兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及生长特性的初步研究

目的:探索兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离及培养扩增的方法。方法:骨髓穿刺法抽取雄性新西兰白兔髂骨骨髓5ml,联合应用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化MSC并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线。HE染色光镜观察细胞形态。结果:成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法,生长动力学分析发现,传代细胞随传代次数的增加,增殖能力逐渐下降。结论:兔MSC能在体外成功培养、扩增,可作为组织工程的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

大鼠骨髓基质细胞的体外分离、培养和鉴定的实验研究

目的:观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件及生物学特性并加以鉴定.方法:取Wistar大鼠骨髓,分离培养骨髓基质细胞(BMSC),相差显微镜下观察其形态,传代后观察其生长特性,用免疫组化方法加以鉴定.结果:原代培养20d后可分离得到BMSC,在5代以前生长形态相对稳定,典型的BMSC可分为两个类型.结论:BMSC具有贴壁生长特性,较易对其进行分离扩增,增殖速度快,可用于多种疾病的细胞治疗.     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及形态学观察

目的：对兔骨髓间充质干细胞进行体外分离培养,观察其形态学特征。方法：通过密度梯度离心联合贴壁培养法,对兔骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜观察其形态学特点。结果：体外培养的兔骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆。结论：兔骨髓间充质干细胞通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化,并表现为一定的形态学生长特征。     

豚鼠骨髓间充质干细胞分离培养及形态学观察

目的：分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞（MMSCs）,并通过观察了解其细胞生物学特性。方法：利用MMSCs和其它细胞不同的生长特性,采用细胞差速贴壁法,以含10%（体积分数）标准胎牛血清的L-DMEM培养基培养;用2.5%胰蛋白酶、37℃条件下消化,按1∶2的比例传代;倒置相差荧光显微镜下逐日观察各代MMSCs形态及生长情况。结果：经数次换液和连续传代培养,红细胞等杂质逐渐减少,可得到形态较均一的MMSCs,其增殖速度和细胞活性良好。结论：细胞差速贴壁法经济可靠、操作简单、易于掌握,是体外分离培养MMSCs的可行的实验方法;以此法获得的豚鼠MMMSCs生长旺盛,活性好,增殖能力强。     

两种培养方法在猪自体骨髓间充质干细胞培养的比较研究

目的 比较应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法.方法 取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状.结果 直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高.体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强.     

SD大鼠胚胎后肾间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的 对SD大鼠胚胎后肾间充质细胞(MMSCs)进行分离培养,并检测其生物学特性.方法 采用胚胎后肾微组织块接种培养法,检测其生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力的鉴定.结果 MMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力.细胞周期显示90%以上细胞处于G0/G1期.表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达波形蛋白(vimentin)和纤维连接蛋白(fibronectin),几乎不表达CD34.在体外能够向成骨细胞分化.结论 原代分离、培养的细胞为MMSCs,细胞纯度高、扩增迅速、生物学性状稳定,可为组织工程提供比较理想的种子细胞.     

猴骨髓间充质干细胞的分离及多向诱导分化

目的　探讨猴骨髓间充质干细胞 (MSCs)体外生长特性及多向分化潜力 .方法　以Percoll(质量密度 10 73g·L-1)非连续密度梯度离心分离出骨髓悬液中的MSCs,在非诱导条件下进行培养 ,观察细胞的形态、生长状况 .取原代体外培养3wk的MSCs分别向成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞及成肌细胞方向诱导 ,观察其诱导分化结果 .结果　原代培养的MSCs增殖缓慢 ,细胞增殖率和形态分化不均一 ,在培养过程中有多种形态的细胞出现 ,如伸展及增殖均不明显的圆形细胞 ,伸展充分但增值不明显的片状细胞、神经元样细胞 ,还可见增殖明显的克隆团状或条带状细胞群出现 .传代培养的MSCs细胞仍可见增殖情况及形态分化的多样性 ,但有“拉网”现象出现 .所培养的MSCs经诱导可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞发展分化 .结论　体外培养的猴MSCs细胞具有形态分化、增殖情况多样性的特点 ,并具有多向分化潜能 .     

体外分离和扩增兔骨髓间质干细胞及其生物学特性研究

目的　探讨体外培养兔骨髓间质干细胞 (MSC)生物学及培养方法 ,为组织工程研究奠定实验基础。方法　选用新西兰大白兔 ,于胫骨近端或股骨抽取骨髓 ,分离 ,扩增骨髓干细胞 ,原代培养后 ,将细胞按 1∶1比例传代培养 ,并用传 1～ 5代细胞按 1× 10 4种植于 96孔板内 ,绘制生长曲线 ,贴壁率 ,并加入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) ,测其促进MSC的增殖情况。结果　原代骨髓基质细胞生长状态良好 ,传代至第 5代仍保持干细胞形态特点 ,且生长曲线基本相同 ,bFGF可明显促进MSC的增殖 ,呈量效关系。结论　应用本实验方法 ,可无创获取兔MSC ,体外稳定扩增 ,生长速度快 ,表明兔MSC可作为骨 /软骨组织工程的种子细胞。     

鼠龄与骨髓间充质干细胞生物特性的关系研究

目的研究鼠龄对骨髓间充质干细胞(MMSCs)增殖特性的影响.方法用贴壁培养法分离纯化不同鼠龄的MMSCs,传代扩增,测定生长曲线,形态学观察,免疫组化鉴定,电镜观察MMSCs的超微结构.结果2月龄大鼠MMSCs集落形成率、增殖能力显著高于6月龄大鼠,细胞化学染色CD44、CD105均阳性,电镜支持幼稚细胞.结论 2月龄大鼠比6月龄大鼠更适于MMSCs的提取.     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

[目的]探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）方法,观察MSCs体外生长特征。[方法]自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1．073g／ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。[结果]MSCs在含10％小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。第2代（P2）末MSCs周期显示有82．4％的细胞处于G0／G1期。[结论]密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

Biological Characteristics of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Cultured in Vitro

Some biological characteristics of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) cultured in vitro were observed, hMSCs were isolated from bone marrow and purified by density gradient eentrifugation method, and then cultured in vitro. The proliferation and growth characteristics of hMSCs were observed in primary and passage culture. MSCs of passage 3 were examined for the purify by positive rate of CD29 and CD44 through flow eytometry. Human bone marrow MSCs showed active proliferation capacity in vitro. The purify of MSCs separated by our method was higher than 90%. It was concluded that hMSCs have been successfully cultured and expanded effectively. It provided a foundation for further investigation and application of MSCs。     

兔骨髓间质干细胞的体外分离、培养及活性鉴定

目的：建立一种体外分离培养自体兔骨髓间质干细胞（ Ｍ ａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍ ａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ｍ Ｓ Ｃｓ）的方法。方法：抽取兔骨髓液３～５ ｍ ｌ，经密度梯度离心得骨髓单个核细胞，以１６×１０４／ｃｍ ２ 细胞浓度培养，１２～１４ ｄ 后得到贴壁生长的单层细胞，随后进入传代培养，每传一代约 ５～７ ｄ。结果：原代培养的、以及传代后培养的细胞均为贴壁生长的、均匀一致的纺锤形细胞。两种细胞经体外特殊环境诱导后均可转化为骨髓网状间质细胞和成骨细胞。结论：该细胞经体外长期培养后仍具有多潜能转化活性，确系骨髓间质干细胞。为该细胞的广泛应用奠定基础。     

慢性高原病患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定

目的探讨慢性高原病（chronic mountain sickness,CMS）患者骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）的体外培养方法、生物功能及分子生物学特征。方法采用密度梯度离心和贴壁筛选法对15例CMS患者（CMS组）和15例正常人（对照组）骨髓MSCs进行分离培养,于倒置显微镜下观察MSCs形态,用流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,测定生长曲线。结果采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34、HLA—DR和CD20。CMS组MSCs增殖能力高于对照组（P〈0．01）,但传代率低于对照组（P〈0．05）,对P3代细胞生长曲线进行观察发现CMS骨髓MSCs生长较对照组活跃。结论CMS患者骨髓MSCs在体外可有效分离培养,所培养扩增的细胞成分单一,CMS患者骨髓MSCs具有其特有的生物学特性。     

人关节软骨来源CD105~+/CD166~+间充质干细胞的分选及其多向分化特性的鉴定

目的 建立免疫磁珠技术高效分选人关节软骨CD166~+/CD105~+间充质干细胞(MSCs)的方法,并鉴定其多向分化特性.方法 酶消化法获取5例手术切除的膝关节软骨组织细胞,并行原代(P~0代)和传代(P~2、P~4、P~6代)培养;流式细胞仪检测其中CD166~+/CD105~+细胞百分比.比较免疫磁珠连续法与间断法分选P~4代培养细胞中CD166~+/CD105~+细胞的所需时间、分选细胞活度及其百分比和收获率.对连续法分选CD166~+/CD105~+细胞进行成骨、成软骨、成脂肪诱导,Gomori钙钴法碱性磷酸酶(Ale)、Ⅱ型胶原免疫组化、油红O染色检测其分化特性.结果 人关节软骨组织分离细胞和原代培养细胞中的CD105~+/CD166~+细胞百分比较低[(1.13±0.68)%、(5.16±3.59)%],传代培养细胞中的CD105~+/CD166~+细胞百分比随传代次数增加而明显增高[P~2、P~4、P~6代培养细胞中CD166~+/CD105~+细胞百分比分别为(12.68±2.59)%、(17.81±3.80)%、(19.36±3.93)%](P<0.05),传代培养至P~4代,其CD105~+/CD166~+细胞百分比与P~6代[(19.36±3.937)%]比较差异不显著(P>0.05).免疫磁珠连续法分选P4代培养细胞中CD105~+/CD166~+细胞的百分比高于间断分选法[(93.8±3.95)%vs(90.1±2.43)%,P<0.05],且分选时间显著缩短[(6.8 ±0.40)h vs (120.0±10.21)h,P<0.01),而细胞收获率[(62.0±7.5)% vs (68.5±7.0)%]和细胞活度[(93.8±1.48)% vs (94.6±1.14)%1差异不显著(P>0.05).连续法分选CD166~+/CD105~+细胞成骨诱导后ALP染色阳性;成软骨诱导前Ⅱ型胶原弱阳性,诱导后Ⅱ型胶原附性;成脂肪诱导后,细胞内可见脂肪滴,油红O染色阳性.结论 人关节软骨P~4、P~6代培养细胞中的MSCs比例较高.免疫磁珠连续法能够高效了分选人关节软骨MSCs,所分选的MSCs具有成骨、成软骨及成脂肪分化功能.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

目的：探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stemcells,MSCs）的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法：选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法（直接贴壁法）分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105这4种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU）体外标记兔MSCs,检测其标记阳性率。结果：全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7～8d MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4～8d为高速生长期,MSCs在第3～5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34（-）、CD45（-）、CD44（＋）、CD105（＋）,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85%～90%。结论：应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。     

巴马香猪骨髓间充质干细胞的分离扩增及初步鉴定

目的建立巴马香猪骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分离、培养、扩增的方法,并进行鉴定。方法采用梯度离心法分离并结合贴壁筛选法传代纯化培养猪的MSCs;采用倒置相差显微镜观察MSCs的形态学特征;流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD71、CD34的表达率。结果原代培养的MSCs于6h后贴壁,贴壁细胞呈集群生长趋势。培养7～9d后可见细胞融合,14～21d达到95％融合。第3代细胞表面标记物CD71阳性率为95％,CD34阳性率为O％。结论采用全骨髓梯度离心法分离并结合贴壁筛选法能够成功分离和培养巴马香猪的MSCs,在第3代可获得高纯度MSCs。