简便快速检测质粒DNA的方法 (一)可用于检测和筛选的快速法

细菌常常含有染色体外小的环状DNA遗传因子——质粒。它可以作为遗传工程中克隆的主要载体。它与某些细菌病原性有关,例如各种耐药性质粒,引起小儿腹泻和成年人旅游者腹泻的大肠杆菌肠毒素质粒,与金黄色葡萄球菌肠毒素B相关的质粒,引起猪、牛腹泻痢疾的K88、K99表面抗原质粒等等。因此无论在遗传工程技术,还是临床检验,都需要将质粒DNA检出,确定其大小,作为进一步的研究和分析。对于简便快速检测质粒DNA的方法已有一些报导,但有的并不简便。我们应用菌落溶解物法;直接从琼脂平板上挑取1—2个大菌落或少量菌苔裂解,进行琼脂糖凝胶电泳,检测的效果是满意的。     

快速鉴定猪源性大肠杆菌K_(88)质粒的两种简便方法

本文叙述了快速鉴定猪源性大肠杆菌K_(88)质粒的两种简便方法——(1)60℃保温法;(2)煮沸法。这两种方法分别适用于从猪源性大肠杆菌中,人肠毒性大肠杆菌中以及转化子中快速筛检存在的细菌质粒。     

微波聚乙二醇酶联免疫法快速检测“乙肝两对半”

长期以来,乙肝病毒的检测方法有放射免疫法、聚合酶联反应法和酶联免疫法。放射免疫法灵敏度高,但废料需特殊处理;聚合酶联反应法只能测病毒的DNA或RNA;酶联免疫法虽具有简便、快速、特异性强、重复性好等优点,但由于此方法操作程序多、耗时长,故不利于更好、更方便地检测。     

碱洗脱及荧光分析法检测电离辐射所致哺乳动物细胞DNA单链断裂

膜过滤碱洗脱法检测细胞DNA单链断裂,由于方法简便、灵敏度较高,已在一些方面得到应用。但目前使用的方法大多利用放射性同位素检测DNA,需要将细胞事先用~3H-或~(14)C-TdR标记,因此使得此方法的应用范围受到一定限制。我们改用荧光法测     

微波炉快速制备琼脂糖凝胶板

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定、纯化DNA片段的标准方法。常用制备琼脂糖凝胶的是煮沸法,我们则将琼脂糖置于三角烧瓶中,加入一定量的TBE缓冲液放入微波炉中,开满档定时为60s即可完全溶解,取出后即可制备凝胶板。全过程仅用5min。用此     

快速鉴定和大量纯化质粒DNA的方法

近年来遗传工程技术的发展,使细菌质粒DNA被广泛地用作无性繁殖外源DNA的载体。由此建立了许多抽提和纯化质粒DNA的方法。本文对Birnboim等人的快速碱性抽提质粒DNA的方法作了某些修改,可较好地防止质粒DNA的“不可逆变性”形式的出现,大大加强了快速鉴定的准确性。在此基础上,协同羟基磷灰石柱层折等方法,还     

用改进的探针杂交法检测免疫球蛋白重链基因重排

对传统的Southern杂交法进行了改进:用碱变性和酚抽提法提取重组质粒,省去氯化铯梯度离心;用随机引物合成法代替缺口翻译,直接标记质粒,不进行限制性内切酶消化和琼脂糖电泳分离探针DNA片段;用酒精沉淀法代替柱层析收集标记的放射性探针.用低熔点琼脂糖法提取细胞染色体DNA,经酶切电泳,将凝胶板干燥,进行原位杂交;杂交液采用0.5%脱脂奶粉,以代替Danhardt's溶液和鲑鱼精子DNA.用此法检测了4株急性淋巴细胞白血病细胞株,发现只有1株T细胞未发生免疫球蛋白重链基因重排,其余3株B细胞两条重链均已发生重排.此法简便、灵敏,可用于白血病临床诊断.     

DNA的微量荧光分析法

建立了用 DABA 荧光分析法检测微量 DNA 的方法,确定了最佳测定条件,该方法简便,快速、灵敏度高,稳定性及重复性好,对测定微量 DNA 含量是一种切实可可行的方法。     

Hendra病毒的实时PCR检测方法的建立

目的：建立针对Hendra病毒的敏感、特异和快速的实时PCR法，为Hendra病的早期诊断提供依据。方法：采用常规PCR法和实时PCR法分别对构建的Hendra病毒全长G基因的重组质粒DNA进行扩增，并比较两种方法的敏感性。结果与结论：应用常规PCR方法可检测到100fg/μl的含Hendra病毒特异序列的重组质粒DNA，而实时PCR法则可检测到0．1fg/μl的DNA，后者的敏感性比常规PCR法的提高了1000倍，该方法不但操作上更加简便、快速，还可避免交叉污染，适于对Hendra病毒特异序列的检测。     

定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的建立一种简便、快速、定量检测炭疽芽孢杆菌的PCR方法。方法采用TaqMan荧光探针技术,针对炭疽芽孢杆菌质粒pXO1、pXO2上的基因设计引物;用炭疽芽孢杆菌（Sterne株）污染环境土壤来模拟实际样本,比较了从土壤中提取DNA的不同方法对检测效果的影响,并与同类进口试剂进行了平行比对。结果以含有检测目的片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度可达到101拷贝/μl;用Sterne株芽孢悬液污染土壤,检测灵敏度可达2.5×103cfu/g土壤。我们研制的试剂与进口试剂在敏感性和准确性方面一致,且操作简便。结论本研究建立的炭疽芽孢杆菌实时定量PCR检测方法可特异、灵敏地检测土壤标本中可疑目标菌。     

荧光染色法快速检出细胞培养物中的支原体

我们参照Chen的报道,根据发荧光的双苯咪唑化合物(Hoechst-33258,简称H-33258)能结合DNA的特点,建立了从细胞培养物中快速检测支原体污染的方法. 在此基础上检查了21株细胞培养物标本,并与常规的半固体培养法、电子显微镜检查法进行了比较.结果表明该方法具有快速、简便和敏感性高的特点,更适合于一般实验室快速检测细胞培养物中支原体污染的需要.     

微量快速分析梭曼的荧光法

建立了一种灵敏度高、简便、快速及重复性好的用荧光测定梭曼的方法。该方法检测灵敏度：梭曼的可测出浓度最低能达到１０ｎｇ／ｍｌ。变异系数在２．８％以内。梭曼浓度与荧光强度呈良好的线性关系，是一种比较理想的微量检测方法。     

用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA

目的：用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变。方法：用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌，利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至Ⅳ基因长约2100bp的DNA序列，并用kil-N序列中含有的单一酶切位点Xho Ⅰ对混合质粒进行酶切，取酶切产物转化W3110感受态细胞，菌落PCR方法筛选重组阳性克隆。结果：在没有任何筛选标记的情况下，用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆。结论：该方法操作简单、精确，能够避免引入新突变。为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法。     

一种快速准确检测HLA-B27的荧光标记单克隆抗体

HLA—B27是血清学检测的HLA—B座位上的一个等位基因。因为它和强直性脊椎炎(AS)高度关联,所以检测HLA—B27非常重要。通常HLA—B27的检测是采用标准的NIH微量细胞毒法,这种方法准确且重复性好,但是它依赖补体和需要纯化的淋巴细胞。作者用鼠的骨髓瘤细胞和被HLA—B27阳性     

志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

质粒DNA简易制备法

在DNA重组试验中,所需质粒DNA的制备往往耗费很多人的精力和时间。而且一般都需要高速冷冻离心机。因此,建立一种质粒DNA简易制备法是很有必要的。为此我们将Birnboim等人的碱变性快速提取法(以下简称碱变性法)和Ohlsson等人的两相快速分离法(以下简称两相法)等两种微量方法相结合,用于大量制备质粒DNA,获得了较满意的结果。该方法简便易行、得     

ZNF451通过调控53BP1/MDC1促进A549和HeLa细胞DNA损伤修复

目的:探究SUMO E3连接酶(zinc finger protein 451,ZNF451)介导非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞DNA损伤修复的功能及机制。方法:采用γ射线或依托泊苷处理A549细胞和HeLa细胞,CCK-8法检测细胞增殖活力,蛋白免疫印迹法检测蛋白表达量。DR-GFP质粒系统检测DNA损...     

菌落PCR快速分析抗体库重组率时的假阳性现象

目的　评价菌落PCR法鉴定噬菌体抗体库阳性重组率的可靠性。方法　鼠抗体基因Lc片段、Fd片段经酶切、纯化后 ,依次克隆入pComb3载体上相应的酶切位点 ,电转化XL1 blue菌后建立鼠源性Fab噬菌体抗体库。比较菌落PCR法、质粒PCR法及质粒酶切法鉴定转化菌阳性重组率的一致性。同时用空菌、空载体、空载体菌等作模板为对照PCR ,以排除相关组分的干扰。结果　建立的Lc库的库容为 1.175×10 6CFU ,Fab库的库容为 1.0 2×10 6CFU。 3种方法鉴定的阳性重组率不同 (Lc的重组率依次为 10 0 %、78%、78% ,Fd的重组率依次为 90 %、6 6 %、6 6 % ,Lc与Fd同时插入的重组率依次为 90 %、5 0 %、5 0 % )。菌落PCR法鉴定的重组率偏高 ,存在假阳性现象。对照PCR提示 ,XL1 blue菌本身可能是导致假阳性扩增的原因。结论　用菌落PCR法不能准确鉴定噬菌体抗体库的重组率 ,用质粒PCR法或质粒酶切法鉴定更为可靠     

焦磷酸测序技术检测细胞色素2D6＊ 10基因多态性方法的建立

目的利用焦磷酸测序技术建立高通量细胞色素2D6＊1 0突变检测方法。方法应用带有生物素标记的扩增引物,经聚合酶链式反应扩增及Beads分离,制备该突变位点焦磷酸测序单链模板,并在PyroMarkID焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序,以经典ABI测序法测序结果作为标准对照,观察批量检测96例高血压患者DNA标本细胞色素2D6＊ 10突变的可靠性。结果建立了基于焦磷酸测序技术的一次性96例细胞色素2D6＊ 10突变位点的批量检测平台,经重复性检测和标准的ABI测序可靠性检测,焦磷酸测序法对细胞色素2D6＊ 10突变位点的突变检出率及重复率均达100%。结论本方法可准确、快速、高通量检测细胞色素2D6＊10突变,可应用于该单核苷酸多态性位点批量检测需要。     

应用PCR-SSP方法快速检测基因HLA-B＊ 1502

目的通过序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）方法检测等位基因HLA-B＊1502,并对检测结果进行讨论。方法根据HLA核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列,设计一系列等位基因型特异性引物,通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段,产生相对应的特异性扩增产物条带,并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果运用4对等位基因型特异性引物,用PCR仪扩增出2份样本等位基因型HLA-B＊1502,并与阴性和空白样本平行对照。结论应用PCR-SSP方法检测基因HLA-B＊1502,快速、简便、安全、有效。