B细胞非霍奇金淋巴瘤TCR基因重排及CDR3谱型分析

 目的　分析B细胞淋巴瘤穿刺标本中T细胞受体（TCR）β链克隆性基因重排及互补决定区3（CDR3）谱型。方法　应用RT-PCR扩增TCR Vβ24个亚家族的CDR3区基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物进行测序。结果　3例淋巴瘤患者TCR存在限制性取用,仅表达2～5个Vβ亚家族。所有患者均存在克隆性增生T细胞,增生形式包括寡克隆及寡克隆增生趋势。CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列。结论　B细胞淋巴瘤患者存在T细胞克隆性增生,其TCR Vβ呈限制性取用,不同克隆T细胞的CDR3序列不同。     

乳腺癌患者T细胞受体基因重排及CDR3区序列分析

 目的　分析乳腺癌转移淋巴结穿刺标本中T细胞受体（TCR）β链克隆性基因重排及互补决定区3（CDR3）区序列。方法　应用RT-PCR扩增2例反应性增生淋巴结及3例乳腺癌转移淋巴结T细胞24个TCR Vβ亚家族的CDR3基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物进行测序。结果　乳腺癌转移淋巴结T细胞中TCR存在限制性取用,仅表达3～5个Vβ亚家族。增生的T细胞存在克隆性特点,增生形式包括寡克隆及多克隆。CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列。结论　乳腺癌转移淋巴结中存在T细胞克隆性增生,其TCR Vβ呈限制性取用,不同T细胞克隆的CDR3序列不同。     

乳腺癌淋巴结微转移患者克隆性T细胞TCRα链CDR3谱型分析

目的 分析乳腺癌微转移淋巴结T细胞克隆性增生及TCR α链谱型偏移情况,了解抗肿瘤T细胞克隆的分子特征。方法 利用RT-PCR扩增10例乳腺癌微转移淋巴结T细胞32个TCR可变区（AV）亚家族的基因,基因扫描检测T细胞克隆性及TCR AV亚家族取用情况,对单克隆家族行PCR扩增TCR α链全长序列,构建重组质粒后测序,分析互补决定区（CDR3）序列。结果 乳腺癌淋巴结微转移患者T细胞呈单、寡克隆、寡克隆趋势和多克隆增生,不同患者表达1～4个TCR AV亚家族。克隆性T细胞的CDR3氨基酸序列不同,但是病例4和病例8含有相同的CDR3氨基酸基序：AM和DDKII。结论 乳腺癌TCR AV基因表达具有多样性特点,TCR AV家族的取用可能与乳腺癌肿瘤抗原的多样性和不同个体的免疫应答反应有关。相同CDR3氨基酸基序的发现可能对乳腺癌的T细胞介导免疫治疗提供帮助。     

弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血TCR Vα亚家族T细胞分布和克隆性增生特点

目的 探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBL)患者外周血TCR Vα基因谱系及其克隆性增生情况.方法 用RT-PCR法扩增6例DLBL患者外周血单个核细胞中29个TCRα基因的互补决定区3(CDR3),经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,确定T细胞的克隆性.结果 6例DLBL患者分别表达20～23个TCRVα亚家族.均存在1个或多个Vα亚家族的克隆增生T细胞,增生形式包括寡克隆、寡克隆增生趋势及双克隆.Vα6和Vα23、亚家族出现克隆增生性T细胞的频率较高(66.7%).结论TCRVα亚家族T细胞出现限制性选用和克隆性增生,可能是机体对淋巴瘤相关抗原产生的特异性免疫反应.     

外周T细胞淋巴瘤非特指型TCRβ V/J取用及CDR3谱型分析

目的 分析外周T细胞淋巴瘤非特指型TCR β V/J亚家族限制性取用及CDR3谱型.方法 提取4例外周T细胞淋巴瘤非特指型患者病变淋巴结总RNA后进行反转录,多重聚合酶链反应（PCR）扩增TCRβ全长序列,构建重组质粒并测序,利用网上TCR资源分析序列.结果4例患者共获得9个TCR β链全长序列.克隆性增生T细胞V、J亚家族分别限制性取用BV2、BV4S2、BV14、BV29S1和BJ1S4、BJ2S3、BJ2S5、BJ2S7,并具有不同的CDR3区氨基酸序列.结论外周T细胞淋巴瘤非特指型TCRV β、VJ亚家族具有限制性取用,不同T细胞克隆的CDR3序列不同.     

骨髓间充质干细胞治疗慢性移植物抗宿主病后患者外周血T细胞受体Vβ亚家族谱系变化研究

 目的　研究输注骨髓间充质干细胞（MSC）治疗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）后患者外周血T细胞受体（TCR）Vβ基因谱系变化及克隆性增殖情况。方法　1例经异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后发生cGVHD的患者接受MSC治疗,分别于第1次输注MSC后第1、5天及第2次输注MSC后第1、10、20天采集外周血,同时将输注的MSC作为对照,利用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3（CDR3）,PCR 产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,从而确定T细胞的克隆性。结果　患者输注的MSC不表达全部TCR Vβ亚家族,第1次输注MSC后第1天也未发现TCR Vβ亚家族的表达,随后的时间点分别出现了3、10、14、10个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式以寡克隆、多克隆为主;临床判断cGVHD表现减轻。结论　MSC对allo-HSCT后患者免疫功能的恢复有一定作用,并能减轻cGVHD效应;TCR Vβ亚家族谱系分析提示有部分优势表达。     

结直肠癌T细胞克隆TCRβ基因CDR3区氨基酸序列的初步分析

 目的　通过建立结直肠癌肿瘤浸润性淋巴细胞 (tumorinfiltratinglymphocytes ,TIL)和术前外周血 (peripheralbloodlymphocytes ,PBL)中抗肿瘤T细胞克隆的TCRβ基因谱型 ,确定抗肿瘤T细胞克隆的分子特征。方法　采用RT PCR方法扩增结直肠癌TIL和PBL的TCRβ基因的 2 4个不同V家族基因片段 ,经过测序凝胶分离和特殊银染色 ,结合测序结果确定TCRβ基因谱型。 结果　结直肠癌患者具有TIL和 /或PBL中T淋巴细胞的克隆性增殖。有些T细胞克隆表达相同的CDR3区氨基酸基序。CDR3区不同位点具有特征性的疏水性和极性氨基酸以及甘氨酸的分布。结论　通过分析结直肠癌抗肿瘤T细胞克隆特征性的CDR3区氨基酸序列 ,将有益于发现新的抗肿瘤免疫治疗方法。     

B-ALL病人TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

 目的　了解B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法　利用RT PCR方法扩增 13例初发未治B ALL病人外周血单个核细胞中 2 4个TCRVβ基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果　 13例B ALL病人分别表达 2～ 18个Vβ亚家族。 13例病人均存在 1个或多个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞 ,增殖形式包括寡克隆及寡克隆增殖趋势、双克隆和单克隆。Vβ2 1和Vβ2 3亚家族出现克隆增殖性T细胞的频率较高。结论　B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ谱系呈现优势利用的特点 ,并存在克隆性增殖的T细胞 ,这可能是机体对白血病相关抗原产生的特异性免疫反应 ;Vβ2 1和Vβ2 3亚家族T细胞发生克隆增殖改变的趋向性比较明显 ,可能与B ALL相关抗原刺激有关     

APL患者外周血TCR VβT细胞克隆性增生特点

目的了解急性早幼粒细胞白血病（APL）患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法利用RT—PCR和基因扫描技术分析21例APL患者外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的CDR3长度,10例正常人作为对照。结果21例患者外周血T细胞所表达的Vβ亚家族数量差别很大,2～21个Vβ家族不等,其中,以Vβ2（71．4％）,Vβ15（61．9％）和Vβ5（57．1％）出现频率较高,而Vβ10,和Vβ14出现频率最低（14．3％）。除2例外,患者外周血均可检测到某些Vβ亚家族的克隆性T细胞,主要为Vβ12,Vβ21和Vβ23克隆性T细胞。结论APL患者外周血Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布特点,并存在克隆性增生的T细胞,这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性免疫反应。     

AML-M_5细胞诱导TCR Vβ T细胞克隆性增殖研究

 目的　了解急性髓细胞白血病 (AML)M5亚型细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法　采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,用AML M5细胞体外诱导供者外周血和脐血的T细胞增殖 ,用RT PCR扩增经MLTC前后获得细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。并经基因扫描分析确定M5细胞诱导的T细胞克隆性特点。结果　脐血和供者外周血分别表达 13和 5个TCRVβ亚家族T细胞 ,经MLTC培养初期 ,则表达全部 2 4个Vβ亚家族 ,随着诱导时间的增加 ,诱导T细胞所表达的Vβ亚家族逐渐减少。基因扫描显示AML M5细胞诱导后的T细胞出现寡克隆和双克隆增殖改变 ,主要为Vβ2 1的克隆性增殖T细胞。结论　AML M5细胞可诱导TCRVβT细胞克隆性增殖 ,这可能是对AML M5细胞相关抗原的特异细胞免疫应答的结果。     

AML-M_5细胞诱导TCR Vβ T细胞克隆性增殖研究

目的　了解急性髓细胞白血病 (AML)M5亚型细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法　采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,用AML M5细胞体外诱导供者外周血和脐血的T细胞增殖 ,用RT PCR扩增经MLTC前后获得细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。并经基因扫描分析确定M5细胞诱导的T细胞克隆性特点。结果　脐血和供者外周血分别表达 13和 5个TCRVβ亚家族T细胞 ,经MLTC培养初期 ,则表达全部 2 4个Vβ亚家族 ,随着诱导时间的增加 ,诱导T细胞所表达的Vβ亚家族逐渐减少。基因扫描显示AML M5细胞诱导后的T细胞出现寡克隆和双克隆增殖改变 ,主要为Vβ2 1的克隆性增殖T细胞。结论　AML M5细胞可诱导TCRVβT细胞克隆性增殖 ,这可能是对AML M5细胞相关抗原的特异细胞免疫应答的结果。     

白血病单倍型骨髓移植后T细胞克隆的T细胞受体分子特征

背景与目的:临床及实验研究结果表明,异基因造血干细胞移植后T细胞免疫恢复延迟,单倍型造血干细胞移植免疫重建与临床经过密切相关.本课题通过T细胞受体谱型分析,研究白血病单倍型骨髓移植后细胞免疫重建特点及与移植物抗宿主病(GVHD)相关的T细胞克隆的T细胞受体β链可变区互补决定3区(TCRBV CDR3)分子特征.方法:应用RT-PCR扩增9例不同类型白血病单倍型骨髓移植后患者及5名正常供者的外周血的TCRBV 24个家族的基因序列,并通过基因扫描的方法判断TCRBV家族的克隆表达情况、CDR3克隆性质及测定BV家族的利用率.对于单克隆表达的与GVHD相关T细胞克隆进行序列测定.结果:在移植后10～19个月,TCRBV家族的利用仍处于不均一状态,检测到部分BV家族缺失,部分家族出现寡克隆、单克隆T细胞增殖.在疾病相对稳定的4例患者中,在9～14个BV家族中有表达,且多克隆家族的表达率在50%以上.另5例为疾病处于活动状态,发生Ⅱ～Ⅲ度GVHD或巨细胞病毒(CMV)感染,对BV家族的利用明显减少,多为单克隆或寡克隆表达,多克隆表达率仅30%,未发现共用的单克隆BV家族.其中2例患者在治疗前后不同时间,随着疾病趋于稳定,BV家族的利用增加,CDR3的多克隆群体增加.得到的一组与GVHD直接相关的TCRBV CDR3分子,通过比较未发现共同使用的氨基酸基序.结论:单倍型骨髓移植后10～19个月,在疾病相对稳定期,9～12个BV家族有表达,以多克隆家族表达为主.在疾病活动状态,BV家族表达减少,以单克隆或寡克隆表达为主.与GVHD相关的克隆性T细胞,未发现共同使用的CDR3氨基酸基序.     

CML相关TCRVα亚家族T细胞的克隆性分布特点

 目的 了解慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血TCR Vα亚家族T细胞的克隆性分布特点。方法 采用RT-PCR扩增10例CML患者外周血的单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因，分析其TCR Vα亚家族的利用情况。PCR产物进一步经基因扫描分析，了解其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果 不同病人外周血中所能检测出的Vα亚家族数量不等（1～21个），以Vα3、Vα4、Vα8、Vα10和Vα14为常见，并在Vα1、Vα2、Vα3、Vα4、Vα5、Vα8、Vα10、Vα12、Vα14、Vα15、Vα16、Vα19、Vα21和Vα23中发现克隆性生长T细胞。结论 CML病人外周血T细胞的TCR Vα亚家族选用呈现明显的选择性并出现克隆性T细胞，这可能与机体对白血病相关抗原产生特异性免疫有关，且克隆性增殖Vα亚家族分布以个体特异性为主。     

APL患者外周血TCR Vα亚家族T细胞分布和增殖特点

目的:了解急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周血TCRVα亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法:利用RT-PCR扩增9例APL患者和10例正常人外周血单个核细胞中29个TCRVα亚家族基因的互补决定区3(CDR3),了解TCRVα亚家族T细胞的分布;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。结果:9例患者外周血T细胞所能检测到的Vα亚家族T细胞分别为1~9个亚家族,以Vα3和Vα19出现频率较高;克隆性增殖T细胞可在8例患者中检测到,以Vα3、Vα26和Vα27出现克隆性T细胞频率较高(3/8)。正常人外周血T细胞中表达绝大多数Vα亚家族,呈多克隆性增殖特点。结论:APL患者外周血Vα亚家族T细胞存在明显的倾斜性分布和克隆性增殖特点,后者可能是对APL细胞抗原的反应性增殖,是否具有特异性杀伤作用,有待进一步检测。     

肿瘤患者T细胞克隆性增殖与预后的分析

 目的　通过分析肿瘤患者肿瘤浸润性淋巴细胞 (tumor infiltratinglymphocyte ,TIL)和外周血淋巴细胞 ( peripheralbloodlymphocytes,PBL)中克隆性增殖T细胞的TCRβ基因谱型的分子特征 ,研究T细胞免疫在肿瘤预后中的作用。方法　采用RT PCR及变性聚丙烯酰胺测序凝胶电泳方法扩增并分离TCRβ基因V J重排片断。通过PCR产物直接测序的方法 ,判断T细胞克隆的特征 ,得到CDR3区氨基酸序列。结果　在结直肠癌、肺癌TIL和术前PBL中均发现TCRβ基因的寡克隆性扩增 ,它们在术后的PBL中均消失。具有术前PBL的克隆性增殖T细胞的患者还可能影响肿瘤的预后。结论　肿瘤患者的肿瘤组织和术前外周血中都存在肿瘤肽特异性激活的T细胞克隆 ,T细胞免疫系统的激活在肿瘤的预后中可能起着重要作用     

非小细胞肺癌患者T细胞受体Vβ表达和克隆性研究

目的　了解非小细胞肺癌 (non small celllungcancer ,NSCLC)患者外周血淋巴细胞 (PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)及非癌肺组织淋巴细胞中T细胞受体 (TCR)Vβ优势表达情况及优势亚家族的克隆性分布。方法　收集 2 4例NSCLC患者外周血、肺癌组织和非癌肺组织 ,提取RNA ,经反转录多聚酶链反应 (RT PCR) ,扩增TCRVβ 2 4个亚家族基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经基因扫描分析 ,以 10例正常人外周血结果作对照 ,比较不同来源T细胞TCRVβ亚家族的表达情况。 结果　NSCLC患者仅存在部分亚家族的T细胞 ,其中TCRVβ5的表达率在TIL中 (6/18,33.3% )明显高于PBL(1/2 4,4.2 % )和非癌肺组织(0 /12 ) ,P值均 <0 .0 5 ,而且 6例表达Vβ5的TIL中 2例为寡克隆增殖 ,4例为多克隆增殖。 结论　NSCLC患者TCRVβ 2 4个亚家族呈倾斜性分布和克隆性增殖 ,提示NSCLC的TIL中可能存在肿瘤相关抗原 (TAA)刺激引起的特异性T细胞免疫反应     

慢性移植物抗宿主病患者T细胞受体Vβ亚家族T细胞的免疫重建

目的：了解慢性移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD)患者T细胞受体（Tcell recepter,TCR)VβrT细胞免疫功能重建的情况。寻找可能与GGVHD相关的TCRVβ亚家族基因。方法：采用RT-PCR方法扩增5例患者外周血单个核细胞的TCRVβ24个亚家族基因,分析其TCRVβ亚家族基因。方法：采用RT-PCR方法扩增测到2-8个Vβ亚家族的T细胞,不同患者所缺乏的TCRVβ亚家族不尽相同,其中4例患者均表达Vβ基因。结论：慢性GVHD患者外周血TCRVβ亚家族T细胞部分受抑制,Vβ亚家族T细胞可能和慢性GVHD有关,此方法不仅可以更详细地了解病人T细胞免疫功能重建的情况,更重要的是今后有可能在分子水平上寻找与GVHD相关的TCRVβ亚家族基因,为临床开展特异性的GVHD细胞亚群清除性治疗提供实验依据。     

AML-M2a诱导TCR Vβ T细胞的克隆性增殖和细胞毒作用

目的:了解急性髓性白血病(AML)M2a细胞诱导的体外增殖T细胞的特异性杀伤作用和克隆性增殖情况.方法:利用肿瘤细胞-T淋巴细胞混合培养方法(MLTC),分别收集3例经AML-M2a细胞体外诱导不同扩增时间的健康人T细胞,利用LDH释放方法分析其特异性细胞毒作用,同时利用RT-PCR和基因扫描方法分析经AML-M2a细胞诱导前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族基因的表达和克隆性情况.结果:在培养第12天和第21天时,1例AML-M2a细胞诱导的3例健康人T细胞对该诱导细胞的平均杀伤率分别为39.88±7.79%和62.14±9.79%,而对AML-M2a患者和健康人外周血T细胞均无杀伤作用.TCR Vβ谱系分析发现诱导后3例健康人T细胞均出现Vβ16的克隆性增殖.结论:AML-M2a细胞可诱导健康人T细胞成为具有克隆性增殖的特异性CTL,并以Vβ16的克隆性增殖为主.     

CML细胞和K562细胞诱导TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖和杀伤性的研究

目的：了解CML细胞和K562细胞体外诱导CML细胞特异性T细胞的TCRVβ亚家族利用、克隆性培殖和杀伤性情况。方法：采用混合淋巴细胞／白血病细胞培养法(MLTC)体外将CML细胞和K562细胞与脐血和成人外周血MNC混合培养和扩增，运用RT—PCR—基因扫描技术分析其TCRVβ亚家族的利用和克隆性特点，以及应用间接荧光单抗标记技术和LDH法分析诱导增殖的T细胞免疫表型和杀伤性。结果：CML细胞和K562细胞可以诱导出呈寡克隆或寡克隆趋势生长的Vβ亚家族T细胞，并具有识别和杀伤CML细胞的功能。结论：CML细胞和K562细胞可在体外诱导出异体CML细胞特异性CTL，该CTL可能为优势表达的Vβ亚家族克隆性T细胞。     

PML-RARα多肽诱导脐血TCR Vβ T细胞增殖研究

 目的 了解PMLRARd多肽诱导脐血T细胞的T细胞受体（TCR）V8谱系表达和克隆性情况。方法 以不同浓度（16．7μg／mL，33．3μg／mL或50μg／mL）的PML-RARα多肽联合IL-2、抗CD3单抗以及抗CD28单抗诱导脐血T细胞增殖，利用RT-PCR-基因扫描技术分析诱导后第3、6、9、12天后的脐血TCRV8亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果 限制性表达和克隆性增殖TCR Vβ亚家族T细胞可见于PML-RARα多肽诱导后脐血T细胞。结论 PML-RARα多肽可在体外诱导脐血T细胞呈克隆性增殖，此优势增殖的克隆性T细胞可能具有特异性细胞毒作用。