外源性转化生长因子β1对大鼠原代肝星状细胞活化的影响

目的探讨大鼠原代肝星状细胞(HSC)体外培养过程中,不同时期外源性转化生长因子β1(TGF-β1)对其活化的影响及相关因素的变化.方法分离大鼠原代HSC,于无包被的塑料培养板上分别培养2,3,4,5,6,7 d时予TGF-β15 μg/L处理24 h,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,应用Western blot法检测处理前后细胞α-肌动蛋白(α-SMA)的变化,及活化过程中TGF-β1Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)的表达.结果HSC在体外培养过程中,不同培养时间对TGF-β1的刺激活化作用反应不同.TGF-β1处理后,对培养2,3,4,5 d HSC的活化有促进作用,以对培养第3天的细胞作用最明显,其α-SMA表达增加78.05%,而培养6,7 d的HSC的形态和α-SMA变化不明显.培养第7天的HSC比培养第3天的细胞TβR-Ⅱ表达增高(3.30±0.83 vs 1.55±0.38,P＜0.05).结论TGF-β1对处部分活化状态中某阶段细胞的活化具有促进作用.完全活化的细胞对TGF-β1的刺激活化作用不敏感,原因与TβR-Ⅱ的表达量无关.     

转化生长因子β1对大鼠肝星状细胞表达β-连环蛋白的影响

目的研究转化生长因子β1（TGF—β1）对大鼠肝星状细胞（HSC）表达β-连环蛋白（β-catenin）的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）比较经不同浓度的TGF-β1刺激不同时间后HSC表达β-catenin、smad3和α-SMA mRNA的变化,并比较三者之间的关系。结果1ng／ml TGF—β1刺激2h后,HSC表达β—catenin mRNA、smad3 mRNA和α—SMA mRNA量最大,β—catenin mRNA表达与两者均具有明显的相关关系（r=0．947,P〈0．01;r=0．950,P〈0．01）。结论β—catenin在TGF—β1活化HSC的过程中发挥重要作用。     

白介素-10血小板衍生生长因子对肝星状细胞表达转化生长因子-β1的影响

目的:探讨IL-10、PDGF对体外培养HSC表达TGF-β1的影响.方法:原位灌流分离HSC,体外培养激活,分别用IL-10、PDGF以及两者共干预,采用半定量RT-PCR方法和免疫细胞化学方法检测各组TGF-β1的mR-NA及蛋白表达情况.结果:IL-10干预组TGF-β1表达较对照组减弱,PDGF干预组较对照组明显增强,IL-10干预组较IL-10、PDGF共干预组明显减弱(P＜0.01).结论:PDGF可促进HSC表达TGF-β1,而抑制HSC表达TGF-β1可能是外源性IL-10的抗肝纤维化作用机制之一.     

重组转化生长因子-β3基因对大鼠肝星状细胞内、外蛋白表达的影响

目的探讨重组转化生长因子-β3（TGF-β3）基因对大鼠肝星状细胞（HSC）内、外蛋白合成及分泌的影响。方法构建质粒pcDNA3.1（＋）-TGF-β3和pcDNA3.1（＋）-TGF-β1。稳定转染：通过脂质体介导的方法,将pcDNA3.1（＋）-TGF-β1转染HSC-T6,经G418筛选建立稳定高表达pcDNA3.1（＋）-TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆。再将pcDNA3.1（＋）-TGF-β3转染HSC-T6克隆细胞,用W estern b lot法和酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测细胞内外TGF-β1、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9及金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-1的蛋白表达量。结果pcDNA3.1（＋）-TGF-β3转染HSC-T6阳性细胞克隆后,与单纯阳性克隆组相比,TGF-β1、Ⅰ型胶原、TIMP-1细胞内蛋白表达及培养上清中的分泌水平均明显降低（P〈0.05）,MMP-2的表达也降低,但两者间差异无统计学意义（P〉0.05）,而MMP-9的表达明显增高（P〈0.05）。结论重组质粒pcDNA3.1（＋）-TGF-β3能减少细胞内外Ⅰ型胶原的合成及分泌;通过调节MMP-9及TIMP-1的表达,可抑制细胞外基质的合成,促进其降解。     

β-连环蛋白对转化生长因子β 1活化HSC-T6细胞的影响

目的 观察β-连环蛋白对转化生长因子β 1(TGF β1)活化肝星状细胞(HSC)的影响. 方法通过脂质体介导,将β-连环蛋白真核表达质粒[pcDNA3.1(+)-β-catenin]和绿色荧光质粒pEGFP-N1共转染体外培养的HSC-T6细胞株,用逆转录PCR和Western blot法检测经TGF β1刺激后两组细胞smad3、β-连环蛋白mRNA及蛋白质的表达.组间比较采用方差分析.结果 β-连环蛋白转染阳性的HSC-T6细胞株经TGF β 1刺激后表达smad3、β-连环蛋白及其mRNA明显强于未转染β-连环蛋白基因的HSC-T6细胞,更强于正常培养的HSC-T6细胞,smad3mRNA相对表达量分别为;0.642±0.011、0.501±0.021、0.511±0.019、0.356±0.017,F=135.304,P<0.05;β-连环蛋白mRNA相对表达量分别为:0.783±0.021、0.543±0.033、0.538±0.024、0.212±0.019,F=267.340,P值均<0.05.smad3蛋白质相对表达量分别为:0.892±0.012、0.124±0.011、0.130±0.021、0.003±0.001,F=2823.813,P<0.05;β-连环蛋白相对表达量分别为:0.921±0.020、0.210±0.010、0.208±0.008、0.002±0.001,F=3440.982,P<0.05.β-连环蛋白和smad3蛋白质的表达均与α-平滑肌肌动蛋白的表达显著相关(r=0.901,P<0.01;r=0.939,P<0.01).结论 β-连环蛋白基因转染体外培养的HSC-T6细胞株,促使HSC表达smad3、α-平滑肌肌动蛋白增强,提示β-连环蛋白能增强TGF β1的致纤维化作用.     

丹酚酸B对转化生长因子β1促肝星状细胞分泌胶原的影响

目的 观察丹酚酸B(SA—B)对肝星状细胞(HSC)分泌转化生长因子β1(TGFβ1)与TGFβ1促HSC分泌胶原的影响。方法 用ELISA法测定培养4d的原代与传代HSC的TGFβ1分泌量；添加TGFβ1于原代HSC中温育24h后，[^3H]脯氨酸掺人与胶原酶消化法观察TGFβ1促进HSC分泌胶原的作用；Western印迹法检测：HSCⅠ型胶原的表达；添加SA—B，观察对上述实验的干预。结果 传代HSC分泌TGFβ1的量明显高于原代HSC；添加SA—B后，对原代HSC的TGFβ1分泌量无明显影响，而传代HSC的TGFβ1分泌量显著减少。TGFβ1可显著促进HSC胶原的分泌和I型胶原的表达，而SA—B可拮抗TGFβ1的效应。结论 SA—B可抑制传代HSC的TGFβ1分泌与减弱TGFβ1促HSC胶原的合成，这两个环节可能是SA—B抗肝纤维化的主要作用机制。     

柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞表达转化生长因子β1和胶原的影响

[目的]观察柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞(HSC)表达转化生长因子β1(TGF-β1)和胶原的影响.[方法]采用血清药理学方法处理HSC,以貂肺上皮细胞(Mv1Lu)生长抑制MTT法检测培养上清液中TGF-β1活性,免疫细胞化学染色检测HSC TGF-β1和胶原的表达.[结果]经柔肝冲剂处理的HSC培养上清液中TGF-β1的生物活性和细胞内TGF-β1的表达受到显著抑制,其中对纤维肝HSC的作用更明显,抑制作用优于秋水仙碱.柔肝冲剂能显著抑制纤维肝HSC表达胶原,对Ⅳ型和Ⅰ型胶原具有较高的抑制率.[结论]柔肝冲剂能抑制HSC产生TGF-β1和胶原,阻断肝纤维化时HSC合成胶原等细胞外基质的自分泌放大过程.     

丹参酸乙对转化生长因子β1刺激的大鼠肝星状细胞的观察

目的 探讨丹参酸乙（SAB）对转化生长因子β1（TGFβ1）刺激的大鼠肝星状细胞活化、Ⅰ型胶原及c-fos基因表达的影响。方法 原位灌注、消化大鼠肝脏,分离肝星状细胞。以不同浓度SAB温TGFβ1刺激的大鼠肝星状细胞。异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA,RT－PCR法检测目的基因的表达。结果 1μmol/L SAB和10μmol/L SAB可分别抑制Ⅰ型胶原及c-fos基因表达,但1μmol/L SAB和10μmol/L SAB对SM α-actin mRNA均无显著影响。结论 TGFβ1对体外活化的大鼠肝星状细胞表达SM α-actin mRNA无明显影响,可促进Ⅰ型胶原和c-fos mRNA的表达。SAB可抑制TGFβ1促进细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的作用。     

粉防己碱对肝星状细胞转化生长因子-β1反应性影响

目的观察低浓度粉防己碱（Tetrandrine）对转化牛长因子-β1（TGF-β1）促进静止期大鼠肝星状细胞（HSCs）活化和维持HSCs活化作用的影响，并探讨该作用与TGF-β1受体后信号通路的关系。方法HSCs原代培养，取静止期（培养3d）和活化HSCs（培养8d），给予TGF-β1（质量浓度5ug／L）和（或）粉防己碱（1．6umol／L）干预，观察HSCs形态变化，分别以RT．PCR和Western blot法检测TGF-β1、Smad7以及α—SMAmRNA和（或）蛋白表达。结果粉防己碱（1．6umol／L）能抑制静止期HSCs胞体伸展，粉防己碱使活化的HSCs膜状伸展的胞体收缩和梭形变，在单纯粉防己碱处理组和混合处理组均可见此现象。在静止期和活化HSCs中，粉防己碱均能抑制TGF-β1．诱导的HSCsd—SMA表达，TGF-β1表达下降，使静止期HSCsSmad7表达上调，但不影响活化HSCs Smad7表达.结论低浓度粉防己碱显著抑制TGF-β1对静止期的HSCs促活化作用和对活化HSCs的活化维持作用，诱导培养活化的HSCs活化逆转，其作用机制在不同活化状态的HSCs中存在差异。     

转化生长因子β信号传导阻断对鼠肝星状细胞培养激活的影响

目的 研究转化生长因子β(TGF-β)信号传导通路的阻断,对鼠肝星状细胞(HSC)培养激活的影响。 方法 利用腺病毒AdT β-ExR的表达产物阻断HSCs中TGF-β信号传导。用酶联免疫吸附试验,Western blot及免疫组织化学等方法检测HSCs中Ⅰ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达及细胞增殖。 结果 感染AdT β—ExR与感染AdLacZ的HSCs相比,Ⅰ型胶原蛋白的表达量为对照组的42.99％(q=9.100,,P<0.001),α-SMA的表达明显被抑制,而细胞增殖指标5-溴脱氧尿苷的参入量,后者为前者的49.24％(q=7.835,.P<0.001)。 结论 阻断TGF-β信号传导能显著地抑制HSCs的培养激活,但促进HSCs的分裂。通过腺病毒AdT β-ExR的表达产物阻断TGF-β信号传导作为抑制肝纤维化的方法,还需深入一步的研究。     

筛选转化生长因子β1刺激肝星状细胞差异表达基因的研究

目的 筛选转化生长因子β 1(TGF β 1)刺激大鼠肝星状细胞(Hsc)的差异表达基因,以揭示TGF β1介导肝纤维化的分子发病机制. 方法分别用Trizol法抽提TGF β1刺激的HSC及磷酸盐缓冲液刺激为对照的HSC总RNA,逆转录合成双链cDNA,制备掺入生物素标记的cDNA探针,与人基因表达谱芯片杂交,用Agilent扫描仪对芯片结果进行扫描,利用软件对差异表达基因进行生物信息学分析. 结果 从13824条目的 基因中筛选出177条差异表达基因,其中123条基因表达上调,其中包括:结缔组织生长因子,微管蛋白ε 1,V型胶原α2,连环蛋白6 2,钙粘蛋白6,2型,Smad3,丝裂源活化蛋白激酶4,生长因子受体结合蛋白7,丝裂原活化蛋白激酶相互作用/丝氨酸/苏氨酸激酶1等;54条基因表达下调,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子4,干扰素调节因子7,干扰素诱生蛋白p78,骨形态发生蛋白7,基质gLa蛋白,人类丝氨酸蛋白酶抑制剂进化支B成员8,干扰素刺激基因2.0×104,死亡相关蛋白6,金属硫蛋白1H,超氧化物歧化酶2等;同时筛选到8个未知功能蛋白. 结论 应用基因表达谱芯片技术成功筛选了TGF β 1刺激HSC的差异表达基因,初步揭示了TGF β1致肝纤维化的分子机制是诸多因素共同作用的结果,为进一步寻找新的基因治疗靶点奠定了基础.     

抗转化生长因子β1核酶在胞外和肝星状细胞内对靶RNA的切割作用

目的研究抗转化生长因子B1锤头状核酶的胞外切割作用以及在肝星状细胞内的活性。方法运用计算机设计针对转化生长因子B1的锤头状核酶，制备核酶、失活核酶和靶RNA胞外转录物，进行核酶的胞外切割反应；构建编码核酶、失活核酶的真核表达载体，并转染入活化型肝星状细胞株内，分析核酶和TGFβ1的表达。结果该核酶在胞外具有良好特异的切割活性，在转染的肝星状细胞内高效表达且有效下调TGFβ1的表达；而失活核酶在胞外不具有切割活性，在胞内对TGFβ1表达的抑制作用轻微。结论此核酶在胞外具有特异切割活性，在肝星状细胞内抑制TGFβ1的表达，有望为肝纤维化的治疗提供新的手段。     

氧化苦参碱对转化生长因子-β1促肝星状细胞活化及跨膜信号转导影响

目的观察低浓度氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞(HSC)培养活化和转化生长因子-β1,(TGF-β1)促活化作用影响,并探讨该作用与TGF-β1受体后信号通路的关系.方法原代分离培养2d HSC,MTT法检测低浓度氧化苦参碱(0.25～8 mg/L)对HSG细胞毒作用(作用12 h)和增殖影响(作用48 h),或给予TGF-β1(5 ng/m1)和/(或)氧化苦参碱(2 mg/L)干预,相差显微镜观察HSC形态变化,分别以RT-PCR或Western blot法检测TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad 2/3、Smad 7以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和/(或)蛋白表达.结果氧化苦参碱(0.25～8 mg/L)对HSC无明显细胞毒作用,大于8 mg/L能抑制HSC增殖.氧化苦参碱(2 mg/L)抑制TGF-β1诱导HSC激活时的α-SMA表达和形态转化,伴随TGF-β1受体mRNA表达升高,Smad 7 mRNA表达上调及TGF-β1mRNA表达下降(与单纯TGF-β1处理组相比,分别上升1.25、0.87倍或下降1.92倍,P均＜0.05),但不影响TGF-β1Ⅱ型受体和Smad 3 mR-NA表达.Western blot检测Smad 2/3、Smad 7蛋白表达,与RT-PCR结果相似.氧化苦参碱对单纯培养激活的HSC有类似作用.结论低浓度氧化苦参碱(2 mg/L)上调Smad 7表达并抑制TGF-β1表达、上调TGF-β1Ⅰ型受体、恢复正常的TGF-β1跨膜信号转导,抑制HSC培养活化和TGF-β1促活化作用.     

转化生长因子β1对肝星状细胞迁移及细胞内Rho三磷酸鸟苷酶表达的影响

目的 观察转化生长因子(TGF)β1刺激后肝星状细胞迁移和细胞骨架的变化,并观察TGFβ1刺激对肝星状细胞内Rho三磷酸鸟苷(GTP)酶表达的影响.方法 分离原代大鼠肝星状细胞,用Transwell Chamber观察不同浓度TGFβ1直接及趋化刺激后细胞迁移改变,FITC标记的鬼笔环肽标记F-actin,共聚焦激光扫描显微镜观察细胞骨架的变化,GST pull-down分析检测不同浓度TGFβ1刺激后活性RhoA、Rac1及Cdc42的表达.结果 TGFβ1直接及趋化刺激后肝星状细胞迁移均比对照组增加,≥5 ng/ml浓度时增加明显(直接刺激后130.90±7.64比102.93±1.01,趋化刺激后205.17±10.78比102.93±1.01,P＜0.05);TGFβ1刺激后细胞形态改变,刺激5 min后层状伪足出现,并随时间推移应力纤维逐渐增多;不同浓度TGFβ1刺激后活性Cdc42、RhoA表达较对照组均增强,≥5 ng/ml浓度时表达明显增加(GTP-Cdc420.273±0.024比0.176±0.001,P＜0.05;GTP-RhoA0.176±0.005比0.096±0.004,P＜0.05),而活性的Rac1表达无明显改变.结论 TGFβ1可导致肝星状细胞骨架改变,并可通过激活Cdc42、RhoA GTP酶信号途径,增加细胞迁移.     

Smad7抑制TGF-β1对肝星状细胞α1(Ⅲ)前胶原基因表达的促进作用

目的:探讨在加入TGF-β1的条件下,Smad7过度表达对肝星形细胞-T6(HSC-T6)α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平的作用.方法:体外培养HSC-T6细胞,分为正常对照组、TGF-β1对照组、空载质粒组、Smad7质粒组、TGF-β1+空载质粒组和TGF-β1+Smad7质粒组.通过Fugene6介导Smad7质粒转染,继续培养48 h.采用Real time-PCR、RT-PCR方法检测Smad7和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.结果:TGF-β1+Smad7质粒组、Smad7质粒组Smad7 mRNA水平较正常对照组、空载质粒组显著增高(t=59.43、59.41、54.27及54.25,均t>t0.01,均P<0.01).Smad7质粒组α1(Ⅲ)前胶原基因mRNA表达与正常对照组、空载质粒组相比无明显差异(t=1.25与1.27,均t0.05).但TGF-β1+Smad7质粒组α1(Ⅲ)前胶原mRNAff水平较TGF-β1+空载质粒组和TGF-β1对照组明显降低(t=103.87与45.70,均t>t0.01,均P<0.01).结论:Smad7可显著抑制TGF-β1对HSC-T6ct1(Ⅲ)前胶原mRNA表达的促进作用,而对HSC-T6α1(Ⅲ)前胶原mRNA表达无明显影响.     

白介素—10血小板衍生生化因子对肝星状细胞表达转化生长因子—β1的影响

目的：探讨IL－10，PDGF对体外培养HSC表达TGF－β1的影响。方法：原位灌流分离HSC，体外培养激活，分别用IL－10，PDGF以及两者共干预，采用半定量RT－PCR方法和免疫细胞化学方法检测各组TGF－β1的mRNA及蛋白表达情况。结果：IL－10干预组TGF－β1表达较对照组减弱，PDGF干预组较对照组明显增强，IL－10干预组较IL－10，DGA共干预组明显减弱（P＜0．01）。结论：PDGF可促进HSC表达TGF－β1，而抑制HSC表达TGF－β1可能是外源性IL－10的抗肝纤维化作用机制之一。     

转化生长因子-β1促进miR-181a表达诱导肝星状细胞-T6细胞活化

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对miR-181a表达的影响,以及miR-181a对体外培养的肝星状细胞(HSC)-T6细胞的作用。方法 TGF-β1处理HSC-T6细胞后,检测miR-181a和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。miR-181amimics转染HSC-T6细胞后,Western印迹检测α-SMA和Ⅰ型胶原a2链(collagenⅠa2,ColⅠA2)蛋白表达,CCK-8计数法检测细胞增殖。结果 TGF-β1处理组细胞中miR-181a和miR-181b表达量较对照组细胞明显升高,miR-181a转染组细胞中α-SMA和ColIA2表达量明显高于对照组细胞,miR-181a对HSC-T6增殖无明显影响。结论在HSC-T6中,TGF-β1促进miR-181a表达,miR-181a可促进HSC-T6细胞活化和分泌胶原,进一步明确了TGF-β1促进HSC-T6活化的机制。     

转化生长因子β1刺激肝星状细胞中纤溶酶原激活物抑制剂1表达

肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化发生的中心环节.活化的HSC大量增殖,并合成以胶原为主的细胞外基质(ECM)沉积在肝内.转化生长因子(TGF)β是激活HSC并促进其增殖的最重要细胞因子之一,可促进ECM产生,导致并加速肝纤维化的发生和发展.本实验拟通过免疫细胞化学法检测纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)1在HSC中的定位,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫细胞化学法等研究TGF β1促进PAI 1 mRNA和蛋白质的表达,探讨PAI 1在肝纤维化发生和发展中的作用.     

Wnt抑制因子-1对肝星状细胞活化的影响

目的观察wnt抑制因子-1（WIF）对转化生长因子β1（TGF-β1）活化肝星状细胞（HSC）的影响。方法构建真核表达质粒pEGFP-C1-WIF并通过脂质体介导方法,将pEGFP-C1-WIF转染体外培养的HSC-T6细胞株,用TGF-β1刺激转染（试验组）和未转染的HSC-T6细胞株（对照组）,并用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组细胞（包括正常细胞组）smad3、β-连环蛋白（β-catenin）mRNA及其蛋白质的表达。结果试验组HSC-T6细胞株smad3、β-catenin mRNA及蛋白质表达明显低于正常组HSC-T6细胞株,更低于对照组HSC-T6细胞株（P〈0.05）。β-catenin和smad3蛋白质的表达均与α-肌动蛋白（α-SMA）蛋白质的表达显著相关（r=0.800,P〈0.01;r=0.743,P〈0.01）。结论 WIF能通过下调wnt/β-catenin以及TGF-β1/smads信号通路的生物学效应抑制HSC-T6细胞的活化,从而延缓肝纤维化的发展。     

转化生长因子β1活化肝星状细胞反式激活新基因剪切体的功能

目的 探讨反式激活新基因剪切体TTG 1 A的生物学功能和参与肝纤维化的致病机制.方法 应用酵母双杂交系统3,将PCR扩增的TTG1A基因与酵母表达载体pGBKT7连接,转化酵母细胞AH109,并在其内表达,而后与转化了人白细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经Bgl Ⅱ酶切后测序,进行生物信息学分析. 结果成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA.应用酵母双杂交系统3从人白细胞文库中筛选出19个与TTGlA相互作用的蛋白,其中包括人类主要组织相容性复合物Ⅱ型DP D(HLA-DP β),人类核糖体蛋白L30、人类核磷蛋白B23、人类核组蛋白2、人类ash2、人类变异的家族性睥性贫血和变异的异染性脑白质营养不良相关蛋白,人类死亡因子4(MORF4L1)、人类遍在蛋白偶连酶E2L3、人类载脂蛋白A-1(APOA1)、人类半乳凝素1以及5个未知功能蛋白. 结论 成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA,初步揭示了新基因TTGlA的生物学功能,为进一步研究TGF β1介导的肝纤维化分子发病机制中的作用提供基础.