幽门螺杆菌空泡毒素基因克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定

已发现幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ ,Ｈｐ)疫苗具有预防和治疗Ｈｐ感染的效果〔1〕。大多数Ｈｐ菌株均能产生空泡毒素 (ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ,ｖａｃＡ) ,其前体蛋白在分泌过程中只有相对分子质量 (Ｍｒ)约87× 10 3的ＶａｃＡ被转运到细胞外 ,Ｍｒ 为 4× 10 3氨基末端信号肽和 5 0× 10 3羧基末端多肽分别留于细菌内、外膜中〔2〕。Ｈｐ感染者血清中可出现ＶａｃＡ抗体 ,重组ＶａｃＡ在ＨｐＳＳ1株小鼠感染模型中有 80 %的保护率〔3〕。我们构建了ｖａｃＡ原核表达系统 ,所表达的重组ＶａｃＡ…     

携带幽门螺杆菌ureB和IL-2质粒DNA的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗构建

目的　构建编码幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H .pylori)尿素酶B亚单位 (ureB)基因和小鼠IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,体外转染Cos 7细胞 ,鉴定其表达蛋白的免疫性。方法　应用聚合酶链式反应 (PCR)技术从H .pylori标准菌株CCUG1 7874基因组DNA扩增ureB基因 ,从重组质粒 pCIneo IL 2扩增小鼠IL 2基因 ,通过T A克隆分别插入 pUCmT载体 ,检测ureB及IL 2的核苷酸序列 ,通过酶切、连接反应分别克隆入真核表达载体 pIRES ,PCR和酶切反应进行鉴定 ;重组载体 pIRES ureB和 pIRES ureB IL 2转入减毒鼠伤寒沙门菌LB50 0 0 ,抽提质粒 ,再次转入SL72 0 7,反复传代 ,鉴定核酸疫苗载体菌的稳定性。通过脂质体法将重组载体 pIRES ureB和pIRES ureB IL 2转染Cos 7细胞 ,SDS PAGE及Westernblot法检测表达蛋白的免疫性。结果　扩增出长约 1 70 0bp的ureB基因和 51 0bpIL 2 ,测序结果表明 ,扩增出的ureB基因与基因库H .pyloriureB序列一致 ,IL 2序列和小鼠的IL 2序列一致 ,PCR和酶切鉴定结果证实ureB和IL 2基因克隆入真核表达载体 pIRES ,并成功构建了稳定的幽门螺杆菌ureB和IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,并且以Westernblot检测到特异性的相对分子质量 (Mr)为 6 6× 1 0 3的UreB蛋白     

幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究进展

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃腺癌、B细胞淋巴瘤的发生亦密切相关。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）已将Hp列为Ⅰ类致癌因子。流行病学调查显示，全世界成年人口约50％携带该菌。现有的根除却的手段主要是联合应用抑酸剂及2或3种抗生素，但却感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、药物价格的昂贵以及患者的低依从性等限制了抗菌疗法的成功使用。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌HpureB基因,并构建其核酸疫苗。方法:以HpNCTC11637株基因组DNA为模板,用PCR扩增ureB基因,并亚克隆至pMD18-T载体中。将目的基因经SalI、BglⅡ酶切纯化后插入pTCAE中,转化E.coliDH5α。经SalI、XhoI酶切并测序鉴定的阳性重组质粒命名为pT-ureB。以电穿孔法将pT-ureB转染CHO细胞,用Wes-tern blot检测UreB蛋白的表达。结果:克隆重组后得到pT-ureB。将pT-ureB以电穿孔法转染CHO细胞后,取其培养上清进行Western blot检测,在UreB的相对分子质量(Mr)为62000处出现特异性条带。结论:成功地构建了HpureB核酸疫苗。体外转染CHO细胞后,经Western blot检测证实有UreB蛋白的表达,为进一步的相关研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌Lpp20核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究

目的 构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Lpp20,并在HeLa细胞中进行表达.通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平.方法 用PCR法扩增Lpp20全基因,再将Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体构建pcDNA3.1(+)/Lpp20重组体,观察其在HeLa细胞中的表达.将核酸疫苗PcDNA3.1(+)/Lpp20、对照空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL/6小鼠.隔2周免疫一次,共免疫4次.间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20 IgG抗体水平,双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应.通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在.结果 小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,6周后ELISA测定血清抗体A450值为0.74,效价为1:1024.核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高[(410.36±56.23)ps/ml],与空质粒组[(25.26±10.85)pg/ml]之间差异有统计学意义(P<0.01).脾淋巴细胞增殖反应测定,核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(2.37±0.22)明显高于空质粒组(1.53±0.47)和PBS组(1.20±0.13),P<0.01.PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗,且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答.为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据.     

表达幽门螺杆菌hpaA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建和鉴定

目的：构建表达幽门螺杆菌（H.pylori)hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门低 疫苗菌。方法：用基因工程的方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行了基因测序。重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261,提取重组疫苗菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆。用SDS－PAGE电泳和Western blot进行HpaA表达和鉴定。结果：经PCR和酶切证实,构建了含hpaA的重组原核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。HpaA能在疫苗菌中以二聚体形式表达,HpaA量约占全菌体蛋白量的17％,Westem blot证实其有免疫原性。结论：构建了表达H.pylori hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门氏疫苗菌,为探索制备H.pylori口服活疫苗尊定了基础。     

人重组pMAGE-A1/EGFP真核表达质粒的构建与表达

目的　特异克隆MAGE A1开放读码框基因,构建以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的包含MAGE A1的真核表达载体并转染人PBMC来源DC细胞。方法　根据MAGE A1特征序列设计PCR扩增引物,从Mel 5 2 6中扩增MAGE A1基因开放读码框,并克隆至pIRES EGFP中,构建人重组pMAGE A1 EGFP真核表达质粒。利用电转染方法将该重组质粒转入人外周血来源DC细胞并检测MAGE A1和EGFP的表达情况。结果　成功构建真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,转染人PBMC来源DC细胞并检测到MAGE A1和EGFP表达,两者表达率分别为(8.8±0 .9) %和(8.4 7±0 .78) % ,无统计学差异。结论　成功构建人重组真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,为开展MAGE A1为基础的免疫治疗提供有利的分子生物学工具。     

幽门螺杆菌粘附素基因babA2的克隆及免疫应答的初步研究

目前，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)疫苗的研制仍处在抗原的筛选阶段，已经评价的基因重组抗原基本上是着眼于阻断Hp的毒力因素，而与Hp定植密切相关的粘附素评价较少。babA是迄今为止唯一明确受体的Hp粘附素，研究表明babA基因存在两个等位基因：babA1和babA2，其中只有babA2：具备与Le^b结合的功能。本实验对babA2基因进行了克隆和表达并研究了其免疫反应。     

胃B细胞淋巴瘤API2-MALT1融合基因表达与幽门螺杆菌感染的相关性

目的 探讨胃MALT淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤演进中t(11;18)(t121;q21)与幽门螺杆菌(HP)感染的关系,以及检测AP12-MALT1融合基因的意义。方法47例胃淋巴瘤病例(MALT淋巴瘤31例,弥漫性大B细胞淋巴瘤16例),经复查诊断后,用RT—PCR和巢式PCR,检测肿瘤组织中AP12-MALT1融合基因的表达,用半巢式PCR和特殊染色检查HP感染情况。根据淋巴瘤类型及融合基因检测结果将病例分组,观察各组病例HP感染的差异。结果47例胃淋巴瘤中20例AP12-MALT1融合基因mRNA检测阳性,包括16例MALT淋巴瘤和4例弥漫大B细胞淋巴瘤。HP感染检出率：AP12-MALT1阳性组为25％(5／20),AP12-MALT1阴性组25．92％(7／27)。统计学分析表明两组间差异无显著性。2例AP12-MALT1融合基因检测阴性的胃MALT淋巴瘤病例经抗HP治疗后病情稳定。结论胃MALT淋巴瘤和DLBCL中AP12-MALT1 mRNA表达与胃淋巴瘤HP感染无明显相关,AP12-MALT1融合基因可能成为胃MALT淋巴瘤抗HP治疗效果不良的预测因子。     

卵泡抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达质粒的构建及表达

目的：构建高免疫原性的抑制素真核表达载体。方法：通过PCR扩增pCMV-S基因中的S基因片段，然后将抑制素α(1-32)片段与S的融合基因克隆到真核表达质粒peDNA13．1(-)：酶切、测序鉴定后，采用脂质体包裹法将重组质粒转染Hela细胞，用SDS-PAGE和ELISA对其表达产物进行检测。用抑制素融合表达质粒免疫大白鼠，ELISA检测血中抗抑制素抗体水平。结果：酶切鉴定和序列分析表明，融合基因的表达质粒pClS构建成功。表达质粒在HeLa细胞中获得了表达，融合蛋白的分子量约为29kD，融合蛋白具有抑制素免疫原性。重组质粒免疫使大白鼠产生了抗抑制素抗体。结论：高免疫原性的抑制素表达质粒的构建为利用抑制素基因免疫技术诱导单胎动物生多胎奠定了基础。     

幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性。方法：从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段,采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因,以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,经测序确认后转染COS-7细胞,Western blot检测目的蛋白表达,胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价。结果：经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中,免疫印记检测到目的蛋白表达,并具有良好的抗原性,免疫小鼠后能够产生特异性抗体。结论：成功构建Hp双价DNA疫苗,免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础。     

IL-1基因多态性、幽门螺杆菌感染与胃癌易感性的研究进展

幽门螺杆菌(helicobacter pylori HP)感染胃部后会引起两种不同类型的胃炎：以胃窦部为主的胃炎和以胃体部为主的胃炎。前者胃酸分泌不变或增多，易诱发十二指肠溃疡；后者易引起胃酸分泌减少，从而导致胃萎缩，诱发胃癌。白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)是一种重要的炎症介质，其家族成员IL-1β是一种很强的酸抑制剂，而IL-1ra则是IL-1受体拮抗剂。IL-1基因多态性的存在使个体在幽门螺杆菌感染后产生的IL-1β和IL-1ra量不同，从而影响胃酸的分泌，最终导致不同的临床结局。     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究

目的　构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 (UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)的重组融合蛋白 ,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩增出 1713bp的ureB基因 ,并克隆至pFS2 .2载体中与ltB基因融合 ,将ltB ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa Ⅱ ,并在工程菌E .coliJM10 9中诱导表达。结果　经序列分析 ,ltB ureB融合基因由 2 10 3个碱基组成 ,为编码 70 1个氨基酸残基的多肽。SDS PAGE和Westernblot检测发现 ,融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 75× 10 3 ,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应 ,ELISA检测显示 ,融合蛋白中存在LTB组分。同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性 ,但保持与LT受体 神经节苷脂GM1结合的活性。结论　LTB UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究     

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段原核表达载体的构建和表达

目的 构建幽门螺杆菌（Hp)vac A基因片段原核表达载体并进行表达。方法 采用PCR技术,扩增Hp vac A基因的1个片段B,并克隆入pGEM－3Zf(-)质粒。测序正确后,再克隆入质粒pRSETA中,构建重组表达载体pRSETA-B。结果 经过转化E.coli BL21 DE3(plysS)后,诱导表达出相对分子质量（Mr)为33000的蛋白。SDS－PAGE分析显示,表达量占全菌总蛋白质的47．8％。清中目的蛋白占全菌总蛋白的10．9％。ELISA和Western blot分析表明,表达蛋白能与免抗Vac A多抗结合。结论 成功地构建原核表达载体pRSETA-B,为进一步探讨该片段的生物学活性,以及临床上通过检测患者血清预测Hp的感染提供了实验依据。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a( )、pET28a( )及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a( )、pET28a( )与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌ureB及ureB-hspA融合基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达及小鼠的免疫应答

目的　构建H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗候选株 ,并进行初步的免疫原性分析。方法　将H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因分别克隆入pTrc99A asd质粒的多克隆位点之内。挑取单菌落质粒鉴定后 ,分别将其电击经中间宿主X3730转入最终宿主X4 0 72 ,SDS PAGE和Westernblot检测蛋白表达。将疫苗候选株经口或鼻免疫BALB c小鼠。结果　疫苗候选株能够分别表达出相对分子质量 (Mr)为 6 4× 10 3的UreB蛋白及 77× 10 3的UreB HspA融合蛋白。在免疫BALB c小鼠的肠液和血清中可以分别检测到针对H .pylori的特异性分泌型IgA和IgG抗体。结论　构建了能够表达幽门螺杆菌UreB及UreB HspA融合蛋白的活菌疫苗候选株 ,为探索制备H .pylori口服活菌疫苗奠定了基础。     

多株幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因克隆及序列比较

目的为开发以幽门螺杆菌(Hp)肽脱甲酰基酶为靶位的新药，首先考察该基因的保守性。方法从我国不同地区分离、选择多株Hp，培养并提取细菌DNA，设计特异引物以PCR方法扩增其肽脱甲酰基酶基因(def)，并克隆到pGEM T-Easy载体中，转化大肠杆菌，提取质粒鉴定重组质粒并测序。结果经序列比较，发现def基因有高度保守性，在重要的基序点未发生变异。结论本研究为以肽脱甲酰基酶作为靶位筛选药物提供了依据。     

pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒的构建及在HePG_2细胞的表达定位

目的:构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HePG2中的表达和亚细胞定位.方法:采用PCR法从pET28b/LOC51255重组质粒中克隆得到LOC51255 cDNA全长序列, 并将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中.构建好的pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞株HePG2, 再用荧光显微镜直接观察LOC51255在其中的表达及定位情况.结果:经双酶切及DNA测序结果证实成功构建重组质粒pDsRed1-C3/LOC51255;荧光显微镜观察证实该重组质粒能在HePG2细胞中表达, 且LOC51255蛋白主要定位于HePG2细胞的细胞质.结论:成功构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒, 并在HePG2细胞中得到表达, 同时证实LOC51255定位于HePG2细胞的胞质, 为进一步研究人类LOC51255基因的功能奠定了基础.     

猪IL-2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究

目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小鼠 ,以空载质粒pcDNA为阴性对照 ,PBS为空白对照 ;采用流式细胞仪 (FACS)、淋巴细胞增殖试验(MTT法 )分别对小鼠外周血中CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行了检测。结果 :pcDNA IL 2与pcDNA PRRSV ORF5共同免疫小鼠后外周血对ConA有明显的反应性 ,CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数在免疫后 7天显著超过对照组 ,共同组与单独pcDNA PRRSV ORF5组有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :pcDNA PRRSV ORF5免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的细胞免疫应答 ,猪pcDNA IL 2能够显著增强pcDNA PRRSV ORF5诱导小鼠细胞免疫的能力。