调控组织因子基因表达的药物筛选研究

本研究建立TF启动子转录活性的荧光素酶基因稳定细胞株,应用该细胞模型筛选调控TF基因表达的药物,并为深入研究其分子机制打下基础。构建TF启动子的一系列5′端截短型的荧光素酶报告基因质粒(包括-2174 bp~+128 bp,-684 bp~+128 bp,-247 bp~+128 bp,-201 bp~+128 bp),将质粒电转染至U937细胞中,建立表达荧光素酶报告基因的稳定细胞株。应用ATRA验证该细胞株的功能;应用bortezomib、尿多酸肽(CDA-II)等药物处理该细胞株24小时,分析荧光素酶基因活性,筛选出能够调控TF基因表达的药物。结果发现,5 nmol/L bortezomib能激活其转录活性,上调TF转录本表达水平;1 mg/ml CDA-Ⅱ抑制TF启动子的转录活性,下调TF转录本的表达水平。TF启动子逐步截短功能分析发现,bortezomib及CDA-ⅡII调控TF启动子转录活性的区域位于-201 bp—0 bp之间。结论:本研究建立了表达TF启动子荧光素酶活性的U937稳定细胞株,并筛选出能够调控TF基因转录的药物CDA-II及bortezomib,为将来筛选新药物及深入研究其分子机...     

AML1-ETO融合蛋白对BCL-2基因表达的影响

本研究旨在观察AML1-ETO在白血病细胞中对于抗凋亡基因日乳-2表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937-WT、U937-Mock和经AML1-ETO基因转染的U937-A／E1-4的细胞凋亡率;使用免疫印迹法检测cleavedcaspase-3蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测转染细胞和对照组细胞以及AMLM2患者白血病细胞BCL-2mRNA的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与BCL-2基因启动子之间直接的相互作用情况。结果表明：AML1-ETO转染细胞的凋亡率明显增加,且检测到cleavedcaspase-3蛋白的表达;转染了AML1—ETO 的U937细胞系和具有AML1—ETO融合基因的AML-M2患者中,BCL-2的mRNA表达水平显著下调;转染细胞沉淀富集的AML1-ETO直接结合的DNA中含有BCL-2基因的启动子序列。结论：BCL-2是AML-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调BCL-2的表达。     

NF-_κB对大鼠血管平滑肌细胞和基质金属蛋白酶的作用

目的:探讨活体内核转录因子NF-κBp65诱骗寡核苷酸和反义寡核苷酸对大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞增殖和基质金属蛋白酶的干预作用。方法:建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。阳离子脂质体介导的NF-κBp65诱骗性寡核苷酸、反义寡核苷酸转送至球囊损伤血管内,相应时间点采样进行研究。结果:大鼠颈动脉球囊损伤后第3天5溴-2脱氧尿苷(Brdu)表达最明显。与模型组相比,反义组、诱骗组、反义加诱骗组Brdu、增殖细胞核抗原(PCNA)表达明显降低(P<0.05)。反义加诱骗组Brdu表达较反义组、诱骗组降低(P<0.05)。大鼠颈动脉损伤后7d,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达在反义组、诱骗组、反义加诱骗联合治疗组均较各自对照组降低。结论:大鼠颈动脉球囊损伤后,血管平滑肌细胞显示动态的增殖效应,损伤后第3天增殖最明显。脂质体介导局部转染反义、诱骗性寡核苷酸可抑制NF-κB对MMP-9的调控。     

核因子κB反义和诱骗寡核苷酸对平滑肌细胞增殖的作用

目的:观察离体血管平滑肌细胞和动物体内转染转录因子核因子κBp65诱骗性寡核苷酸和反义寡核苷酸对平滑肌细胞增殖及大鼠颈动脉球囊损伤后血管新生内膜的干预作用。方法:实验于2001-05/2003-03在上海交通大学医学院细胞生物学实验室和瑞金医院心血管实验室完成。建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。SD大鼠126只随机数字表法分为7组,每组18只。正常对照组(除球囊损伤外,其余手术操作与其他组相同),反义组,正义组,诱骗组,诱骗对照组,反义加诱骗联合干预组,模型组。每组又分为术后6h,1,3,5,7,14d6个时相点,每个时相点3只。阳离子脂质体介导的核因子κBp65诱骗性寡核苷酸、反义寡核苷酸转染血管平滑肌细胞及局部定向转送至球囊损伤血管内,观察大鼠颈动脉球囊损伤后5-溴脱氧尿嘧啶掺入试验结果,大鼠颈动脉球囊损伤且转染不同寡核苷酸后的血管增殖标记物检测结果,大鼠颈动脉球囊损伤后核因子κBp65蛋白合成WesternBlot检测结果。结果:纳入动物126只,均进入结果分析。①核因子κB的反义寡核苷酸组、诱骗性寡核苷酸组、反义寡核苷酸加诱骗性寡核苷酸组细胞核蛋白增殖细胞核抗原的表达低于阳性对照组,差异均有显著性意义(分别为348.55±39.63,369.05±71.56,309.33±12.86,635.16±89.95,P<0.05);反义寡核苷酸组低于正义寡核苷酸组,差异有显著性意义(分别为348.55±39.63,752.11±76.43,P<0.05);诱骗性寡核苷酸组低于诱骗对照组,差异有显著性意义(分别为369.05±71.56,818.31±102.29,P<0.05);反义寡核苷酸和诱骗性寡核苷酸联合转染较单独作用显示增强的抗细胞增殖效应趋势,统计学上无差异。②血管球囊损伤后1d5-溴脱氧尿嘧啶掺入明显高于正常对照组和损伤后6h[分别为(22.52±0.21)%,(0.02±0.01)%,(4.16±0.22)%,P<0.05],球囊损伤后3d较其他时间点5-溴脱氧尿嘧啶表达最明显,为(48.71±0.22)%,差异均有显著性意义(P<0.05)。3d后5-溴脱氧尿嘧啶表达逐渐降低。③球囊损伤后3d正义组、反义组、诱骗组、诱骗对照组、反义加诱骗联合干预组、模型组增殖细胞核抗原表达明显高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为41.63±4.06,22.57±2.62,21.64±2.98,38.89±6.33,21.06±2.89,41.48±3.09,4.49±0.79,P<0.01);反义组低于正义组(P<0.05);诱骗组低于诱骗对照组(P<0.05);反义加诱骗联合干预组略低于反义组、诱骗组,但无统计学差异;反义组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组增殖细胞核抗原表达显著低于模型组,差异均有显著性意义(P<0.05)。④球囊损伤后3d正义组、反义组、诱骗组、诱骗对照组、反义加诱骗联合干预组、模型组5-溴脱氧尿嘧啶表达明显高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为56.23±2.00,28.97±1.14,26.64±2.89,48.89±2.28,21.06±2.89,51.48±3.09,14.49±0.79,P<0.05);反义组低于正义组(P<0.05);诱骗组低于诱骗对照组(P<0.05);反义加诱骗联合干预组低于反义组、诱骗组,差异有显著性意义(P<0.05);反义组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组5-溴脱氧尿嘧啶表达明显低于模型组,差异均有显著性意义(P<0.05)。⑤大鼠颈动脉损伤7d后,模型组、正义组、反义组、诱骗对照组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组核因子κBp65蛋白表达高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为1.86±0.03,1.67±0.10,1.25±0.01,1.51±0.01,1.41±0.07,1.19±0.02,0.84±0.01,P<0.05)。反义组低于正义组(P<0.05),诱骗组与诱骗对照组之间无差异。反义加诱骗联合干预组核因子κBp65蛋白表达低于诱骗组(P<0.05),与反义组相比无统计学差异。反义组、诱骗组、反义 诱骗联合干预组低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:核因子κBp65诱骗寡核苷酸和反义寡核苷酸均能抑制血管平滑肌细胞增殖。大鼠颈动脉球囊损伤后,血管细胞显示动态的增殖效应。核因子κBp65反义寡核苷酸抑制p65蛋白质生成,诱骗寡核苷酸对核因子κB生成无作用。     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

Chk1/2反义寡核苷酸对顺铂作用下K562细胞凋亡的影响

为了观察顺铂作用下细胞周期变化规律和Chk1／2反义寡核苷酸转染K562细胞后对顺铂诱导凋亡的影响，采用流式细胞术检测顺铂作用下K562细胞周期变化；以脂质体作为载体，转染Chk1／2反义寡核苷酸于K562细胞，用Western blot和共聚焦显微镜检测转染Chk1／2反义寡核苷酸后Chk1／2蛋白表达；用流式细胞术检测转染Chk1／2反义寡核苷酸后顺铂作用下细胞凋亡率。结果发现，10μmol／L顺铂作用下K562细胞出现S期阻滞，Chk1／2反义寡核苷酸对K562细胞中Chk1／2蛋白表达有明显抑制作用，转染Chk1／2反义寡核苷酸可明显增加顺铂诱导下K562细胞凋亡率，Chkl和Chk2联合转染作用优于单独转染。结论：Chk1／2可作为白血病增敏治疗的有效靶点。     

甲基化寡核苷酸诱导灭活RASSF1基因在肝癌发病机制中的应用

目的:甲基化寡核苷酸诱导灭活RASSF1基因并探索其启动子甲基化在肝癌发病机制中的应用。方法:将与RASSF1基因启动子互补的甲基化寡核苷酸转染至肝癌SMMC-7721细胞系内,分别采用BSP和RT-PCR检测转染前后RASSF1基因启动子甲基化状态和mRNA表达状况。结果:正常SMMC-7721细胞系RASSF1基因启动子表现无甲基化状态并表达相应mRNA。转染互补甲基化寡核苷酸后,相应CG位点被诱导成完全甲基化状态,mRNA表达明显受到抑制。结论:互补甲基化寡核苷酸可诱导基因启动子甲基化状态,RASSF1基因启动子甲基化在原发性肝细胞癌发病机制中扮演重要角色。     

ShRNA靶向沉默VEGFR1基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒载体介导shRNA(short harpin RNA,siRNA前体)靶向沉默血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响.方法 构建针对VEGFR-1基因干扰序列和无关序列的shRNA慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染293T细胞,包装产生的病毒液感染U937细胞(U937-shVEGFR-1 KD组).采用实时荧光定量PCR、Western blot法检测RNA干扰对U937细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达的影响;ELISA法检测细胞培养上清液VEGF表达水平的变化;CCK-8法检测常规培养条件下和不同浓度阿糖胞苷(Ara-C)作用下细胞增殖率和抑制率变化;流式细胞术检测经Ara-C作用后细胞凋亡率变化;Transwell小室检测不同条件下细胞迁移数量的变化.结果 成功构建VEGFR-1基因shRNA慢病毒载体,转染U937细胞后,U937-shVEGFR-1 KD组细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达均显著下降;细胞培养上清液VEGF表达水平明显下降,细胞增殖速度减慢;Ara-C作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞增殖抑制率及凋亡率较U937无关序列shRNA阴性对照(NC)组和U937空白对照(CON)组细胞明显增高.无药物及VEGF作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量均低于U937 NC组和U937 CON组细胞;Bevacizumab作用下,U937 NC组和U937 CON组细胞迁移数量降低,而U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量无明显变化.结论 慢病毒载体介导的shRNA干扰VEGFR-1基因可有效抑制U937细胞增殖、迁移,并能够增强U937细胞对Ara-C的敏感性.     

融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影响

背景:已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞。目的:观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。方法:应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPαmRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况。结果与结论:AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列。结果提示C/EBPα是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达。     

甲基化寡核苷酸诱导灭活RASSFl基因在肝癌发病机制中的应用

目的:甲基化寡核苷酸诱导灭活RASSFl基因并探索其启动子甲基化在肝癌发病机制中的应用.方法:将与RASSF1基因启动子互补的甲基化寡核苷酸转染至肝癌SMMC-7721细胞系内,分别采用BSP和RT-PCR检测转染前后RASSFl基因启动子甲基化状态和mRNA表达状况.结果:正常SMMC-7721细胞系RASSF1基因启动子表现无甲基化状态并表达相应mRNA.转染互补甲基化寡核苷酸后,相应CG位点被诱导成完全甲基化状态.mRNA表达明显受到抑制.结论:互补甲基化寡核苷酸可诱导基因启动子甲基化状态.RASSF1基因启动子甲基化在原发性肝细胞癌发病机制中扮演重要角色.     

融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影响

背景：已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞。目的：观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。方法：应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPαmRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况。结果与结论：AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列。结果提示C/EBPα是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达。     

融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影

背景:已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞.目的:观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用.方法:应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14 的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPα mRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况.结果与结论:AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b 和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列.结果提示C/EBPα是AML1-ETO 的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达.     

干细胞生长因子反义寡核苷酸对肝癌细胞中原癌基因蛋白质c-kit及碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的探讨干细胞生长因子(SCF)反义寡核苷酸对肝癌HepG2细胞中原癌基因蛋白质c-kit、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及意义。方法以脂质体作为转染载体,转染SCF反义寡核苷酸于HepG2细胞。实验分三组:(1)空白对照组;(2)转染SCF反义寡核苷酸组;(3)转染SCF错义寡核苷酸组。Western blot方法检测转染前后肝癌细胞中SCF、bFGF蛋白的表达,RT-PCR检测转染前后肝癌细胞中c-kit与bFGF mRNA的表达,用流式细胞仪检测转染SCF反义寡核苷酸后HepG2细胞凋亡率。结果与转染错义寡核苷酸组相比,SCF反义寡核苷酸对HepG2细胞中c-kit、bFGF的表达有明显抑制作用,转染SCF反义寡核苷酸可明显增加HepG2细胞凋亡率(P<0.01)。结论 SCF在肝癌细胞凋亡中有重要调节作用,SCF/c-kit有可能作为PI3K/Akt信号通路的上游对肝癌细胞bFGF的表达起重要调控作用。     

VEGF硫代反义寡核苷酸抑制U937细胞VEGF的表达

为研究硫代磷酸化修饰的血管内皮生长因子反义脱氧寡核苷酸 (VEGF ASODN)对急性单核细胞白血病细胞系U937VEGF表达的影响 ,将终浓度分别为 10 ,2 0 ,30 μmol/L的VEGF ASODN和错义序列与U937细胞分别孵育 2 4 ,4 8,72小时 ,采用RT PCR检测VEGFmRNA的表达 ,Westernblot检测VEGF蛋白的表达。结果显示 ,VEGF ASODN对U937细胞的VEGF的表达有明显的抑制作用 ,与错义序列组和空白对照组相比有显著差异 (P<0 .0 5 ) ;错义序列组与空白对照组VEGF的表达无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :VEGFASODN可下调白血病细胞株U937的VEGFmRNA和蛋白的表达水平。     

CD147对白血病细胞U937侵袭能力的影响

本研究探讨CD147对白血病细胞U937侵袭能力的影响。将U937细胞按照不同的处理方式分为以下4组：正常U937细胞组（对照组），脂多糖（LPS，50μg/ml）诱导组（LPS组），CD147单克隆抗体（10μg/ml）阻断组（CD147mAb组），LPS诱导及CD147单克隆抗体阻断组（LPS4-CD147mAb组）。使用RT—PCR和流式细胞术分别检测各组中CD147的mRNA和蛋白表达情况；应用RT—PCR和明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶（MMP）的表达及活性；采用体外细胞侵袭实验检测细胞运动和侵袭能力的变化；将DAPI标记的U937细胞经尾静脉注入SCID小鼠体内观察细胞在各组织器官中的转移情况。实验结果显示，LPS在体外能够诱导白血病细胞U937表面CD147的表达，同时增强MMP-2和MMP-9的表达、活化和分泌；使用CD147抗体阻断CD147后，MMP-2和MMP-9的分泌及活性下降；U937细胞经LPS诱导后，其体外侵袭能力增强；U937细胞经尾静脉注入SCID小鼠后发生肺部浸润和转移，并检测到CD147、MMP-2和MMP-9的表达增强，CD147抗体在一定程度上能够抑制上述现象。结论：LPS可诱导u937细胞表面CD147分子表达增加，CD147通过上调U937细胞MMP-2和MMP-9的分泌和活性促进U937细胞的侵袭和转移。     

硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡机制的深入研究

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡的机制。通过细胞计数检测细胞增殖,用流式细胞仪分析细胞周期和活性氧（ROS）水平,Westernblot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达。结果表明,10nmol／L硼替佐米联合50nmol／L阿糖胞苷对U937细胞有明显增殖抑制作用。两药联合协同诱导细胞凋亡。两药联合较单药处理能明显协同增加U937细胞ROS的水平,并能明显上调U937细胞中p-P38,p-JNK表达,下调p-ERK的表达。结论：硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡．其机制可能与R0s的损伤导致JNK、P38通路的激活和ERK的下调,从而影响细胞线粒体途径有关。     

维生素C增强氧化砷联用二甲萘醌诱导的U937细胞凋亡及其机制

目的 探讨维生素C是否可增强三氧化二砷（As2O3）联用二甲萘醌（DMNQ）对白血病细胞株U937的促凋亡效应及其机制。方法 以As2O3、维生素C、DMNQ不同组合孵育细胞，采用流式细胞仪及电镜检测细胞凋亡，并设立各种对照。结果 维生素C可增加As2O3联用DMNQ（10μmol/L）诱导U937细胞发生凋亡的比例（不加和加用维生素C细胞凋亡率分别为35.24%和61.20%）；过氧化氢酶可逆转这一效应；维生素C对DMNQ（20μmol/L）单独诱导U937细胞凋亡无影响。结论 维生素C在As2O3存在的情况下，通过活性氧依赖的途径，促进U937细胞凋亡。     

p73基因在甲氨蝶呤诱导髓性白血病细胞系U937细胞凋亡过程中的表达

为了探讨甲氨蝶呤（MTX）诱导U937细胞凋亡过程中p73 mRNA的表达变化，用MTX诱导U937细胞凋亡，凋亡指标采用细胞形态学、DNA片段电泳、流式细胞术检测DNA含量及细胞周期的变化等方法；采用半定量反转录PCR（RT－PCR）检测p73 mRNA的表达变化。研究结果显示：MTX可诱导U937细胞凋亡。5μmol/L的MTX作用于U937细胞6小时，可见部分细胞体积缩小，染色质明显浓缩和核碎裂。DNA片段电泳，MTX处理组可见清晰的梯形条带。流式细胞仪检测发现MTX作用于U937细胞，6，8，10小时，细胞的凋亡率分别为5．15％，11．43％和14．7％，并使细胞阻滞在G2／M＋S期，而对照组细胞不发生凋亡。半定量RT－PCR结果显示在U937细胞凋亡前后，p73 mRNA的表达无明显变化。结论提示，在MTX诱导U937细胞凋亡过程中，p73的mRNA水平表达差异无显性。     

阿糖胞苷联合冬凌草甲素诱导U937细胞株凋亡的初步研究

目的:探讨阿糖胞苷联合冬凌草甲素诱导白血病细胞株U937凋亡的作用。方法:用阿糖胞苷和冬凌草甲素单药或两药联合处理U937细胞后,采用细胞计数检测细胞增殖,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术分析细胞磷脂酰丝氨酸外翻情况和线粒体膜电位变化,蛋白印迹法检测凋亡相关分子表达情况。结果:阿糖胞苷和冬凌草甲素单药均能抑制U937细胞增殖,而两药联合抑制作用更加明显,两者能协同诱导U937细胞凋亡,并明显促进细胞磷脂酰丝氨酸外翻和线粒体跨膜电位下降;两药联合较单药组还能明显诱导Caspase-9、Caspase-3活化及PARP的剪切。结论:阿糖胞苷与冬凌草甲素能够协同抑制U937细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能是主要通过线粒体途径介导。     

短发夹RNA靶向抑制环氧化酶-2基因表达对肺癌细胞A549增殖的影响

目的评价短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）靶向肺癌细胞A549环氧化酶-2（COX-2）基因表达的抑制作用，并观察对肺癌细胞A。生长和细胞周期的影响。方法将抑制COX-2基因的shRNADNA模板插入到真核表达载体pGenesil-1的U6启动子下游，构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2。将试验分为3组：未转染肺癌细胞A549组、阴性对照HK组和pshRNA-COX-2转染组。用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染肺癌细胞A549逆转录（RT）-PCR和免疫印迹法（Wb）分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况，流式细胞术检测细胞周期，细胞计数检测细胞生长变化。结果与阴性对照组相比，pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2mRNA及蛋白表达的抑制率分别为72．2％和48．6％；G0-G1期细胞由63．7％上升为71．0％，S期细胞由26．5％下降为20．0％；细胞生长明显减慢。结论pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制肺癌细胞COX-2表达，引起G0-G1期细胞增多，S期细胞减少，从而抑制肺癌细胞生长。