突变敏感性分子开关检测线粒体DNA A1555G位点的条件优化

目的对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA(mt DNA)A1555G位点条件进行优化。方法利用3'硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mt DNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定最佳反应条件。结果分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳PCR条件:退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6μmol/L,检测模板浓度为103~106copies/μL。结论确定了分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据。     

乙型肝炎病毒全长基因组的扩增

目的:探讨扩增乙肝病毒全长基因组合适的PCR反应条件。方法:设计针对负链5′末端引物,PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因。改变PCR反应条件,决定最佳退火温度和最佳引物浓度,并观察不同乙肝病毒DNA模板量对PCR扩增效率的影响。结果:最佳退火温度为68℃,最佳引物浓度为0.5μmol/L,模板量在150拷贝以上能扩增出乙肝病毒全长基因,但模板量达到105拷贝抑制扩增效率。结论:退火温度为68℃、引物浓度为0.5μmol/L、乙肝病毒DNA模板量在150～105拷贝为乙肝病毒全长基因扩增的合适PCR反应条件。     

长聚合酶链反应（LPCR）的进展

聚合酶键反应（PCR）是一种体外扩增DNA的有效技术。目前该技术主要用于扩增数百个到上千个碱基对（kb）的DNA片段。但是在许多分子遗传学研究中，如基因图谱分析，则需扩增更长的DNA片段才有价值。长片段DNA的PCR扩增近年已有报道[1]，例如选择不同的耐热DNA聚合酶、改过缓冲浪成份及循环条件等，可以扩增出10～15kb的片段，但产量低，多数实际应用仍限制于5kb以内。直到1994年，Barnes［2］和Cheng［3］等对DNA合成中碱基错配现象和模板DNA的损伤两个问题进行了研究并探讨了解决办法，其结果使PCR扩增）噬菌体DNA达42kb，扩…     

毛细管直接PCR方法快速鉴定NDM-1阳性细菌

目的建立一种无需核酸提取预处理的毛细管PCR方法,用于新德里金属酰胺酶(NDM-1)阳性细菌的快速鉴定。方法考察在直接加入细菌培养液条件下,两种改良型DNA聚合酶Terra和MightyAmp DNA聚合酶对NDM-1编码基因的扩增效果。选用其中一种DNA聚合酶进行毛细管PCR,确定其对于NDM-1阳性细菌的检测限。结果当分别向25 μLPCR反应体系加入1、3、5、7μL细菌培养液条件下,两种DNA聚合酶均能有效扩增NDM-1编码基因序列,Terra DNA聚合酶效果较好。采用两步法毛细管PCR扩增NDM-1编码基因,3 μL反应体积条件下,40个循环反应在20 min内完成。结论应用改良型DNA聚合酶可以免去细菌核酸纯化步骤直接进行PCR。免核酸提取扩增结合毛细管PCR方法可以显著缩短核酸分析时间,适合于NDM-1阳性细菌的快速鉴定。     

乳液单引物PCR构建随机ssDNA文库方法的建立及优化

目的建立并优化乳液单引物PCR扩增法,高效构建高质量随机ss DNA文库,以提高从随机文库中筛选适配子的几率。方法构建长90 bp(含52 bp随机序列)寡核苷酸文库,用乳液PCR转换成ds DNA文库,再以ds DNA文库为模板,分别用乳液单引物PCR和常规单引物PCR扩增制备ss DNA文库,并对二者进行比较。通过改变模板、聚合酶、d NTP和引物浓度优化乳液单引物PCR反应条件。结果乳液PCR能高效扩增出ds DNA文库且无副产物;常规单引物PCR构建ss DNA文库时,15个循环时即有大量副产物产生,且与产物条带混合一起无法分离;而乳液单引物PCR从15~35个循环均无副产物生成,且产物量多于常规单引物PCR。在优化乳液单引物PCR时,模板浓度对产物量影响最大,引物浓度对副产物的量影响最大。结论乳液单引物PCR能显著提高产物量并控制副产物的量,可提高指数富集配体进化(SELEX)技术筛选效率。     

适用的人外周血白细胞DNA模板制备方法

聚合酶链反应（PCR）技术以其高度灵敏、特异、简便、易于自动化的特点，在临床医学病毒学、细菌学、支原体、衣原体、寄生虫学、遗传学、白血病、骨髓移植、法医学等基因诊断方面得到非常广泛地应用。PCR技术的实质是在模板DNA、特异性引物及dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。其特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性，即引物是PCR成功的关键。但由于PCR技术影响因素较多，往往许多小的环节不慎也可导致试验失败。比如在一般PCR操作过程中认为对模板的纯度要求并不严格，但因标本中含有许多杂质能抑制Ta…     

两种常见缺失型α-地中海贫血快速检测技术的研究

目的：建立简便快速准确可推广使用的检测α－地中海贫血（α-Thal)右侧失型（－α^3.7)和左侧缺失型（－α^4.2)的聚合酶链反应（PCR）方法。方法：自行研究设计两组引物。优化PCR反应条件。PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离,溴化乙啶染色,UVP凝胶成像仪下观察记录电泳图谱。结果：运用引物A′、B′、C3进行PCR,出现1700bp扩增带表示－α^3.7,出现1900bp扩增带表示α－珠蛋白基因正常或为野生型。二条扩增带同时出现表示是－α^3.7缺失杂合子。无任何扩增带表示是是东南亚型缺失纯合子。运用引物G′、E、F′进行PCR,根据出现1580bp扩增带和1180bp扩增带可诊断为－α^4.2,还可区分杂合子与纯合子。结论：本研究设计的两组引物及优化的PCR条件,可以简便准确地检测出α－Thal标本中有无－α^4.2和－α^3.7。     

实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析在α-地中海贫血基因诊断中的价值

目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α地中海贫血基因型的技术。方法运用SYBRGreen1和ABI7000热循环仪分别进行3个实时荧光定量聚合酶链反应(SYBRQPCR),同时进行融解曲线(D.C)和Tm值分析,根据特定Tm值对应的D.C峰值判定基因型,即以该峰值≥Cutoff值定为PCR结果阳性。将PCR产物重组到T载体,筛选到含正确扩增片段的克隆,以梯度稀释重组质粒DNA为模板,进行SYBRQPCR得出标准曲线。从而定量未知标本。结果优化了3个SYBRQPCR反应的引物及其浓度,热循环条件等。检测SEA等位基因的PCR产物长800bp,Tm=82.5℃±1℃。αα等位基因的PCR产物长206bp,Tm=83.0℃±1℃。非SEA等位基因的PCR产物长436bp,Tm=84.0℃±1℃。重组质粒拷贝数在1至105范围内,其对数值与CT值均呈良好线性关系。该检测技术的灵敏度较常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高出16倍以上。联合运用3个SYBRQPCR反应可以为SEA缺失携带者、缺失型HbH病、非缺失型HbH病、α地贫2纯合子、Bart′s水肿胎儿综合征做出基因诊断,并可用于产前诊断。结论该技术具有自动化程度高、不需荧光标记探针、成本低、易质控、防污染、高通量等优点,适于临床推广应用。     

性病病原体多重聚合酶链反应检测方法的建立和验证

目的建立同时检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体和单纯疱疹病毒-2致病微生物的多重聚合酶链反应（PCR）方法,用于四种性病的诊断和治疗监测。方法根据淋球菌外膜孔蛋白基因、沙眼衣原体基因、解脲支原体尿素酶基因和单纯疱疹病毒-2的DNA聚合酶基因序列,各设计一对特异性引物,优化反应体系和条件进行多重PCR反应。结果4对引物分别扩增出327、167、426、391bp的目的条带,并且特异性强,与其他非目的病原体基因不发生反应。结论本研究建立的多重PCR方法为相关病原体的快速检测提供方法。     

SARS康复者及医护人员冠状病毒的初步调查

目的　采用荧光聚合酶链反应 (F PCR)和基因芯片技术检测严重急性呼吸综合征 (SARS)冠状病毒 ,并探讨其临床应用价值。方法　应用 SARS Co V F PCR诊断试剂盒及基因芯片技术检测了 6 0份确诊 SARS患者血清、发热门诊医护人员血清 2 0份和漱口液样本 2 0份以及 1份 SARS疑似患者血清的 c DNA。结果　中山大学达安基因股份有限公司及上海复星实业股份有限公司的两种 F PCR检测试剂盒及晶宇芯片反应 3种检测方法所测 80份血清和 2 0份痰液样本均为阴性 ;但 1例 SARS疑似患者血清的 c DNA可经荧光定量 PCR反应扩增出病毒特异 RNA片段。结论　 SARS康复者及密切接触医护人员血液和漱口水中均未检测到 SARS病毒特异 RNA片段。     

提高乙型肝炎病毒P基因区聚合酶链反应检测阳性率的策略

目的：提高乙型肝炎病毒（HBV）DNA P基因区聚合酶链反应（PCR）检测的阳性率。方法：采用优化PCR反应条件，降低退火温度以及采用3'末端碱基游移兼并引物，减少引物与模板引物结合区的错配对PCR的影响等多种方法，对常规PCR检测HBV DNA P基因区阴性的病人血清，再进行PCR检测。结果：通过降低退火温度及减少3'末端错配，PCR检测阳性率由81．7％（67／82）增加至92．7％（76／82，P＜0．05）。结论：综合采用优化PCR反应条件，降低退火温度和采用3'末端碱基游移兼并引物等方法，可提高基因高突变区PCR检测阳性率。     

基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血基因突变

目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血。方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS2-654区域序列,分别设计突变序列扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸反应,将其PCR产物克隆到pMD19-T载体,得到β地中海贫血常见的两个突变位点的基因突变克隆:CD41-42、IVS2-654,然后以这两个突变位点为检测靶点,分别设计3′末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物,硫化磷酸修饰3′末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析。结果:当引物与模板完全配对时,引物被延伸,有PCR产物;当引物与模板不完全配对时,引物不被延伸,无PCR产物。结论:高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关能准确、快速筛查β地中海贫血CD41-42、IVS2-654突变,提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景。     

假丝酵母SSR-PCR反应体系的优化

目的建立假丝酵母SSR-PCR反应体系,确立最佳反应条件,为将该技术用于临床假丝酵母感染的快速鉴定奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响SSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物等4种主要因素,进行优化。结果引物最适退火温度为51℃。假丝酵母最佳的SSR-PCR反应体系为：在25μl的PCR反应体系中加入Taq DNA聚合酶1.0 U、模板DNA为25 ng、dNTP为0.15 mmol.L-1、引物为0.5μmol.L-1。结论采用正交实验优化的SSR-PCR反应体系,操作简便,电泳条带清晰,多态性好,重复性强,可为进一步建立临床假丝酵母感染的快速鉴定提供借鉴。     

基因放大技术

基因放大技术又称之为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),是指用简单的试管反应的方法,在体外合成某一基因特异的DNA片段成百万个拷贝,然后再进行分析。为了大量扩增这个DNA片段,需先合成与这一段DNA两端互补的一小段寡核苷酸,长度约10—20个核苷酸,作为合成新DNA的引物。在反应液中,将基因DNA加热,变性,解链。退火时,引物与此DNA两条链按互补顺序配对。加     

DNA聚合酶ε的生物学功能研究进展

DNA聚合酶ε属于DNA聚合酶B家族,是参与真核生物细胞DNA合成和复制的关键酶之一,其由Pol2、Dpb2、Dpb3和Dpb4亚基构成。DNA聚合酶ε具有5′-3′聚合酶活性和3′-5′外切酶活性,同时参与多种形式的DNA损伤修复过程,对于基因完整性有重要意义。本文就DNA聚合酶ε的结构及功能最新研究进展进行综述。     

定量PCR技术

聚合酶键反应（PCR）是模拟DNA体内复制过程,在体外将DNA片段加以人工扩增的技术。有许多因素都可以影响PCR的扩增效率,导致常规PCR的特异性不强,准确性不高,为此,大量学者设计了定量PCR技术,以克服各种因素对PCR扩增的干扰,从而提高PCR的特异性及准确性。本文对定量PCR技术进行了简要的综述。     

PCR技术及其进展

DNA重组技术的出现，能用分子克隆研究单个基因，但必须依赖于细胞分裂时质位或其它载体携带的DNA的复制。R．K．SaiKi和K．B．MSllis分别于1985年和1987年发展了多聚酶链反应（polyIDeraseChainreaction，PCR）技术，可在体外用简单酶促反应以一个DNA模板大量扩增特异DNA片段。从复杂基因组得到纯的特异DNA片段，用传统的克隆技术需几周甚至几个月，用PCR则只需几小时。克隆开始常需百万分子DNA，PCR却少到仅需1分子，甚至不需要纯的、未受损伤的模板DNA。PCR是受DNA聚合酶催化，以某段目标DNA为模板，以寡核着酸链为…     

梅毒感染诊断中Tp0259-PCR方法的建立

目的建立聚合酶链反应(PCR)方法扩增梅毒螺旋体Tp0259基因,为进一步探讨其在梅毒感染诊断中的作用提供依据。方法从Genbank获取Tp0259基因序列,生物信息学分析,设计特异性引物。收集Tp Nichols株感染组和对照组的新西兰兔睾丸标本,提取全基因组DNA,通过优化PCR扩增条件寻找最佳反应体系和反应条件,PCR扩增Tp0259的编码基因,同时通过新构建扩增方法检测泌尿生殖道感染常见病原微生物。结果通过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳,只有感染梅毒螺旋体的新西兰兔标本才能扩增出特异性条带,条带位置约为646bp,其他病原微生物未见扩增条带。结论检测Tp0259基因能用于诊断梅毒螺旋体的感染。     

聚合酶链式反应的研究与应用进展

核酸分子杂交技术作为传染病、遗传病等疾病的基因诊断方法,已逐渐广泛地应用于临床和科研工作中。但某些疾病的待检核酸序列含量太低,使核酸分子杂交的应用受到限制。近年发展起来的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),能够在体外进行DNA 扩增,具有简易、快速、灵敏和高效等优点,一定程度上解决了这个问题。本文对PCR 的原理,研究及应用进展综述如下。一、原理PCR 的基本原理是:利用两个具有3′端     

肺癌组织中puma基因第三外显子扩增的实验条件研究及应用

目的 优化肺癌组织中puma基因第三外显子(GC含量＞80%)PCR扩增的最适实验条件,应用此条件对34例肺癌组织中puma第三外显子进行突变研究,探讨其与肺癌发生发展的相关性.方法 通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,确定puma基因第三外显子PCR扩增体系最适浓度和反应条件.应用优化后的反应体系扩增34例肺癌puma第三外显子,测序寻找突变.结果 PCR反应体系为dNTP 200 μmol/L, 增强体系MgSO4 2.0 mmol/L,引物500 nmol/L,Taq DNA聚合酶0.1 U/μl,模板量不低于4 000 ng,10×增强体系缓冲液5 μl,增强液5 μl,总体积50 μl.反应条件为95℃预变性5 min,95℃ 45 s,64℃ 45 s,72℃ 45 s,循环33次,最后72℃延伸5 min.应用以上最适条件,成功扩增34例肺癌患者puma基因第三外显子,经测序均无突变.结论 肺癌患者puma基因第三外显子突变与肺癌的发生发展及肺癌的病理类型之间无明显相关.