凝血酶对体外培养脑微血管内皮细胞的影响

目的 :探讨凝血酶 (thrombin ,TM)增加血脑屏障 (blood brainbarrier ,BBB)通透性的机制。 方法 :将脑微血管内皮细胞在体外进行培养 ,在细胞的培养液中加入TM或TM +组织蛋白酶G(cathepsinG ,CATG) ,应用相差显微镜动态观察TM及其受体抑制剂对内皮细胞形态的影响 ,应用免疫组织细胞化学技术检测基质金属蛋白酶 2 (matrixmetalloproteinase 2 ,MMP 2 )表达的变化。结果 :TM加入后 1h内皮细胞开始收缩 ,细胞面积变小 ,细胞间隙增宽 ,细胞收缩程度具有时间依赖性 ,至 12h时细胞面积仅为处理前的 2 0 %。TM使内皮细胞MMP 2的表达水平明显增加 ,与对照组比较 ,存在明显统计学差异 (P <0 .0 1)。TM +CATG加入培养液后 ,细胞形态、MMP 2的表达与对照组比较均无明显统计学差异 (P >0 .0 5 )。 结论 :TM通过激活蛋白酶激活受体 1(proteaseactivatedreceptor 1,PAR 1) ,使内皮细胞发生收缩 ,促进MMP 2表达 ,是TM增加BBB通透性的可能机制。     

凝血酶对体外培养脑微血管内皮细胞的影响

目的:探讨凝血酶(thrombin,TM)增加血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性的机制.方法:将脑微血管内皮细胞在体外进行培养,在细胞的培养液中加入TM或TM+组织蛋白酶G(cathepsin G,CATG),应用相差显微镜动态观察TM及其受体抑制剂对内皮细胞形态的影响,应用免疫组织细胞化学技术检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)表达的变化.结果:TM加入后1h内皮细胞开始收缩,细胞面积变小,细胞间隙增宽,细胞收缩程度具有时间依赖性,至12h时细胞面积仅为处理前的20%.TM使内皮细胞MMP-2的表达水平明显增加,与对照组比较,存在明显统计学差异(P＜0.01).TM+CATG加入培养液后,细胞形态、MMP-2的表达与对照组比较均无明显统计学差异(P＞0.05).结论:TM通过激活蛋白酶激活受体-1(protease activated recep-tor-1,PAR-1),使内皮细胞发生收缩,促进MMP-2表达,是TM增加BBB通透性的可能机制.     

凝血酶大鼠脑内注射对NF-κB活性的影响

目的 探讨大鼠脑内注射凝血酶（Thrombin，TM）对核因子（Nuclear factor-kappaB，NF-κB）活性的影响及其可能机制。方法 TM、TM＋组织蛋白酶G（Cathepsin G，CATG）脑内立体定向注射于SD大鼠尾状核，在不同的时间点处死动物，应用EMSA技术测定NF-κB活性。结果 凝血酶脑内注射后6h NF-κB活性开始增加（P〈0.05），24h时达高峰（P〈0.01），然后逐渐下降。CATG组NF-κB活性与对照组比较差异均无显著性（P〉0.05）。结论 TM通过蛋白酶激活受体-1（protease activated receptor-1，PAR-1）激活NF-κB，诱导炎症反应。     

凝血酶大鼠脑内注射对细胞凋亡的影响及其机制的实验研究

目的探讨凝血酶(Thrombin,TM)脑内注射对周围组织Caspase-3蛋白表达和细胞凋亡的影响。方法TM、TM 组织蛋白酶G(Cathepsin G,CATG)、TM Caspase-3抑制剂(DEVD-fmk)脑内立体定向注射制作动物模型,应用Western-blot技术检测Caspase-3蛋白表达,TUNEL法检测细胞凋亡。结果TM脑内注射后6hCaspase-3蛋白开始增加,与对照组比较差异具有显著性(P<0.01),注射后24h达高峰(P<0.01),然后逐渐下降,96h时恢复至正常水平;TM脑内注射后24h凋亡细胞数目开始增加,与对照组比较差异具有显著性(P<0.05),48h达高峰(P<0.01),然后逐渐下降。TM DEVD-fmk脑内注射后凋亡细胞数目与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。TM CATG脑内注射后Caspase-3蛋白表达和凋亡细胞数目与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。结论TM通过蛋白酶激活受体-1(protease activated receptor-1,PAR-1)激活Caspase-3,诱导细胞凋亡。     

凝血酶大鼠脑内注射ICAM-1mRNA表达和MPO活性的影响

目的探讨大鼠脑内注射凝血酶(Thrombin,TM)对细胞间粘附分子-1(Intracellular adhensionmolecule-1,ICAM-1)mRNA表达及白细胞浸润的影响及其可能机制。方法TM、TM 组织蛋白酶G(Ca-thepsin G,CATG)脑内立体定向注射于SD大鼠尾状核,在不同的时间点处死动物,RT-PCR技术检测ICAM-1mRNA表达,通过测定髓过氧化物酶(MPO)活性来检测中性粒细胞的浸润情况。结果凝血酶脑内注射后24h ICAM-1mRNA表达开始增加(P<0.05),48h达高峰(P<0.01),然后逐渐下降。MPO活性动态变化趋势与ICAM-1mRNA相似。CATG组ICAM-1mRNA及MPO活性与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。结论TM通过蛋白酶激活受体-1(protease activated receptor-1,PAR-1)诱导ICAM-1mRNA,促进白细胞浸润。     

凝血酶大鼠脑内注射对核因子-κB活性及细胞间黏附因子-1 mRNA表达的影响

目的 探讨凝血酶（TM）大鼠脑内注射对核因子-κB（NF-κB）活性、细胞间黏附分子．1（ICAM．1）tuRNA表达及白细胞浸润的影响及其可能机制。方法TM、TM＋组织蛋白酶G（CATG）、TM＋N．乙酰半胱氨酸fNAC）脑内立体定向注射制作动物模型，在不同的时间点处死动物，应用EMSA技术检测NF-κB活性，RT—PCR技术检测ICAM-1 mRNA表达．测定髓过氧化物酶（MPO）活性来检测中性粒白细胞的浸润情况。结果TM脑内注射后6hNF-κB活性开始增加（P〈0．05），24h时达高峰（P〈0．01），然后逐渐下降。TM脑内注射后24h ICAM-1 mRNA表达开始增加（P〈0．01），48h达高峰（P〈0．01），然后逐渐下降。MPO活性动态变化趋势与ICAM-1 mRNA相似。TM＋NAC组ICAM-1 mRNA及MPO活性与对照组比较差异均无显著性（P〉0．05）。TM＋CATG组NF-κB活性、ICAM-1 mRNA表达及MPO活性与对照组比较差异均无显著性（P〉0．05）。结论 TM通过蛋白酶激活受体-1（PAR-1）激活NF-κB，诱导ICAM-1 mRNA表达．促进白细胞浸润。     

局部亚低温对大鼠脑出血后基质金属蛋白酶-9及血脑屏障通透性的影响

目的探讨局部亚低温对大鼠自体血注入法脑出血模型基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)mRNA及蛋白表达的影响以及局部亚低温减轻脑出血后水肿的可能机制。方法雄性Wistar大鼠240只,随机分为脑出血(ICH)组和脑出血加局部亚低温(ICH H)组。每组分为对照、脑出血后6h、24h、72h、5d、7d共6个亚组,ICH H组于注血后立即给以4h的局部亚低温治疗,各亚组分别进行血脑屏障(BBB)通透性、脑水含量的检测以及应用RT-PCR及Western印记对MMP-9进行测定。结果ICH组大鼠脑内注血后6h开始出现脑组织水含量(P<0.01)及BBB通透性(P<0.05)的显著增加,二者在72h达到高峰,然后逐渐消退,ICH组MMP-9蛋白表达量与脑含水量和血脑屏障通透性呈正相关(r=0.88和r=0.96),ICH组MMP-9 mRNA表达量也与脑含水量和血脑屏障通透性呈正相关(r=0.78和r=0.85)。ICH H组大鼠脑组织水含量、BBB通透性以及MMP-9蛋白的表达与ICH组各时间点相比较,明显降低,而MMP-9 mRNA的表达与ICH组相比仅有轻度下降。结论脑出血后MMP-9的变化与BBB通透性和脑水肿密切相关,局部亚低温可以抑制脑出血后MMP-9蛋白表达的增加以及脑水肿的形成。提示局部亚低温可能通过影响MMP-9的变化来抑制脑出血后的水肿形成。     

局部亚低温对大鼠脑出血后血红素氧合酶1表达的影响

目的观察局部亚低温对大鼠自体血注入法脑出血模型血红素氧合酶(HO-1)表达的影响,探讨局部亚低温减轻脑出血后脑水肿的可能机制。方法雄性Wistar大鼠120只,随机分为脑出血(control)组和脑出血加局部亚低温(LMH)组。每组分为对照和脑出血后6h、24h、72h,5d、7d共6个亚组,亚低温组于注血后给予4h的局部亚低温治疗,应用Evans-blue测定血脑屏障(BBB)通透性,应用干湿重法测定脑水含量以及应用免疫组化对血肿周围脑组织HO-1的表达进行测定。结果对照组大鼠脑组织含水量、BBB通透性以及HO-1表达的增加始于脑出血后6h均至72h达高峰。HO-1表达的变化与脑血肿周围组织水含量的变化成呈正相关(r=0.79)。LMH组的脑组织水含量、BBB通透性和HO-1各时间点与对照组相比明显下降。结论脑出血后红细胞的破坏可以导致HO-1表达上升。局部亚低温可抑制脑出血后HO-1表达,减轻血脑屏障完整性的破坏,减轻脑出血后脑水肿形成。     

局部亚低温对脑出血后水肿影响的实验研究

目的探讨局部亚低温对大鼠脑出血后水肿形成的影响及其可能机制。方法雄性Wistar大鼠230只随机分为:对照组;脑出血组;脑出血加局部亚低温组;凝血酶加局部亚低温组。应用Evans-Blue测定血脑屏障(BBB)通透性,应用干湿重法测定脑水含量。结果与对照组相比,大鼠注血后6h开始出现脑组织水含量和BBB通透性的增加,在72h达到高峰,然后逐渐消退。不同时程局部亚低温均可以显著降低脑出血后72h时脑组织水含量及BBB通透性(P<0.01),其中给以4h局部亚低温时,降低最明显。注射凝血酶6h后,脑组织水含量及BBB通透性显著增高(P<0.01),于24~48h达高峰,然后逐渐下降。凝血酶 局部亚低温组在各个时间点与凝血酶组相比,脑组织水含量及BBB通透性明显降低(P<0.01)。结论局部亚低温可能是通过抑制凝血酶的毒性作用来减轻脑出血后水肿的形成及血脑屏障的破坏。     

脑损伤脑微血管5-羟色胺含量变化对血脑屏障通透性的影响

目的探讨脑损伤脑微血管5-羟色胺(5-HT)含量变化对血脑屏障通透性(BBB)的影响.方法采用高效液相色谱-电化学检测器,检测鼠脑微血管5-HT的含量.结果脑损伤后0.5h脑微血管中5-HT含量明显增加,至伤后6h仍明显高于对照组,相差非常显著(P<0.01);脑组织含水量亦明显增高,BBB通透性增高.结论脑损伤早期脑微血管中5-HT含量明显增高,是导致BBB损害及脑水肿发生的重要因素之一.     

H-7在脑出血后脑损伤中作用机制的研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂异喹啉磺酰类(H-7)在脑出血后脑损伤中的作用机制。方法SD雄性大鼠随机分为对照组、假手术组、脑出血组、H-7治疗组,采用自体血注入法建立大鼠脑出血模型,治疗组应用H-7每12 h腹腔注射一次。分别用伊文思蓝(EB)测血脑屏障(BBB)通透性,干-湿重法测脑组织含水量,同时进行组织病理学观察。结果H-7治疗组可以明显改善大鼠脑出血后BBB通透性(P<0.05),血肿周围脑水肿明显减轻(P<0.05),并且减少脑出血后血肿周围炎症细胞浸润。结论H-7通过抑制PKC,减轻脑出血后脑水肿?血脑屏障的开放和炎症细胞浸润,揭示PKC参与了脑出血后脑损伤。     

内皮屏障抗原在实验性大鼠脑出血后的表达及其与血脑屏障通透性改变的关系

目的 探讨内皮屏障抗原(EBA)在脑出血(ICH)后血肿周围脑组织中的表达及其在ICH后血脑屏障(BBB)通透性改变中的作用.方法 利用立体定向技术向大鼠尾状核内注入50μl自体股动脉血建立ICH模型,用免疫组化法检测ICH后血肿周围EBA、纤维蛋白原的蛋白表达、Belayev法测定BBB通透性及干湿重法测定脑水含量的动态变化.结果 ICH后6hEBA表达开始减少,3d时最少,7d略有回升;纤维蛋白原表达、BBB通透性、脑水含量均于ICH后6h开始升高,3d达高峰,7d逐渐下降,ICH后EBA蛋白表达与脑水含量呈负相关(r=-0.840,P＜0.01),与EB含量负相关(r=-0.827,P ＜0.01),与纤维蛋白原表达呈负相关(r=-0.851,P＜0.01).结论 大鼠实验性ICH后EBA的表达减少,且与纤维蛋白原、BBB通透性及脑水含量增高具有明显的相关性.     

尼膜同对大鼠脑出血后血脑屏障通透性及水通道蛋白4mRNA表达的影响

目的研究大鼠脑出血后血脑屏障(BBB)通透性与水通道蛋白4(AQP4)的关系及尼膜同的干预作用。方法采用自体动脉血注入尾状核法制成大鼠脑出血模型,RT-PCR法观察AQP4mRNA的表达,伊文思兰法测量BBB通透性,干湿重法计算脑含水量表示脑水肿。结果与对照组相比,脑出血组及尼膜同组BBB通透性均在出血后6h开始升高(0.5955±0.0956、0.5092±0.0309),1d~3d最高(0.8889±0.0968、0.7826±0.0339和0.7914±0.0520、0.7442±0.0753),尼膜同组低于脑出血组(P<0.05);两组AQP4mRNA表达也于6h即开始升高(1.06±0.12、0.90±0.15),3d时达到高峰(1.34±0.14对1.27±0.14),尼膜同组低于脑出血组(P<0.05);BBB通透性与AQP4mRNA表达呈显著正相关(r=0.686,P<0.01),与脑水肿变化趋势一致。结论脑出血后可能通过上调APQ4mRNA表达,增加BBB通透性,参与脑水肿形成,尼膜同可抑制此过程。     

脑出血后脑水肿经时变化机制的探讨

目的 研究脑出血(mtracerebral hemorrhage，ICH)后血肿周围脑水肿与血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)随时间变化的机制，从而为预防脑水肿提供依据。方法90只大耳白兔随机分为3组。1组：在立体定向仪下将300μl生理盐水注入兔左侧基底节；2组：注入200μl自身动脉血与100μl生理盐水；3组：注入200μl自身动脉血与100μl水蛭素。每组每时相(6h、12h、24h、48h、72h)各6只兔。脑组织含水量采用干湿重法测量，血脑屏障的通透性测定采用伊文思兰法。结果动脉血组及水蛭素干预组血肿周围脑组织含水量均在48h达到高峰．此后逐步降低。动脉血组伊文思兰(EB)于24h到达高峰，水蛭素干预组伊文思兰(EB)于48h达高峰。结论脑出血后脑水肿是多种因素综合作用的结果。早期可能和血块凝缩、流体静力压有关；至中期时凝血酶是主导因素；后期则主要由于红细胞裂解物的损害。     

血红蛋白和血红素氧合酶抑制剂在脑出血迟发性脑水肿中的作用

目的 研究血红蛋白(Hb)与脑出血迟发性脑水肿的关系,锌原卟啉(ZnPP)在脑出血迟发性脑水肿中的作用,为治疗脑出血迟发性脑水肿提供新的方法.方法 将大鼠分为生理盐水组、血红蛋白组和ZnPP组,向大鼠的尾状核分别注入生理盐水(NS组)和自体Hb溶液(Hb组和ZnPP组),并向ZnPP组大鼠腹腔内注射ZnPP,观察各组血脑屏障(BBB)通透性的变化、Hb的分解情况、脑水肿的程度和脑组织病理表现.结果 与Hb组大鼠相比,ZnPP组大鼠BBB通透性降低、Hb的分解产物减少和脑含水量降低(P<0.05).结论 Hb可以引起脑水肿,ZnPP对脑出血迟发性脑水肿有治疗作用.     

凝血酶对大鼠脑出血血肿周围组织的毒性损伤研究

目的 :研究脑出血血液凝固过程中产生凝血酶的神经毒性作用。方法 :90只大鼠分成 :对照组、脑出血组、脑出血水蛭素干预组、凝血酶组和凝血酶 +水蛭素干预组。术后 48h观察大鼠神经功能缺损评分 (NDS) ,检测血肿周边组织髓过氧化物酶 (MPO)的活性、脑水肿含量及TUNEL阳性细胞数量。结果 :局部注入重组水蛭素显著减轻了脑出血大鼠神经功能缺损 ,降低局部MPO活性、减少脑水分含量及TUNEL阳性细胞数量 ;脑内直接注入凝血酶后局部脑水分含量升高 ,MPO活性升高 ,并可检测到大量TUNEL阳性细胞。结论 :凝血酶与脑出血后的脑水肿、白细胞浸润和神经细胞DNA损伤有关     

经腹腔应用阿加曲班对脑出血后凝血酶神经毒性的抑制作用

目的:探讨经腹腔应用阿加曲班治疗脑出血（ICH）后凝血酶神经毒性损伤的可能性。方法:①研究阿加曲班对ICH及凝血酶注入后脑水肿、细胞损伤的影响。Wistar大鼠60只,随机分为假手术对照组（只进针不注血）;ICH组（50μL自体尾血注入右尾状核）;ICH+阿加曲班干预组(50μL自体尾血注入大鼠右侧尾状核,分别于术后3和12h经腹腔给予阿加曲班0.9mg·kg^-1,总量0.6mL);凝血酶组(10U·2μL^-1凝血酶注入大鼠右侧尾状核);凝血酶+阿加曲班干预组(10U·2μL^-1凝血酶注入大鼠右侧尾状核,分别于术后3和12h经腹腔给予阿加曲班0.9mg·kg^-1,总量为0.6mL)。各组均n=12,术后24h处死各组大鼠,每组中6只用于检测脑组织水含量,6只检测caspase-3免疫反应细胞及TUNEL阳性细胞数。②经腹腔注射阿加曲班对血肿容积的影响:建立胶原酶ICH大鼠模型组:注入Ⅰ型胶原酶+肝素;阿加曲班组:胶原酶ICH模型成功后3及12h分别经腹腔注入阿加曲班溶液0.9mg·kg^-1,每次注入液体量为0.6mL,测定两组大鼠脑组织血肿血红蛋白的含量(测定血红蛋白A₅₅₀值)以评价阿加曲班对血肿容量的影响。结果:自体血ICH及凝血酶模型大鼠在阿加曲班干预后,ICH组及凝血酶组的TUNEL阳性细胞数、caspase-3阳性细胞数明显下降（P<0.01或P<0.05）,脑组织水肿含量百分比明显降低（P<0.05）。胶原酶ICH血红蛋白A值为（0.45±0.12）,阿加曲班干预组为（0.46±0.09）,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:ICH后3～12h经腹腔注入阿加曲班可减轻ICH后的脑水肿及细胞凋亡性损伤,且没有血肿增大的不良反应。