     

携带ePNP基因的减毒伤寒沙门菌的构建及目的基因在胰腺癌细胞中的表达

目的构建含有pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门菌SL3261菌株,检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中的表达。方法 PCR扩增得到PNP基因,构建真核表达载体pEGFP-C1-PNP,并进行酶切、PCR和测序鉴定。利用电转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,进行形态学和表面抗原稳定性检测。含质粒SL3261菌株与BxPc-3细胞体外共培养,利用荧光显微镜观察和RT-PCR检测绿色荧光蛋白的表达和PNP基因的转录。结果目的基因正确连接pEGFP-C1中,并成功转入减毒鼠伤寒沙门菌,感染细胞亦检测到目的基因的表达。结论成功构建了能携带ePNP基因真核表达质粒的SL3261菌株,且该基因能在胰腺癌细胞中正确表达。     

表达幽门螺杆菌过氧化氢酶的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

OBJECTIVE: To construct a non-resistant attenuated Salmonella typhimurium (S.typhimurium) strain capable of expressing Helicobacter pylori (Hp) catalase. METHODS: After PCR amplification, the gene fragment encoding Hp catalase was inserted into the expression vector pYA248 containing asd gene, and the recombinant vector was then introduced into the host S.typhimurium strain X4072 depleted of genes encoding adenylate cyclase (delta cya), cyclic adenosine monophosphate receptor protein (delta crp) and aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase (delta asd). Bridged enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was employed to measure the antigenicity of the catalase expressed in the sonicate and culture supernatant. According to Meacock's method and with the assistance of the growth curve, the stability of the recombinant strain was evaluated. A half lethal oral dose test was conducted to evaluate the safety of recombinant strain. RESULTS: S.typhimurium X4072 (pYA248-CAT) with expected capacity was successfully constructed, and bridged ELISA demonstrated higher catalase levels in the culture supernatant than in the sonicate of the recombinant strain X4072 (pYA248-CAT). After the strain was passaged for 100 generations without selection pressure, all the randomly selected colony of the recombinant strain grew well with positive catalase antigenicity as identified by ELISA. The growth curve of the recombinant strain showed comparable growth status of the 2 strains X4072 (pYA248) and X4072 (pYA248-CAT). The survival rate of C57BL/6 mice was 100% 30 d after oral administration of 1.0x10(10) cfu X4072 (pYA248-CAT). CONCLUSION: Non-resistant S. typhimurium vaccine X4072 (pYA248- CAT) is constructed successfully, which is stable in vitro and safe as confirmed by animal experiment. This vaccine provides a new candidate for viable oral vaccine against Hp infection.     

携带flk-l的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR2,flk-1)的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3 1.-flk-l,通过电转化法将pcDNA3 1.-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,经由胃管饲于C57BL/6J小鼠,对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管密度,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度,延缓胶质瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-l的CTL活性。结论表达鼠flk-l的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫,可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受,诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应,特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞,预防和治疗小鼠胶质瘤。     

Anti-angiogenesis Effect on Glioma of Attenuated Salmonella Typhimurium Vaccine Strain with flk-1 Gene

To investigate the anti-vasculature effects and the anti-glioma effects of attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing VEGFR2 (flk-1) gene, plasmid pcDNA3, 1-flk1 was constructed and electro-transfected into live attenuated Salmonella typhimurium strain SL7207. Mouse models of intracranial G1261 glioblastoma were treated with an orally administered attenuated Salmonella typhimurium expressing flk-1 gene. The survival period was recorded and vessel density was observed by immunofluorescence. CTLs activity was measured by MTT assay. Our results showed that attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing flk-1 gene could significantly inhibit glioblastoma growth, reduce vessel density, prolong the survival period and improve the survival rate in these mice. The flk-1 specific CTLs activity was increased obviously after the vaccination. Our study showed that attenuated Salmonella typhlmurium vaccine strain expressing flk-1 gene could break peripheral immune tolerance a in glioma gainst this self-antigen and kill endothelial cells by the orally administered vaccine and can be used for both prophylactic and therapeutic purposes.     

OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

目的:构建携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(Hp neutrophil-activating protein,Hp-NAP)基因(napA)活减毒鼠伤寒沙门菌重组DNA疫苗,初步观察其对慢性Hp感染的免疫保护作用.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并经同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌构建Hp-NAP口服DNA疫苗.口服Hp-SS1建立SS1长期感染小鼠模型,30周后随机均分为3组,每组各5只.治疗组予109cfu/0.4 ml疫苗菌灌胃,1次/周×3周;2个对照组分别予等体积生理盐水或空白质粒.末次免疫4周后行快速尿素酶检测,ELISA测定血清抗体效价.结果:重组真核表达质粒pIRES-napA成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207;所克隆napA与GenBank中SS1-na-pA核苷酸和蛋白质的同源性均＞98%.免疫后4周治疗组75%(3/4)小鼠快速尿素酶检测阴性,对照组均阳性,差异显著(P＜0.05);治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高.结论:成功构建了具有较好免疫保护作用的Hp-NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗Hp核酸疫苗奠定了基础.     

荷瘤小鼠口服重组减毒鼠伤寒沙门菌后瘤体内富集效果的观察

目的观察重组减毒鼠伤寒沙门菌作为基因载体在人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤中的富集情况和对外源基因的呈递能力。方法以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,以减毒鼠伤寒沙门菌SL7207为转基因载体,分别构建原核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP和真核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pEG-FP-N1。原核菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代,观察GFP基因表达的稳定性;同时,对荷人涎腺腺样囊性癌皮下移植瘤裸鼠模型口服给予原核菌SL7207-pUC-GFP(0.1mL,1×109cfu/mL),在口服后24h、48h、5d、10d、20d、30d处死荷瘤裸鼠,获取肝、脾及肿瘤组织并制成匀浆液进行重组菌培养及GFP表达检测,观察重组菌在瘤体细胞内富集情况。对荷瘤裸鼠模型口服给予真核菌SL7207-pEGFP-N1,5d后取肝、脾及肿瘤组织进行冰冻组织切片,荧光显微镜下观察GFP的表达,了解重组菌携带外源基因在肿瘤细胞内的表达。结果携带GFP原核表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代10次未见表达减少或缺失。荷瘤裸鼠口服原核表达GFP基因重组菌SL7207-pUC-GFP菌液实验表明,重组菌SL7207-pUC-GFP在肝、脾及肿瘤组织中能长期存活,以肿瘤组织中聚集明显(P<0.05)且维持时间较长。荷瘤裸鼠口服真核表达GFP基因重组菌SL7207-pEGFP-N1菌液实验表明,相对肝脏和脾脏组织,外源基因在肿瘤细胞内表达量最高。结论重组减毒鼠伤寒沙门菌可以在瘤体细胞内富集存活,并且携带的外源基因可以释放到肿瘤细胞内表达,具有作为基因治疗载体的双重优势。     

Construction and identification of recombinant attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing Helicobacter pylori urease subunit B

Objective To construct a recombinant live attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing Helicobacter pylori urease subunit B (ureB).Methods ureB gene was amplified by PCR and cloned into a prokaryotic expression plasmid pTrc99a, and the identified recombinant plasmid was then used to transform an attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain SL3261. The ureB expressed in the recombinant vaccine strain was analyzed by SDS-PAGE and optical density scanning. Two and 10 days after recombinant strain intragastric immunization, the C57BL/6 mice were sacrificed, and the spleens and terminal ileums were cultured.Results The ureB gene could be amplified from the recombinant prokaryotic expression plasmid pTrc99A-ureB and the plasmids extracted from transformed SL3261 strain. SDS-PAGE and optical density scanning indicated that ureB was expressed in the recombinant vaccine strain SL3261 (pTrc99A-ureB) as a protein with 66*!kD of molecular weight. Recombinant strain was found in both spleen an terminal ileum of each mouse two and ten days after intragastric immunization.Conclusions A recombinant liver attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain expressing Helicobacter pylori ureB was constructed and identified, and this study will help to develop an oral recombinant live vaccine against Helicobacter pylori infection.