TGF-β/SMAD4信号通路中基因突变对胰腺癌患者生存的影响

目的:分析胰腺导管腺癌患者转化生长因子（TGF）-β/SMAD4信号通路中基因突变的情况及对生存的影响。方法:回顾性分析天津医科大学总医院普通外科2016年7月—2019年9月共19例胰腺导 管腺癌患者的临床资料,NGS检测患者基因突变情况,查询dbSNP及COSMIC数据库关键基因突变位点的临床意义。结果:19例胰腺导管腺癌患者中最常见的基因突变是 KRAS（84.2%）、TP53（68.4%）、 SMAD4（26.3%）、CDKN2A（26.3%）、CREBBP（15.8%）、RNF43（15.8%）、BRAF（15.8%）等。具有TGF-β/SMAD4信号通路相关基因突变的患者有7例（36.8%）,其中SMAD4基因突变组中位生存时间5.0个 月,无SMAD4基因突变组中位生存时间14.0个月,差异有统计学意义（P=0.032）。结论: TGF-β/SMAD4信号通路中具有SMAD4基因突变患者的临床预后相较于无基因突变患者的临床预后更差,此通路中 具有多个基因突变其预后相对更差。     

石蜡包埋人胰腺癌组织中DPC4/SMAD4/MADH4基因的改变

目的研究石蜡包埋人胰腺癌组织中DPC4/SMAD4/MADH4基因的改变。方法用PCR-SSCP、PCR产物直接测序法检测46例石蜡包埋人胰腺癌组织中DPC4基因改变情况,用原位杂交(ISH)、免疫组织化学(IHC)检测56例石蜡包埋人胰腺癌组织DPC4的mRNA、SMAD4蛋白表达情况。结果胰腺癌DPC4基因第1、2、3、4、8、11外显子的纯合性缺失率为28.26%,突变率为21.74%,测序显示有3例无义突变,5例错义突变,1例插入、缺失及错义突变,1例插入突变。ISH、IHC显示胰腺癌DPC4/SMAD4阳性率分别为53.57%、58.93%,而对应正常胰腺阳性率分别为91.07%、89.29%。统计学分析表明胰腺癌与正常胰腺有显著性差异(P<0.05)。32例胰腺癌进行了PCR-SSCP、测序、ISH和IHC实验,四者结果一致者28例,符合率为87.50%,其中基因改变与ISH符合率为87.50%,基因改变与IHC符合率为96.88%。56例胰腺癌的ISH与IHC符合率为91.07%,统计学分析显示上述三组阳性率间均无显著性差异(P>0.05)。结论人胰腺癌纯合性缺失和突变是DPC4失活的主要机制,胰腺癌与正常胰腺相比,SMAD4表达明显下降,DPC4作为一种抑癌基因,其改变可能为胰腺癌的重要分子事件,在胰腺癌的形成中可能起重要作用。     

胰腺癌中VEGF-D及其受体Flt-4的表达与淋巴结转移的关系

目的:探讨VEGF-D及Flt-4蛋白在胰腺癌组织中的表达与胰腺癌淋巴结转移之间的关系。方法:选用63例根治性手术切除的胰腺癌组织分为有淋巴结转移组与无淋巴结转移组,另选取13例正常胰腺组织做对照。采用免疫组织化学方法(Envision法)检测VEGF-D及Flt-4蛋白在胰腺癌的表达,并进行统计学分析。结果:VEGF-D阳性表达产物主要见于癌细胞胞浆,而Flt-4阳性表达产物主要位于癌周组织的微血管和淋巴管内皮细胞胞浆。有淋巴结转移组癌组织中VEGF-D的表达率92%(23/25)高于无淋巴结转移组44.7%(17/38)(P<0.05);有淋巴结转移组中Flt-4蛋白阳性表达率92%(23/25)显著高于无淋巴结转移组中的47.4%(18/38)(P<0.05);VEGF-D、Flt-4的表达均与淋巴结转移呈明显正相关(P<0.05)。结论:胰腺癌中VEGF-D与Flt-4表达增高,具有促进胰腺癌的淋巴管增生,促进胰腺癌淋巴道转移的作用,可作为检测胰腺癌有无淋巴结转移的重要指标,选择性阻断VEGF-C或Flt-4的作用,对控制胰腺癌的淋巴道转移可能是一个有效的方法。     

干扰CXCR4基因抑制胰腺癌经典Wnt通路活化的体外实验研究

目的观察CXCR4 shRNA转染胰腺癌细胞后经典Wnt通路的活性变化.方法构建CXCR4 shRNA表达载体转染胰腺癌CXCR4高表达细胞Miapaca-2并应用G418筛选出稳定表达株,通过Realtime-PCR、WesternBlot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;通过PGL3-OT/OF荧光素酶检测方法观察CXCR4基因沉默后对胰腺癌Wnt/β-catenin经典通路活性的影响,并通过Realtime-PCR、Western Blot实验观察CXCR4 shRNA对Wnt/β-catenin通路下游靶基因的影响.结果特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70%以上,同时,特异性CXCR4干扰后能够显著抑制PGL3-OT转染后的荧光素活性（P〈0.05）以及Wnt/β-catenin下游靶基因的mRNA及蛋白的表达.结论CXCR4基因沉默能抑制Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌中的活性,阻遏Wnt/β-catenin通路下游靶基因表达,为CXCR4作为胰腺癌治疗的分子靶点提供依据.     

SMAD4低表达促进人血管平滑肌细胞迁移和凋亡

目的: 观察SMAD4表达下调对人主动脉血管平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cell, HASMC）迁移及凋亡的影响。方法: 以siRNA-SMAD4转染HASMC,抑制SMAD4表达,以细胞迁移实验（Transwell）和流式细胞术检测平滑肌细胞的迁移和凋亡率;蛋白质印迹法检测各凋亡相关蛋白的表达。结果： 与阴性对照组相比,转染siRNA-SMAD4后HASMCs早期和晚期细胞凋亡率均明显升高(P均＜0.05）。Transwell实验结果显示,siRNA-SMAD4组平均每视野迁移细胞数为114±21,明显多于空白组和阴性对照组（分别为19±6,25±7,P均＜0.01）。蛋白质印迹结果显示SMAD4低表达引起Cleaved Caspase-3表达上调、Bal-2表达下调。 结论： SMAD4低表达明显促进HASMC迁移和凋亡,有可能与主动脉瘤发生发展的病理机制相关。     

miRNA-141通过调节TLR4信号通路抑制大鼠血栓形成

目的 研究微小RNA(miR)-141对血栓模型大鼠血栓形成、血小板聚集及血浆中一氧化氮(NO)、环磷酸鸟苷(cGMP)和前列环素(PGI2)的影响.方法 90只SD雄性大鼠随机进行分组,10只为正常对照组;模型组使用5 g/L的CMC-Na建立大鼠动静脉旁路血栓模型(20只);治疗组在CMC-Na基础上分别静脉注射1...     

大黄素通过调节TGF-β1、Smad4抑制人胰腺癌的血管生成

目的 探讨大黄素是否抑制胰腺癌的血管生成及其机制。方法 建立胰腺癌SW1990细胞裸鼠原位移植瘤动物模型（SOI）,分为对照组（N组）、20mg/kg大黄素组（E₂₀组）、40mg/kg大黄素组（E₄₀组）和80mg/kg大黄素组（E₈₀组）。采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织CD34的表达,从而确定其微血管密度（MVD）。通过RT-PCR法分析肿瘤新生血管相关的TGF-β1、Smad4因子的表达,Western blot法分析肿瘤新生血管相关的TGFβ1、Smad4的表达。结果 免疫组织化学染色显示大黄素组MVD比对照组均显著减少,而且MVD与大黄素用药浓度呈负相关。大黄素降低TGF-β1的mRNA表达水平,并且与剂量呈负相关,E₄₀和E₈₀相对于对照组水平显著降低（P<0.05）。同时,大黄素明显增加Smad4基因mRNA的表达水平。Smad4基因在E₂₀、E₄₀和E₈₀组相对于对照组均显著提高（P<0.05）。Western blot法与mRNA水平的差异相符合,不同剂量的大黄素较对照组上调Smad4在胰腺癌组织中的相对蛋白水平（P<0.05）,而下调了TGF-β1的蛋白表达。结论 大黄素对裸鼠体内人胰腺癌SW1990细胞原位移植瘤的新生血管抑制作用效果显著。其机制可能是大黄素改变新生血管相关的TGF-β1、Smad4的表达有关。     

P16、P53和SMAD4蛋白在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨P16、P53和SMAD4蛋白在胰腺癌组织中的表达及其临床意义.方法采用免疫组织化学方法对30例胰腺癌组织和10例正常胰腺组织中P16、P53和SMAD4蛋白进行检测.结果 P16、P53和SMAD4蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为56.67%、43.33%和50.00%.在正常胰腺组织中的阳性表达率分别为100.00%、0和90.00%.两者比较差异有显著性（χ^2=4.60～5.00,P〈0.05）.P16、P53蛋白的表达与胰腺癌病人的临床病理特征无关,而SMAD4蛋白的表达在病理分化程度上存在显著差异（χ^2=7.98,P〈0.05）.结论 P16、P53、SMAD4蛋白在胰腺癌发病中起重要作用.     

S100A4-siRNA体外转染下调MMP-2表达抑制胰腺癌细胞侵袭能力的研究

目的观察S100A4基因沉默后人胰腺癌Bxpc-3细胞株S100A4和MMP-2的表达及肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化,探讨S100A4基因在肿瘤转移中的作用机制。方法采用RNA干扰技术将S100A4-siRNA转染至人胰腺癌Bxpc-3细胞,采用荧光实时定量PCR和Western免疫印迹方法检测转染前后S100A4和MMP-2的mRNA和蛋白表达;以Transwell小室模型检测转染前后癌细胞迁移和侵袭能力变化。结果转染后S100A4和MMP-2的表达均下调;细胞体外迁移和侵袭能力显著降低（P〈0.05）。结论 S100A4基因上调MMP-2的表达是肿瘤细胞具有高侵袭性的机制之一。S100A4基因可以作为胰腺癌基因治疗的一个靶点。     

花生红衣原花青素通过Wnt/β-catenin信号通路下调survivin表达诱导胰腺癌细胞凋亡

目的 探讨花生红衣原花青素(PSP)通过下调survivin表达诱导胰腺癌细胞凋亡的分子机制。方法 体外常规培养胰腺癌细胞株,配制100、200、300、400、500、600 μg/mL不同质量浓度的PSP,CCK-8法检测并计算不同质量浓度PSP在72 h内对胰腺癌细胞的抑制率,选取IC50=450 μg/mL作为PSP处理组剂量,并设对照组。Western blotting法检测胰腺癌细胞GSK-3β和β-catenin磷酸化程度、survivin、caspase-3和caspase-7蛋白表达水平,RT-PCR法检测胰腺癌细胞survivin mRNA表达水平,Annexin V-FITC/PI法检测24、48、72 h时PSP对胰腺癌细胞凋亡率的影响。 结论 与对照组相比,PSP处理组胰腺癌细胞GSK-3β和β-catenin磷酸化程度于12 h达到最高(P＜0.01)。PSP处理组胰腺癌细胞survivin mRNA的表达量与对照组比较明显降低(P＜0.01)。与对照组比较,在PSP的作用下,胰腺癌细胞中survivin蛋白表达量在72 h时最低(P＜0.01),caspase-3和caspase-7表达量在72 h时最高(P＜0.01),胰腺癌细胞凋亡率随着时间延长越来越高,在72 h时达到51.59%(P＜0.01)。结论 PSP可通过Wnt/β-catenin信号通路下调survivin蛋白表达诱导胰腺癌细胞凋亡。     

海参皂苷Echinoside A通过MMP-9信号通路抑制肿瘤转移

从富含海参皂苷的革皮氏海参中分离纯化出Echinoside A（EA）,并研究了其抗肿瘤细胞转移活性及其作用机制。通过MTT法检测了EA对肿瘤细胞(HepG2)和人脐静脉内皮细胞生长的影响;采用细胞黏附实验、划痕愈合实验和Transwell小室侵袭模型研究了EA对肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响;采用体外小管形成实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM )血管新生模型研究了EA对血管新生的影响。实验结果表明：EA能显著抑制肿瘤细胞和内皮细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和黏附能力,显著抑制 CAM 新生血管生成作用。免疫细胞化学和Western-blotting实验表明,EA能显著下调MMP-9和VEGF的蛋白表达,提高TIMP-1的表达,但是对NF-κB p65的表达无显著性影响;提示EA具有显著的抑制肿瘤转移作用,其作用机制可能是通过MMP-9信号通路并进一步抑制血管内皮生长因子的蛋白表达实现。     

呼吸道合胞病毒(RSV)对干扰素(IFN)信号通路STAT蛋白核转移的影响

 目的 研究呼吸合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)后,对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(interferon,IFN)诱导的JAK/STAT通路蛋白活化后核转移的影响。方法 从BALB/c小鼠的长骨中分离骨髓细胞,经过培养和刺激后得到BMDCs。将BMDCs接种于带小室的玻片上,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1的RSV感染细胞,并设紫外线灭活的RSV(UV-RSV)和培养液(media)刺激为对照。在培养24 h后,分别用100 IU/mL的IFN-β刺激30 min或0.64 pmol/L的IFN-γ刺激45 min,然后进行免疫荧光染色。在荧光显微镜下计数STAT蛋白核转移阳性细胞的百分比,比较各组间的差异。结果 在未感染的BMDCs中,STAT1和STAT2蛋白主要存在于细胞质中,当用IFN-β 刺激BMDCs后可见到明显的STAT1和STAT2蛋白向细胞核转移,核转移阳性细胞百分比分别为89.0%±4.6%和83.7%±5.1%,与未处理组(NT组)相比有明显差异(P<0.01)。而RSV感染后,发现STAT1和STAT2蛋白核转移阳性细胞数较IFN-β 刺激组明显减少(P<0.01),说明RSV感染可以抑制IFN-β诱导的STAT1和STAT2蛋白的核转移。而应用UV-RSV感染后与IFN-β刺激组相比,STAT1和STAT2蛋白核转移阳性细胞数却未见明显减少(P>0.05)。用IFN-γ 刺激BMDCs后也可见到明显的STAT1蛋白向细胞核转移(阳性细胞为85.3%±6.4%);而RSV感染后与IFN-γ刺激组相比,STAT1核转移阳性细胞数(79.3%±4.9%)却未见明显减少(P>0.05)。结论 RSV感染BMDCs后,能特异性地抑制Ⅰ型IFN诱导的STAT1和STAT2蛋白的核转移,而对II型IFN诱导的STAT1蛋白的核转移却没有影响。     

氯氧喹通过下调Rho/Rho激酶信号通路抑制乳腺癌细胞转移

目的: 通过观察氯氧喹对乳腺癌细胞系细胞骨架的聚合状态及其对Rho/Rho激酶信号通路相关靶点蛋白磷酸化的作用,明确氯氧喹治疗乳腺癌的作用机制。方法: 以不同浓度氯氧喹处理乳腺癌Bcap37和MDA-MB-453细胞系,划痕试验检测细胞迁移,Transwell试验检测细胞侵袭,罗丹明标记鬼笔环肽染色法观察F肌动蛋白的聚解状态,免疫荧光法观察α微管蛋白的表达,蛋白质印迹法检测Rho/Rho激酶信号通路关键蛋白磷酸化水平。结果: 氯氧喹可剂量依赖性地抑制细胞迁移和侵袭;Bcap37和MDA-MB-453细胞经氯氧喹处理后其细胞形态发生改变,细胞体积减少;F肌动蛋白和α微管蛋白染色形态不规则,荧光染色聚集成团,且呈现剂量依赖性;氯氧喹可下调Rho/Rho激酶信号通路中肌动蛋白解聚因子Cofilin、磷酸化蛋白激酶（Limk）、Rho关联卷曲蛋白激酶2（Rock2）磷酸化表达（均P < 0.01）。结论: 氯氧喹可抑制乳腺癌细胞骨架聚合从而抑制细胞迁移,该作用可能与抑制Rho/Rho激酶信号通路相关。     

BCORL1通过下调E-cadherin促进甲状腺癌细胞侵袭转移

目的:探讨甲状腺癌细胞中BCORL1对E-cadherin的调控及其对侵袭转移能力的影响。方法:采用Western Blot技术检测人甲状腺癌细胞TA-K、TPC-1和FTC-133中BCORL1及E-cadherin的表达;应用siRNA特异性干扰TA-K细胞中BCORL1的表达,Western Blot和qRT-PCR技术检测BCROL1和E-cadherin表达变化;Transwall侵袭和迁移小室检测BCORL1对TA-K细胞侵袭转移能力的影响。结果:BCORL1在TA-K细胞中的表达水平明显高于TPC-1和FTC-133,而E-cadherin表达水平则明显低于TPC-1和FTC-133;特异siRNA能显著下调BCORL1mRNA(t=14.025,P<0.000 1)和蛋白表达,导致E-cadherin mRNA(t=8.004,P<0.000 1)和蛋白表达升高;下调TA-K细胞中BCORL1表达能显著减弱细胞侵袭和迁移能力(t=5.942,P=0.000 3;t=7.115,P=0.000 1)。结论:人甲状腺癌细胞中BCORL1可能通过转录抑制调控E-cadherin表达,从而促进肿瘤侵袭转移。     

ELF4通过激活Akt通路促进胰岛素瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡

目的 探索ELF4促进胰岛素瘤细胞增殖与抗凋亡的作用及其机理。方法 利用逆转录病毒载体系统,构建稳定高表达ELF4的胰岛素瘤细胞BON-ELF4,以及载体对照组细胞BON-Vector。采用MTT法检测胰岛素瘤细胞BON-ELF4和BON-Vector各组细胞的生长情况。采用0.1 μmol/L化疗药物表阿霉素处理BON-ELF4和BON-Vector细胞24 h后,检测细胞凋亡相关指标,采用免疫印迹法检测各组肿瘤细胞中凋亡通路关键因子caspase-9,caspase-8和PARP切割带的表达水平;采用Annexin V-FITC/PI双染色结合流式细胞术分析各组细胞凋亡情况。采用免疫印迹法检测胰岛素瘤细胞BON-ELF4和BON-Vector细胞中Akt磷酸化水平。结果 免疫印迹法检测结果显示,BON-ELF4细胞中ELF4蛋白表达量高于对照组细胞BON-Vector（P=0.013）,稳定高表达外源性ELF4蛋白的细胞系BON-ELF4构建成功。稳定高表达ELF4的细胞系BON-ELF4生长明显较快（P<0.05）。相比较于载体对照组 BON-Vector,BON-ELF4 细胞在 0.1 μmol/L 表阿霉素处理 24 h 后 caspase-8,caspase-9的蛋白前体降低,而caspase-8,caspase-9切割成熟体升高（P<0.05）;同时,相应的PARP切割带随着ELF4的高表达而降低（P<0.05）;流式细胞术检测结果显示,22.90%的载体对照组BON-Vector细胞呈现出Annexin V阳性、PI阴性的早期凋亡结果,6.03%的BON-ELF4细胞组呈现出Annexin V阳性、PI阴性的早期凋亡结果。外源高表达ELF4的肿瘤细胞中Akt的磷酸化显著升高（P<0.05）,而Akt总蛋白的水平基本未受影响（P>0.05）。结论 ELF4能通过激活Akt通路而促进胰岛素瘤胞增殖和抗凋亡。     

ERK信号通路通过CXCR-4作用于乳腺癌细胞的侵袭转移研究

目的:ERK信号通路与肿瘤的侵袭转移密切相关,本研究拟阻断ERK通路,检测乳腺癌细胞CXCR-4表达变化,分析ERK信号通路对乳腺癌细胞CXCR-4表达的影响,探讨乳腺癌转移的分子机制。方法:以培养的人乳腺癌MDA-MB-435细胞为研究对象,加入ERK特异性阻断剂PD98059为实验组,加入等量生理盐水为对照组,作用于人乳腺癌MDA-MB-435细胞24 h后,采用Western blotting法检测ERK通路重要因子ERK1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达;采用流式细胞术检测细胞表面CXCR-4表达;采用Transwell侵袭实验观察空白对照组、CXCR-4配体SDF-1α组、ERK通路阻断组和SDF-1α+ERK阻断组细胞的侵袭转移情况。结果 :ERK通路被有效阻断后,CXCR-4表达量明显下调;在趋化因子受体CXCR-4的配体SDF-1α的作用下,细胞侵袭能力提高,而在ERK通路阻断后,细胞侵袭能力明显降低且SDF-1α不能逆转这种降低效应反而具有协同作用。结论:在人乳腺癌MDA-MB-435细胞中,ERK信号通路可能通过上调CXCR-4的表达参与乳腺癌细胞的侵袭和转移。     

埃兹蛋白通过L1细胞黏附分子信号通路促进肺癌转移

目的 研究埃兹蛋白(Ezrin)促进人肺癌发生转移的分子机制.方法 通过RT-PCR、Western blot检测肺癌细胞系中Ezrin的表达;划痕试验检测Ezrin对肺癌细胞系迁移能力的影响;Western blot检测Ezrin调控L1细胞黏附分子(L1CAM)的机制.结果 Western blot结果显示,与低转移肺癌细胞系H460、EBC-1比较,高转移细胞系95D及PC9具有更高的Ezrin蛋白表达(P＜0.05);用基因方法沉默95D细胞Ezrin表达后(siEzrin-95D),细胞划痕试验结果发现与95D细胞比较,siEzrin-95D细胞的迁移能力明显减弱(P＜0.05).与95D及H460细胞比较,基因沉默95D及H460细胞Ezrin表达后,其L1CAM的表达明显下调(P＜0.05).结论 Ezrin可能通过调节L1CAM的表达促进肺癌转移.     

姜黄素通过抑制TLR4信号通路下调脂多糖诱导的肺巨噬细胞分泌TNF-a、IL-6和IL-8

目的：研究姜黄素对原代培养的肺巨噬细胞表达TLR4mRNA及分泌TNF-a、IL-6和IL-8的影响。方法用脂多糖（LPS）建立体外肺巨噬细胞体外炎症损伤模型,用ELISA观察肺巨噬细胞分泌TNF-a、IL-6和IL-8和用RT-PCR、western blot观察肺巨噬细胞TLR4的表达。结果 LPS明显诱导肺巨噬细胞分泌TNF-a、IL-6和IL-8增加及TLR4的增量表达（P〈0.01）,姜黄素可抑制这种作用（P〈0.05）,且与姜黄素药物浓度有关（P〉0.05）。结论姜黄素对肺巨噬细胞的抗炎机制可能是通过抑制TLR4的表达,通过脂多糖-TLR4信号传导通路,从而减少炎性细胞因子的释放;姜黄素有可能作为一种有研究潜力的抗感染治疗的中药。