分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化,而失去多分化潜能,因此必须对培养的细胞及时冻存,需要时再进行复苏。 目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。 设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06/2008-06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。 材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。 方法:采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12.5% DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4 ℃冰箱2 h,然后移入-30 ℃冰箱2 h，再置于厚壁塑料泡沫盒中,扎紧密封,置-80 ℃冰箱过夜后,取出冻存管直接放入液氮中保存,或放入-80 ℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或- 80 ℃冰箱中取出,立即置37 ℃ 水浴并轻轻摇动, 1~2 min内迅速解冻。 主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。 结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长,贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后, 将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养,细胞形态及生长状态与冻存前无差异,均呈长梭形均匀分布生长,细胞生长增殖旺盛。 结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法可获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的影响

背景：目前用于分离骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠法，后两种方法可获得较为纯化的骨髓间充质干细胞，但对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。 目的：观察不同分离方法、培养条件下，兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的变化。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察，于2006-01/2007-06在中国医科大学附属盛京医院感染病实验室完成。 材料：日本雄性大耳白兔3只，由中国医科大学实验动物中心提供。Mesen Cult干细胞培养基为Vancouver BC公司产品，DMEM/F12（1∶1）培养基、LG-DMEM培养基均为Hyclone公司产品。 方法：无菌抽取兔髂前上棘骨髓，采取两种方法分离骨髓间充质干细胞。全骨髓贴壁分离法是将骨髓液注入等体积的Hanks液中，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，弃上清，用Hanks液重复洗涤。Percoll密度梯度分离法是将相当于2倍骨髓液体积的1.073 g/mL Percoll分离液加入15 mL无菌离心管内，再将抗凝的骨髓沿管壁缓慢加至分离液面上，4 ℃ 800 r/min离心 30 min，吸取分离液面上的白色云雾状单个核细胞层，用无血清L-DMEM培养液冲洗。将分离的骨髓间充质干细胞浓度调整为1×106，设立3组，分别加入Mesen Cult干细胞培养基、DMEM/F12培养基、L-DMEM培养基，各组培养基中均含有20%的胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 u/mL链霉素，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。 主要观察指标：不同分离方法、培养条件对细胞形态、生长特征、增殖的影响，细胞超微结构变化，传代后冻存复苏情况。 结果：全骨髓贴壁分离法1周后可见少许贴壁细胞伸出伪足，10~12 d形成散在细胞集落，16~18 d融合成单层；Percoll密 度梯度分离法培养1~2 d后可见部分细胞贴壁，5~7 d形成散在细胞集落，2周后融合成单层并铺满平底。不同培养条件下 的第3代骨髓间充质干细胞，Mesen Cult组细胞增殖能力、贴壁率、BrdU标记指数均略优于DMEM/F12组、LG-DMEM组，但差异无显著性意义（F=0.179，P > 0.05；F=0.098，P > 0.05；χ2=0.39，P > 0.05）。透射电镜下可见核仁，细胞器少，为低分化的幼稚细胞。复苏第9代冻存的细胞，4 h后贴壁率约60%，细胞增长活跃。 结论：Percoll密度梯度法和全骨髓贴壁法分离的兔骨髓间充质干细胞，前者可获得较均匀一致的单核细胞，在细胞增殖、清除造血细胞干扰等方面明显优于后者；Mesen Cult、DMEM/F12、LG-DMEM培养液均适用于兔骨髓间充质干细胞的培养；细胞冻存复苏后生长增殖状况良好。     

改良Dexter法与IMDM培养基培养骨髓基质细胞的比较*★

背景：体外分离培养骨髓基质细胞，并于骨髓移植后将其注入严重联合免疫缺陷鼠体内，对于促进造血及免疫重建尤为必要。 目的：比较骨髓基质细胞在不同培养条件下的生长状况，寻找一种体外分离培养扩增骨髓基质细胞简单而实用的方法。 设计、时间及地点：体外对比观察实验，于2006-07/2007-01在太原市中心医院皮肤科实验室完成。 材料：人骨髓取自太原市中心医院血液科经筛选的正常骨髓(取材均经患者同意)。 方法：分离人骨髓单个核细胞，对照组采用改良Dexter法培养：将骨髓单个核细胞用5×10-7mol/L氢化可的松的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×109 L-1，以每孔1 mL接种于24孔培养板，培养2 d后全量换液，去除非贴壁细胞，之后每3 d半量换液1次。细胞生长至半融合状态时传代，传两三代后用胰酶消化，收集细胞，液氮冷冻保存。实验组用IMDM培养基培养：用不含氢化可的松的IMDM培养基培养，其余成分及培养条件均与对照组相同。2 d后全量换液，去除非贴壁细胞，之后每4天半量换液1次。传代及收集方法同对照组。 主要观察指标：通过倒置显微镜观察细胞贴壁情况、形态变化及增殖状态，MTT比色法检测细胞增殖活性。 结果：倒置显微镜下，两组培养细胞在接种24 h后细胞大量贴壁并伸展开，随着培养时间延长，贴壁细胞数量增多，14 d左右细胞铺满板底达融合状态。传代细胞经消化后变形，24 h后恢复原来形态，并贴壁增殖，形态和原代细胞相似，4.0~ 5.0 d后呈融合状态。两种方法培养的骨髓基质细胞增殖活性差异无显著性意义（P > 0.05）。 结论：改良Dexter法及IMDM培养基培养均可使骨髓基质细胞在短期内贴壁及增殖。IMDM培养基由于不需加氢化可的松，故比改良Dexter法更易于操作。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。 目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10/12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。 材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。 方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8 h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5 d后首次换液，细胞融合率达90%时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。 主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48 h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14 d左右可达90%融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1~3 d为潜伏期，3 d后进入对数生长期，7~8 d为平台期，平均倍增时间为24.22 h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93.0%。 结论：采用密度梯度离心联合差速贴壁、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5 d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

体外培养羊骨髓来源间充质干细胞的生物学特性观察*

背景：目前关于鼠、兔等小动物骨髓来源间充质干细胞的研究较多,但涉及大动物骨髓来源间充质干细胞的报道甚少。 目的：体外培养羊骨髓来源间充质干细胞,并了解其生物学特性。 方法：取健康10月龄中国山羊1只,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓5 mL,采用全骨髓培养法接种于无菌塑料培养瓶中,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。待细胞达80%~90%融合后,胰蛋白酶消化传代。取P3代处于对数生长期的细胞予以冻存,然后进行复苏。倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,Von Kossa’s染色检测成骨诱导分化潜能。 结果与结论：原代培养羊骨髓来源间充质干细胞贴壁生长,呈梭形;P3代后细胞形态基本一致,均为长梭状;冻存复苏后细胞贴壁较传代细胞稍慢,细胞形态和活性与传代细胞没有明显差别。P3~P5代细胞生长周期基本一致,接种后两三天为生长迟滞期,3 d后进入对数生长期,六七天为生长平台期,其后生长速度减缓。羊骨髓来源间充质干细胞成骨诱导3周后,Von Kossa’s矿化结节染色呈阳性。证实所培养的羊骨髓来源间充质干细胞具有较强的遗传稳定性和增殖能力,可向成骨细胞定向分化。     

贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证**

背景：骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少。 目的：验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果。 方法：大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达。 结果与结论：培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长。细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底。分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达。结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性。     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。 目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。 方法：取ICR小鼠13.5 d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。 结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30 min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞及其生物学特性鉴定

背景：现阶段急需建立一种稳定的体外分离培养内皮祖细胞的方法,骨髓中内皮祖细胞的含量丰富,增殖能力强,而且容易获得,操作简单。 目的：拟在体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞,并对其生物学特性进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-08/12在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成。 材料：清洁级2周龄SD大鼠20只,由重庆医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,用预冷至4 ℃的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔,以密度梯度离心法收集单个核细胞层,含体积分数为20%胎牛血清的M199培养液重悬细胞,制成单细胞悬液后进行细胞计数,按1×109 L-1浓度接种到预先用纤维连接蛋白包被的培养瓶中,37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养。 主要观察指标：倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测内皮祖细胞表面特异性抗原CD133、内皮祖细胞表面抗原CD34和血管内皮生长因子受体KDR的表达,并进行流式细胞仪定量分析和细胞生长曲线分析。 结果：新分离获得的骨髓单个核细胞为小圆形,培养4 d后贴壁细胞呈“集落”样生长,中间为圆形贴壁细胞,外周梭形细胞较多,传代后梭形细胞首尾相连,呈“毛细血管”样排列。培养第4,7,10,14天贴壁细胞CD34,KDR,CD133均呈阳性表达,CD133阳性细胞第10天时开始减少。流式细胞仪检测结果显示,CD133/KDR双阳性细胞率逐渐升高, 10 d时达峰值,随后下降。KDR阳性细胞率随培养时间的延长而逐渐升高。原代细胞生长曲线显示细胞在第3~6天处于指数生长期,贴壁细胞大量增殖,呈“集落”样生长。 结论：采用密度梯度离心法可成功从SD大鼠骨髓中分离获得内皮祖细胞,加入M199培养液后能够贴壁增殖,并可以分化为内皮细胞。     

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化：Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性*★

背景：目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法，以去除血细胞成分，但该法操作较为复杂，分离犬骨髓时需要配制密度，且离心次数较多，对细胞损伤大。 目的：拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法，并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力。 方法：于犬髂后上棘抽取骨髓液10 mL，肝素抗凝，Hanks液稀释后，加入1.077 g/mL Ficoll液3 mL，2 000 r/min离心20 min，吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面，用含胎牛血清的DMEM离心2遍，按12×104/cm2密度接种，于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养。细胞传代后，加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导。免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达，以及Ⅰ型胶原的表达，并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色。 结果与结论：1.077 g/mL Ficoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显，可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞，接种细胞生长良好，平均倍增时间为24 h。犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后，骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达，碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色，茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节，可在体外定向分化为成骨细胞。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较*☆

背景：目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法：密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想。 目的：在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法。 方法：全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度。 结果与结论：全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高。     

人脐带血间充质干细胞的分离培养及增殖能力*

背景：随年龄的增加，骨髓来源的间充质干细胞在数量和质量上均受到影响，并对供体损伤较大，寻找替代的间充质干细胞来源成为研究热点，而脐带血中是否含有间充质干细胞仍存在争议。 目的：拟从人脐带血中分离培养间充质干细胞，并对其生物学特性进行检测。 方法：无菌条件下，应用Percoll密度梯度离心法分离脐血标本，收获中间层细胞，加入含胎牛血清、青霉素和链霉素、L-谷氨酰胺的DMEM基础培养液，再经反复贴壁纯化，除去悬浮生长细胞，得到较多呈融合状态的贴壁细胞，待细胞达60%~80%融合时胰酶消化传代。分别取第1，5，9代细胞，观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，绘制细胞生长曲线，MTT法检测细胞活性。 结果与结论：分离的脐血间充质干细胞大小均匀，呈梭形或星形的成纤维细胞样细胞。第1，5，9代脐带血间充质干细胞高表达CD29，CD105和CD166，低表达CD34和CD45；接种后5 d细胞进入指数增生期，9 d后数量减少，群体倍增时间为（53.5±8.32）h；细胞生长状态良好，在细胞活力方面1~7代基本相似(P > 0.05)，至第9代细胞增殖活力稍下降，但仍无明显差异(P > 0.05)。结果证实可在体外成功从脐血中分离培养出间充质干细胞，第1~9代细胞均具有良好的增殖能力。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响*

背景：骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题。 目的：观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响。 方法：分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48 h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达。分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F12 3种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化。 结果与结论：3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P < 0.05)。用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖。提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞。     

人脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

背景：目前所报道的脐带血间充质干细胞体外培养条件不尽相同,尚缺乏统一标准,且培养效率较低。 目的：拟对人脐带血间充质干细胞的分离方法、培养条件进行优化筛选。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-05/2008-04在中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室完成。 材料：35份脐带血标本来源于北京协和医院妇产科顺产或剖宫产胎儿。 方法：应用淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法分别从脐带血中获得单个核细胞。细胞接种后,应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12、L-DMEM和MesencultTM不同培养基,在不同体积分数胎牛血清（5%,10%,20%）、不同细胞接种密度（5×106,1×107,5×107,1×108）下进行细胞培养。细胞传至第3代诱导成骨,行Von Kossa染色。 主要观察指标：不同分离方法、培养基、胎牛血清浓度、种植密度分离培养细胞的效果,脐带血间充质干细胞表面标记的表达及成骨情况。 结果：与淋巴细胞分离液法比较,羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法获得的单个核细胞数量明显增多（P < 0.05,P < 0.01）,羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法细胞原代培养时间显著短于另2种方法（P < 0.01）。应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或MesencultTM培养基,T25培养瓶中细胞接种密度为5×107时,培养效率高于其余各种条件组合（P < 0.01）。贴壁细胞表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45,CD90及CD133,经成骨诱导培养21 d后Von Kossa染色可见黑色矿化结节。 结论：应用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法可以获得较多数量的脐带血单个核细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或MesencultTM培养基、细胞接种密度为5×107时可以提高脐带血间充质干细胞的培养效率。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？ 目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。 方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6 h内分别采用甲基纤维素沉降法(A组)、密度梯度离心分离法(B组)、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法(C组)、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法(D组)分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109 L-1~2×109 L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。 结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份(27%)培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5~7 d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或(和)圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60~90 d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞可以明显改善心肌缺血时的心脏功能，但其直接分化为心肌细胞并参与心功能恢复的机制尚不明确。 目的：探讨心肌条件培养液与5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞分化为心肌样细胞的作用。 方法：全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质干细胞，将第6代骨髓基质干细胞随机分为4组：5-氮胞苷+心肌条件培养液联合诱导组；5-氮胞苷组；心肌条件培养液组；基础培养基组(空白组)。用心肌条件培养液和5-氮胞苷诱导3周后用免疫组化法测定各组心肌肌钙蛋白表达，并采用单因素方差分析检验进行统计学分析。 结果与结论：在体外心肌条件培养液可以诱导骨髓基质干细胞向心肌细胞分化，提示其中细胞因子可能起关键作用，但心肌条件培养液的这种作用要弱于化学诱导剂5-氮胞苷的诱导作用，且联合诱导作用更强。     

人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验

背景：骨髓是目前间充质干细胞的主要来源，但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因，其应用具有一定局限性。近年来，羊膜作为间充质干细胞的新来源受到越来越广泛的关注。 目的：探讨人羊膜来源间充质干细胞在体外对造血干细胞的扩增是否有支持作用，以及怎样提高羊膜间充质干细胞和造血干细胞共移植成功率。 方法：利用组织块培养法，从足月分娩的人羊膜中分离培养羊膜间充质干细胞。密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，采用免疫磁珠分选技术分选其中CD34+细胞。分别用脐血单个核细胞和CD34+细胞与羊膜间充质干细胞共培养，连续4周，每周计悬浮细胞浓度，并以骨髓间充质干细胞组及无滋养层组作为对照。采用集落形成实验，把扩增的脐血单个核细胞和CD34+细胞分别接种至甲基纤维素半固体培养基中，14 d后根据典型形态特征计数造血集落数。 结果与结论：羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和CD34+细胞扩增，扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落，其造血支持作用与骨髓间充质干细胞相似，两者对比无明显统计学差异。提示，羊膜间充质干细胞体外具有与骨髓间充质干细胞相似的造血支持作用，有可能为造血干细胞体外扩增及临床间充质干细胞与造血干细胞联合移植、提高造血干细胞移植成功率提供一种更加理想的间充质干细胞新来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法。内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异。 目的：拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供。 方法：抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞。原代骨髓间充质干细胞培养48 h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化。设立3组：分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9~10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞CD34,CD45呈阴性,CD105呈阳性。2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8~10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的“铺路石”样,7~10 d细胞DiI-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性。2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P < 0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P < 0.05)。 结论：差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能。     

人骨髓间充质干细胞分离培养方法的改进*

背景：当前分离培养骨髓间充质干细胞方法的有多种,但在外科手术中进行获取的方法仍然较少,而外科分离所得细胞对于相应疾病的具有揭示原因和提供研究线索的价值。 目的：在骨科手术中以直接贴壁差速贴壁分离培养纯化与鉴定骨髓间充质干细胞。 方法：在骨科关节置换等大手术中吸取少量人骨髓血,采用直接贴壁法分离骨髓间充质干细胞,在贴壁后36~48 h行洗盘处理,并通过长期体外培养,特定培养基自身的筛选作用对细胞进行筛选,当细胞生长达到足量时进行鉴定。 结果与结论：采用直接贴壁法能够在长骨髓腔内混合血中分离培养骨髓间充质干细胞并形成集落,其形态学表现和表面分子经鉴定符合骨髓间充质干细胞特点,能够获得符合要求的人骨髓间充质干细胞,从而进行后续实验。