PI3K抑制剂TGX-221对人骨肉瘤细胞增殖、周期及凋亡的影响

目的探究PI3K抑制剂TGX-221对人骨肉瘤细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法培养人骨肉瘤U2OS和MG-63细胞株,分为对照组和实验组,实验组加入10μmol/L的TGX-221,对照组加入相同剂量的DMSO。处理48 h后,CCK8法检测TGX-221对人骨肉瘤细胞活力及增殖的影响;流式细胞术检测TGX-221对人骨肉瘤U2OS和MG-63细胞的细胞周期及凋亡的作用。结果CCK8检测结果显示,TGX-221对人骨肉瘤细胞有显著的增殖抑制作用,且具有时间和浓度依赖性;流式细胞术结果显示,TGX-221将U2OS和MG-63细胞周期阻滞在G1期,并诱导人骨肉瘤细胞凋亡,具有显著的抗肿瘤作用。结论PI3K抑制剂TGX-221能够抑制人骨肉瘤细胞的增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,可能成为一种潜在的抗肿瘤药物。     

腺病毒介导反义c-myc联合咖啡因在骨肉瘤化疗中增效作用的实验研究

目的： 构建重组反义c-myc腺病毒并探讨其与咖啡因对人骨肉瘤MG-63细胞顺铂化疗的影响。方法: 应用基因重组技术，将约750 bp的人c-myc cDNA反向克隆到腺病毒载体，构建表达反义c-myc的重组腺病毒（Ad-Asc-myc），与咖啡因、顺铂单独或联合体外作用于人骨肉瘤MG-63细胞，采用蛋白免疫印迹（Western blotting）、MTT、流式细胞仪（FCM）、透射电镜等检测c-Myc蛋白、bcl-2、bax、E₂F-1等基因表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期，分析Ad-Asc-Myc、咖啡因对人骨肉瘤MG-63细胞顺铂化疗的影响。结果: 成功构建Ad-Asc-myc，滴度可达2×10¹²pfu/L，体外转染MG-63细胞48 h后，可降低c-Myc蛋白表达，并抑制其体外增殖；Ad-Asc-myc、2.0 mol/L咖啡因分别与浓度为2.0、5.0 mg/L顺铂共同作用后 ，可增加顺铂对MG-63细胞的体外增殖抑制率；Ad-Asc-myc联合2.0 mol/L咖啡因能明显加强顺铂的体外抗肿瘤作用，凋亡相关基因bcl-2基因表达下降，bax表达上升，而E2F-1表达无明显变化；FCM检测显示Ad-Asc-myc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡，并增加顺铂诱导瘤细胞凋亡作用；单独咖啡因不能诱导瘤细胞凋亡，但能增加顺铂诱导瘤细胞凋亡作用；Ad-Asc-myc联合2.0 mol/L咖啡因能明显加强顺铂诱导瘤细胞凋亡作用。细胞周期分析显示顺铂作用后瘤细胞出现S期阻滞，而咖啡因则能逆转这种阻滞；Ad-Asc-myc转染的骨肉瘤细胞出现G₂/M期阻滞。结论: 腺病毒介导反义c-myc联合咖啡因能明显增强顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞的诱导凋亡及化疗作用。     

下调宫颈癌细胞FAM111B表达对增殖、周期和凋亡的影响

目的观察下调FAM111B对宫颈癌细胞系C-33A和HeLa增殖、细胞周期和凋亡的影响及其可能机制。方法应用慢病毒载体siRNA-FAM111B及Null,分别感染C-33A和HeLa细胞。实时定量PCR方法(qRTPCR)和Western blot方法分别检查各组细胞FAM111B基因与蛋白的表达。应用CCK-8方法检测FAM111B对细胞增殖能力的影响。流式细胞术PI染色细胞周期检测各组细胞周期变化。流式细胞术Annexin V/PI双染方法检测各组细胞的凋亡情况。Western blot法检测p53及下游Bax和Bcl-2的表达。结果成功转染C-33A和HeLa细胞,FAM111B基因与蛋白表达水平均下调。转染siR-FAM111B能抑制宫颈癌细胞的增殖,C-33A和HeLa细胞发生G1期阻滞。下调FAM111B诱导宫颈癌细胞凋亡,促进p53蛋白表达,进而上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的表达。结论下调FAM111B抑制宫颈癌细胞的增殖,促使细胞周期G1期阻滞,诱导细胞凋亡,与调节p53蛋白进而激活下游相关信号通路相关。     

沉默Cat D对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及相关信号通路

研究组织蛋白酶D(cathepsin D,Cat D)在骨肉瘤细胞中的表达，并通过shRNA技术沉默Cat D,探讨该分子对骨肉瘤细胞MG63和U2OS增殖、凋亡及侵袭的作用和机制。构建sh-Cat D质粒及阴性对照质粒sh-NC并转染至骨肉瘤细胞MG63和U2OS中，RT-PCR和Western blotting检测Cat D在骨肉瘤细胞中的表达；CCK-8法、克隆形成实验和EdU荧光染色实验检测骨肉瘤细胞的增殖活性；Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力；FACS检测肿瘤细胞的凋亡情况；Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达及Akt/mTOR信号通路相关蛋白(Akt和mTOR)的磷酸化水平。结果显示，相较健康人成骨细胞hFOB,Cat D在骨肉瘤细胞中的表达显著升高，尤其是MG63和U2OS细胞中Cat D的高表达均显著(均P<0.001)。与sh-NC组相比，Cat D沉默显著抑制MG63和U2OS细胞的增殖和侵袭(均P<0.001)。与sh-NC组相比，Cat D沉默通过上调Bax表达和下调Bcl-2表达促进肿瘤细胞的...     

CISD2基因沉默通过AKT通路抑制人骨肉瘤细胞U2OS的增殖

目的检测CDGSH铁硫结构域2 (CDGSH iron sulfur domain 2, CISD2)基因对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。方法应用化学合成小干扰RNA技术沉默人骨肉瘤细胞系U2OS中CISD2基因的表达,分别通过免疫荧光染色与Western blot实验检测基因沉默效率;通过MTT实验与克隆形成实验,研究沉默CISD2基因对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期;Western blot实验检测AKT,p-AKT蛋白的表达。结果设计的siRNA抑制人类骨肉瘤细胞系U2OS细胞CISD2基因表达。沉默CISD2基因抑制U2OS细胞的增殖能力与克隆形成能力;流式细胞术实验结果表明沉默CISD2可以诱导U2OS细胞G_0/G_1期抑制;Western blot实验显示沉默CISD2可以抑制p-AKT蛋白的表达。结论沉默CISD2基因抑制骨肉瘤细胞系U2OS的增殖能力与抑制AKT信号传导通路相关。     

外源性EGR1瞬时表达对骨肉瘤细胞细胞周期和凋亡的影响

目的: 获得人早期生长反应1(EGR1)基因,并在人骨肉瘤细胞中瞬时表达,研究该基因在人骨肉瘤细胞中的作用,并探讨其可能的作用机制。方法: 以人胎盘组织为模板,巢式PCR(nest PCR)扩增获得EGR1全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),酶切、PCR鉴定并测序正确后,命名为pcDNA-EGR1。脂质体法将重组载体转染人骨肉瘤细胞U2OS,实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫印迹检测目的基因的表达; MTT法检测细胞生长和增殖情况;流式细胞仪和DAPI染色检测细胞的周期变化和凋亡情况;qPCR检测细胞中与细胞周期、凋亡相关基因的表达变化情况;短发夹RNA(shRNA)干扰EGR1后,检测细胞的变化情况。结果: 成功获得了人EGR1基因并构建了其重组表达载体pcDNA-EGR1。EGR1可有效地在U2OS中瞬时表达;可显著抑制细胞增殖(P<0.05),并呈一定的剂量依赖。EGR1可引起细胞周期停滞于G₀/G₁期,并促进凋亡率增加(P<0.05)。EGR1可引起细胞核出现明显的固缩和凋亡表型。EGR1可引起周期相关基因表达下调,凋亡相关基因表达则显著上调。shRNA干扰EGR1后,细胞凋亡表型和EGR1所调控的相关基因表达水平与对照组一致。结论: EGR1具有抑制骨肉瘤细胞增殖作用,能调节骨肉瘤细胞周期和凋亡相关基因的表达,从而促进细胞周期停滞和凋亡率的增加。     

下调LRH1 对骨肉瘤细胞生长和Wnt/β-catenin 信号通路的影响

目的：探讨下调肝受体类似物1(LRH1)对骨肉瘤U2OS细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法：采用RT-qPCR和Western blot分别检测人骨肉瘤细胞U2OS和成骨细胞hFOB1.19中LRH1 mRNA和蛋白表达差异;将体外培养的U2OS细胞分为对照组（Ctrl）、阴性对照（NC）-siRNA组和LRH1-siRNA组,RT-qPCR检测各组U2OS细胞中LRH1 mRNA表达,MTT、流式细胞术、Transwell小室和划痕实验分别检测各组U2OS细胞增殖活力、细胞周期分布情况、穿膜细胞数和划痕愈合率,Western blot检测各组U2OS细胞中LRH1和Wnt/β连环蛋白（β-catenin）信号通路相关蛋白β-catenin、细胞周期素D1(CyclinD1)、c-Myc、基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达。结果：与hFOB1.19细胞相比,U2OS细胞中LRH1 mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）;与NC-siRNA组相比,LRH1-siRNA组U2OS细胞中LRH1 mRNA表达、细胞增殖活力、S期细胞占比、穿膜细胞数、划痕愈合率和LRH1、β-...     

双氢青蒿素对人胰腺癌细胞系增殖和凋亡的影响

目的探讨双氢青蒿素对人胰腺癌细胞(PANC-1)增殖活性及凋亡的影响,及其作用机制。方法30、60、120、240和480μmol/L双氢青蒿素作用PANC-1 48 h后,采用MTT法检测双氢青蒿素对PANC-1增殖活性的影响,流式细胞术检测其细胞周期和凋亡的变化,Western blotting检测细胞内周期相关蛋白cyclin B1、Cdk1、p21及凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3,Caspase-9和细胞色素C(Cyto C)蛋白表达变化。结果 MTT实验结果表明,30~480μmol/L双氢青蒿素对PANC-1增殖活性具有明显的抑制作用(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,双氢青蒿素可以使PANC-1细胞周期阻滞于G2/M期,并诱发PANC-1细胞发生凋亡,且随药物浓度呈现升高趋势(P<0.05)。Western blotting结果显示,双氢青蒿素作用后周期相关蛋白Cdk1和Cyclin B1蛋白表达降低,而P21蛋白表达升高。凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高,cleaved Caspase-3,cleaved Caspase-9和Cyto C蛋白表达升高。结论双氢青蒿素能抑制PANC-1增殖并诱发细胞凋亡,其凋亡机制可能与线粒体途径相关。     

HIV-1 Vpr蛋白对C8166细胞毒性研究

目的 利用腺病毒系统研究HIV-1 Vpr蛋白在T细胞来源的C8166细胞内的高表达以及细胞内该蛋白对T细胞毒性.方法 将表达目的 蛋白Vpr的重组腺病毒rAd-vpr和空白载体病毒rAd-vector分别感染对数生长期的C8166细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布、凋亡和坏死.用Hoechst-PI荧光染色观察细胞的凋亡和坏死,JC-1荧光染色测定线粒体膜电势.结果 Annexin V-PI染色及Hoechst-PI染色一致显示HIV-1 Vpr能显著诱导C8166细胞凋亡和坏死;PI细胞周期结果表明HIV-1 Vpr能阻滞C8166细胞于G2期;JC-1荧光染色法测定HIV-1 Vpr致C8166线粒体膜电势下降.结论 细胞内HIV-1 Vpr介导的T细胞毒性包括线粒体功能障碍、细胞周期的G2期阻滞和细胞的死亡.     

莪术醇抑制人骨肉瘤细胞系的增殖和促凋亡

目的 探究莪术醇对人骨肉瘤细胞系MG-63和U2OS体外增殖、凋亡的影响和作用机制。方法 将MG-63细胞和U2OS细胞分为对照组、莪术醇20、40、80和160μmol/L干预组;MTT法检测MG-63、U2OS细胞增殖;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭;流式细胞测量细胞凋亡;RT-qPCR和Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、caspase和β-catenin的mRNA和蛋白表达。结果 莪术醇呈浓度依赖性地抑制MG-63和U2OS细胞增殖,IC₅₀值分别为128.03μmol/L、117.95μmol/L。与对照组相比,莪术醇显著抑制MG-63、U2OS细胞的体外迁移和侵袭(P<0.05),并诱导细胞凋亡(P<0.05)。与对照组相比,莪术醇组促进Bax、caspase 3表达,抑制Bcl2表达(P<0.05),MG-63、U2OS细胞内β-catenin的mRNA表达水平和蛋白表达均被显著抑制(P<0.05)。结论 莪术醇显著抑制人骨肉瘤细胞系MG-63、U2OS增殖,诱导细胞凋亡。     

rAAV2/1-Acrp30病毒的纯化、扩增与活性检测

目的 将大鼠脂联素基因(Acrp30)克隆到腺相关病毒(AAV)载体中,经包装、纯化、扩增后获得rAAV2/1-Aerp30病毒,并进行活性检测.方法 筛选阳性克隆获得pSNAV2.0-Acrp30,EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切鉴定,并行测序.转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株.HSV1-re/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体rAAV2/1-Acrp30.行DNA斑点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度,Western blot法检测目的 蛋白脂联素在HEK293细胞中的表达活性.结果 PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV2.0-Acrp30重组成功,基因测序显示装入pSNAV2.0质粒中的Acrp30基因正确.rAAV2/1-Acrp30病毒的大致滴度为1.0×1012μg/ml,HEK293细胞分泌蛋白浓度为50 ng/ml,病毒载体纯度在95%以上.结论 实验获得的脂联素病毒载体滴度高、感染性好,可试用于GK(Goto-Kakizaki)大鼠脂联素转基因治疗.     

腺相关病毒介导胰岛素样生长因子I对高糖诱导神经元凋亡的保护作用

目的研究重组腺相关病毒（AAV）载体介导胰岛素样生长因子I（IGFI）在体外神经元表达的情况,及其对高糖诱导神经元凋亡的保护作用。方法利用分子克隆技术将大鼠IGFI基因克隆到pSNAV2．0质粒上,构建包含重组质粒pSNAV2．0-IGFI的杂合型重组AAV载体rAAV2／1-IGFI。将人神经母细胞瘤SH—SY5Y细胞分为正常组（A组）、无血清组（B组）、无血清高糖组（C组）,无血清高糖＋rAAV2／1-IGFI组（D组）,其中A组不做任何处理;B组使用无血清培养基培养;C组用含100mmol／LD．葡萄糖的无血清培养基培养;D组则先用rAAV2／1-IGFI病毒载体感染后再用含100mmol／LD．葡萄糖的无血清培养基处理。干预24h后应用RT—PCR和Western免疫印迹检测各组IGFI基因和蛋白的表达情况;应用Hoechst 33342荧光染色法、AnnexinV—FITC／PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡。观察rAAV2／1-IGFI感染后对高糖诱导SH—SY5Y细胞凋亡的保护作用。结果成功构建rAAV2／1-IGFI重组AAV载体。感染SH-SY5Y细胞后,RT—PCR显示SHSY5Y能表达大鼠IGFI基因;Western免疫印迹检测发现D组IGFI蛋白的表达水平（0．44±0．04）显著高于其他3组（A组0．29±0．02,B组0．17±0．02,C组0．08±0．02,均P〈0．05）。rAAV2／1-IGFI能明显降低高糖诱导细胞凋亡的凋亡率：Hoechst33342荧光染色检测总凋亡率分别为A组（2．71±1．03）％,B组（9．17±1．72）％,C组（25．63±1．81）％,D组（14．50±2．27）％,各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）;流式细胞仪分析结果表明Annexin V-FITC^＊／PI^-的早期凋亡细胞加上Annexin V—FITC^＊／PI^＊的晚期凋亡细胞的总细胞凋亡率A组为（5．01±1．17）％,B组为（9．87±1．38）％,C组为（27．56±2．25）％,D组为（17．34±2．08）％,各组间差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论rAAV2／1-IGFI感染体外神经元SH—SY5Y细胞能     

Pim-1基因重组腺相关病毒2载体的构建及感染大鼠视网膜

目的构建携带大鼠原癌基因Pim-1的重组腺相关病毒2载体(rAAV2-Pim-1),检测其体内感染大鼠视网膜的细胞类型及目的基因Pim-1在视网膜中的表达。方法 p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物用Nhel酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收载体及目的基因DNA并连接转化,鉴定质粒阳性克隆及测序。rAAV2-Pim-1表达质粒p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG及包装质粒p AAV-RC和辅助质粒p Helper,通过Lipofectamine 2000共转染293细胞,纯化获得高滴度的rAAV2-Pim-1。大鼠玻璃体注射rAAV2-Pim-1,用免疫荧光组织化学检测其感染视网膜的细胞类型;用Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在视网膜中的表达。结果rAAV2-Pim-1质粒构建成功并且核苷酸序列比对正确;质粒转染293细胞后出现绿色荧光;包装出的病毒浓缩滴度为5.7×1015vg/L。rAAV2-Pim-1组体内感染视网膜神经节细胞(RGCs)达71%,并感染少量无长突细胞,几乎不感染星形胶质细胞;Pim-1 mRNA和蛋白在视网膜中的表达约为rAAV2-EGFP组的6.61倍和2.29倍。结论成功构建rAAV2-Pim-1病毒载体,并在感染后的大鼠视网膜RGCs中过表达Pim-1。     

腺相关病毒介导胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖诱导神经元凋亡的保护作用

目的 研究重组腺相关病毒(AAV)载体介导胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF Ⅰ)在体外神经元表达的情况,及其对高糖诱导神经元凋亡的保护作用.方法 利用分子克隆技术将大鼠IGF Ⅰ基因克隆到pSNAV2.0质粒上,构建包含重组质粒pSNAV2.0-IGF Ⅰ的杂合型重组AAV载体rAAV2/1-IGF Ⅰ.将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为正常组(A组)、无血清组(B组)、无血清高糖组(C组),无血清高糖+rAAV2/1-IGF Ⅰ组(D组),其中A组不做任何处理;B组使用无血清培养基培养;C组用含100mmol/L D-葡萄糖的无血清培养基培养;D组则先用rAAV2/1-IGF Ⅰ病毒载体感染后再用含100 mmol/LD-葡萄糖的无血清培养基处理.干预24 h后应用RT-PCR和Western免疫印迹检测各组IGF Ⅰ基因和蛋白的表达情况;应用Hoechst33342荧光染色法、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡.观察rAAV2/1-IGF Ⅰ感染后对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用.结果 成功构建rAAV2/1-IGF Ⅰ重组AAV载体.感染SH-SY5Y细胞后,RT-PCR显示SH-SY5Y能表达大鼠IGF Ⅰ基因;Western免疫印迹检测发现D组IGF Ⅰ蛋白的表达水平(0.44±0.04)显著高于其他3组(A组0.29±0.02,B组0.17+0.02,C组0.08±0.02,均P<0.05).rAAV2/1-IGF Ⅰ能明显降低高糖诱导细胞捌亡的凋亡率:Hoechst33342荧光染色检测总凋亡率分别为A组(2.71±1.03)%,B组(9.17±1.72)%,C组(25.63±1.81)%,D组(14.50±2.27)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪分析结果表明AnnexinV-FITC~+/PI~+的早期凋亡细胞加上AnnexinV-FITC~+/PI~+的晚期凋亡细胞的总细胞凋亡率A组为(5.01±1.17)%,B组为(9.87±1.38)%,C组为(27.56±2.25)%,D组为(17.34±2.08)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 rAAV2/1-IGF Ⅰ感染体外神经元SH-SY5Y细胞能显著表达IGF Ⅰ蛋白,并有效地降低高糖对神经元的诱导凋亡作用.     

腺病毒伴随病毒载体介导的Ⅰ型单纯疱前病毒胸苷 …

目的 研究腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）载体介导杀肿瘤瘤基因的转移及其在肿瘤治疗方面的应用。方法 应用作者构建的腺病毒伴随病毒载体，克隆Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶＩ－ＴＫ）基因，构建质粒ｐＡＣＴＫ－１９。用ｐＡＣＴＫ－１９转染５型腺病毒（Ａｄ５）感染的重组ＡＡＶ包装细胞系ＡＥ１２０１，获得重组病毒ｒＡＡＶ／ＡＣＴＫ。再用此重组病毒感染肺癌细胞系Ａ５４９，并联合现氧鸟苷（ＧＣＶ）作用，研究其体外对肺     

rAAV2-EM>hGAD/EM>65重组载体的构建和功能检测

目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能。方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65)。包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度。体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ氨基丁酸(GABA)的含量。在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量。结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10¹¹/ml。组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L。STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g。结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体。AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能。在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量。     

通用型腺病毒伴随病毒载体的构建

目的构建含腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）基因组两端的反向重复序列（ＩＴＲｓ）和表达必须元件如启动子、多克隆位点和ＰｏｌｙＡ信号的通用型载体质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ，并获得重组ＡＡＶ（ｒＶＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ）。方法通过ＤＮＡ重组技术，将ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ、Ｎｅｏ基因、ＣＭＶ－ＩＥ启动子和多克隆位点组成表达盒子，取代含ＡＡＶ全基因组质粒ｐＳＳＶ９中ＡＡＶ结构基因部分，构建成质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ。用ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染５型腺病毒（Ａｄ５）感染的重组ＡＡＶ包装细胞系ＡＥ１２０１，能获得重组病毒ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ。提取ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ感染细胞的染色体，用Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析重组病毒基因组在感染细胞中的存在情况。结果质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染包装细胞系后所得ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ滴度为４．２×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，并且ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ能在转导细胞内实现其基因组与细胞染色体的整合。结论成功地构建了通用型ＡＡＶ载体，为今后的ＡＡＶ载体研究、基因治疗和临床应用打下了基础     

Optimization of recombinant adeno-associated virus production using an herpes simplex virus amplicon system.

A major limitation of adeno-associated virus (AAV) based vectors for clinical applications to date is the production of high-titer recombinant AAV vector stocks. Despite recent improvements, the amount of recombinant adeno-associated virus vectors (rAAV) particles produced per cell continues to be significantly lower than that of wild-type AAV. In this study, an HSV-based system for rAAV production was used to examine the influence of different parameters including transfection conditions (vector-to-packaging plasmid ratio, amount of total transfected DNA, cell confluency) and multiplicity of infection of herpes helper virus on the resulting titre of rAAV stocks. For herpes helper virus, time-course experiments were carried out to analyse the effect on rAAV yields up to 72 h postinfection and to determine the ideal harvesting time. Taken together, the optimized production scheme consistently yields more than 3x10(3) transducing units per producer cell.     

Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors

Despite increasingly widespread use of recombinant adeno-associated virus (AAV) and lentiviral (LV) vectors for transduction of neurons in a wide range of brain structures and species, the diversity of cell types within a given brain structure is rarely considered. For example, the ability of a vector to transduce neurons within a brain structure is often assumed to indicate that all neuron types within the structure are transduced. We have characterized the transduction of mouse somatosensory cortical neuron types by recombinant AAV pseudotyped with serotype 1 capsid (rAAV2/1) and by recombinant lentivirus pseudotyped with the vesicular stomatitis virus (VSV) glycoprotein. Both vectors used human synapsin (hSyn) promoter driving DsRed-Express. We demonstrate that high titer rAAV2/1-hSyn efficiently transduces both cortical excitatory and inhibitory neuronal populations, but use of lower titers exposes a strong preference for transduction of cortical inhibitory neurons and layer 5 pyramidal neurons. In contrast, we find that VSV-G-LV-hSyn principally labels excitatory cortical neurons at the highest viral titer generated. These findings demonstrate that endogenous tropism of rAAV2/1 and VSV-G-LV can be used to obtain preferential gene expression in mouse somatosensory cortical inhibitory and excitatory neuron populations, respectively.     

Inverted terminal repeat sequences of adeno-associated virus enhance the antibody and CD8(+) responses to a HIV-1 p55Gag/LAMP DNA vaccine chimera

The immune responses to an HIV-1 p55Gag vaccine encoded as a DNA chimera with the lysosomal associated membrane protein-1 (LAMP) have been examined for the effect of the addition of the inverted terminal repeat (ITR) sequences of the adeno-associated virus (AAV) to the DNA plasmid construct, and of packaging the LAMP/gag gene as a recombinant AAV vector (rAAV). DNA plasmids encoding Gag and the LAMP/Gag protein chimera were constructed in two vectors, the pcDNA3.1 and a corresponding plasmid containing the ITR sequences (pITR) flanking the expression elements of the plasmid, and the pITR LAMP/gag DNA plasmid was encapsidated in the rAAV vector. Human 293 cells transfected in vitro with LAMP/gag plasmids either in pcDNA3.1 or pITR produced much Gag protein in cell extracts (1.6 and 2.2 ng of Gag/mg of protein, respectively). The immune responses of mice to immunization with these constructs were examined under three protocols: DNA prime/DNA boost, DNA prime/rAAV boost, and a single rAAV immunization. The results demonstrated that under DNA prime/DNA boost protocol, the "naked" DNA vaccines encoding the LAMP/gag chimera, either as pcDNA3.1 or pITR DNA plasmid constructs, elicited strong CD4(+) T cell responses. In contrast, significantly higher levels of CD8(+) and antibody responses were observed with the pITR-DNA constructs. Immunization with the rAAV vector under the DNA prime/rAAV boost protocol resulted in sustained T cell responses and a markedly increased antibody response, predominantly of the IgG(1) isotype resulting from the activation of the Th2 subset of CD4(+) T cells, that was sustained for at least 5 months after immunization.