甲基硝基亚硝基胍对日本血吸虫成虫培养细胞骨架作用的研究

目的 通过观察N－甲基－N－硝基－N－亚硝基胍（MNNG）诱导日本血吸虫培养细胞后骨架的改变,研究MNNG对培养细胞转化、增殖的作用。方法 将日本血吸虫成虫培养细胞接种于小盖玻片上,培养1周时用浓度为3mg/L的MNNG处理48h,然后用RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗菌素的培养基培养2周,再换用RPMI－1640含5％小牛血清的培养基继续培养,用考马斯亮兰染色法和鬼笔环肽荧光染色法显示培养细胞骨架。结果 MNNG诱导后,在培养第4、5周时部分培养细胞骨架排列紊乱,微丝集聚于细胞边缘。结论 MNNG有一定诱导日本血吸虫成虫培养细胞转化、促进其分裂的作用。     

改良人原生殖细胞培养基培养日本血吸虫生殖类细胞的初步研究

目的探讨改良人原生殖细胞（human primordial germ cells,HPGC）培养基培养日本血吸虫（Schistosoma ja-ponicum,Sj）生殖类细胞的可行性。方法用HPGC培养基和改良HPGC培养基,分别对日本血吸虫36d成虫全细胞进行选择性培养,比较观察培养细胞的生长特性和一般形态,对2种培养基培养4-6周的细胞进行超微结构和AKP染色鉴定,对改良HPGC培养基培养细胞用BrdU掺入法检测细胞增殖与染色体核型分析。结果HPGC培养基培养2周后出现形态和大小较均匀的细胞,6周时多数细胞死亡或崩解;培养4周的细胞超微结构显示异常形态,APK染色呈阳性反应。改良HPGC培养基培养细胞呈半悬浮集落状态,4周内生长较快,形态差异悬殊,随着培养期延长,细胞呈相似的圆形,核和核仁清晰;培养6周后,细胞生长速度减慢,细胞核逐渐消失,至第10周左右死亡;培养8周内均可见细胞分裂相。BrdU掺入法检测培养4周细胞可见细胞核酸合成;培养5周的细胞超微结构显示正常形态,具生殖类细胞特征（胞质中可见大小不等的囊泡）,细胞染色体核型表现血吸虫单倍体和双倍体特征;培养6周的细胞AKP染色呈强阳性反应。结论用HPGC改良培养基能使日本血吸虫成虫的某些类别的细胞增殖,该类细胞具有生殖类细胞的部分特征。     

不同化学染色法对日本血吸虫虫卵染色的效果分析

目的探索不同化学染色法对日本血吸虫虫卵染色的效果,以期获得在镜检下可分辨虫卵和粪渣的染色方法,为粪检血吸虫虫卵的计算机自动化识别奠定基础。方法用AO-EB、罗丹明、中性红、酸性品红、甲苯胺兰、台盼蓝、考马斯亮蓝和孔雀绿等化学染料,选择3个不同浓度和2个不同温度条件,分别对含日本血吸虫虫卵粪液进行染色、涂片镜检,用虫卵和粪渣反差程度作为主要评价指标,比较各种方法的染色效果。结果在8种化学染色方法中,以AO-EB染色和中性红染色的虫卵与粪渣其反差最大,镜下粪涂片中虫卵易于辨认,AO-EB法和中性红法的检出率分别为67.5%和65.0%,明显高于改良加藤法的检出率(40.0%)。结论AO-EB法和中性红染色法有助于提高粪检血吸虫虫卵检出率。     

改良人原生殖细胞培养基培养日本血吸虫生殖类细胞的初步研究

目的 探讨改良人原生殖细胞(human primordial germ cells,HPGC)培养基培养日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)生殖类细胞的可行性.方法 用HPGC培养基和改良HPGC培养基,分别对日本血吸虫36d成虫全细胞进行选择性培养,比较观察培养细胞的生长特性和一般形态,对2种培养基培养4～6周的细胞进行超微结构和AKP染色鉴定,对改良HPGC培养基培养细胞用BrdU掺入法检测细胞增殖与染色体核型分析.结果 HPGC培养基培养2周后出现形态和大小较均匀的细胞,6周时多数细胞死亡或崩解;培养4周的细胞超微结构显示异常形态,APK染色呈阳性反应.改良HPGC培养基培养细胞呈半悬浮集落状态,4周内生长较快,形态差异悬殊,随着培养期延长,细胞呈相似的圆形,核和核仁清晰;培养6周后,细胞生长速度减慢,细胞核逐渐消失,至第10周左右死亡;培养8周内均可见细胞分裂相.BrdU掺入法检测培养4周细胞可见细胞核酸合成;培养5周的细胞超微结构显示正常形态,具生殖类细胞特征(胞质中可见大小不等的囊泡),细胞染色体核型表现血吸虫单倍体和双倍体特征;培养6周的细胞AKP染色呈强阳性反应.结论 用HPGC改良培养基能使日本血吸虫成虫的某些类别的细胞增殖,该类细胞具有生殖类细胞的部分特征.     

中国与日本不同地域品系日本血吸虫蛋白组分的SDS-PAGE和EITB分析

目的： 补充观察我国浙江、江西、台湾省和日本山梨的日本血吸虫成虫的蛋白组分, 以及上述４ 地和安徽、湖北、四川、云南省血吸虫与广西省钉螺和日本钉螺抗血清的反应性。方法： 采用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ＳＤＳ－ＰＡＧＥ） 和酶联免疫电转移印迹 （ＥＩＴＢ） 分析。结果与结论： 浙江、江西、台湾省和日本的血吸虫隔离群雄虫及雌虫抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后, 以考马斯亮蓝染色结果分别可见７～１７ 条（江西省和日本的血吸虫雄虫条带显色很淡） 及１～６ 条显色带;银染结果分别可见１４～２３条及４～１９ 条（台湾省的血吸虫雌虫仅见１条极淡的）显色带。台湾省血吸虫雄虫与浙江省血吸虫雄虫谱型相似, 但在８１ ｋＤａ以上组分有所不同, 江西省血吸虫雄虫５４ｋＤａ 条带明显, 日本的血吸虫雄虫不仅条带少, 谱型也与浙江、江西及台湾省的血吸虫各异。ＥＩＴＢ结果： 所试血吸虫成虫与广西省钉螺和日本的钉螺抗血清均产生反应, 证明存在交叉反应抗原组分。所试血吸虫成虫与广西省钉螺和日本的钉螺间存在共同抗原组分。     

日本血吸虫成虫培养细胞SDH和LDH细胞化学研究

目的　研究日本血吸虫成虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (LDH)含量、分布及变化规律 ,了解日本血吸虫成虫培养细胞的能量代谢类型。方法　将虫龄 2 6d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上 ,培养于RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清附加常量抗生素的培养基中 ,定时运用Pearson法进行SDH和LDH染色 ,用Olympus-BH2 显微镜观察并拍照 ,用HPIAS - 2 0 0 0图像分析仪测量其含量 ,并作统计分析。结果　日本血吸虫成虫培养细胞均具有SDH和LDH活性 ,两者均分布在细胞质内。培养 1d细胞的SDH和LDH活性最强 ,随着培养时间延长 ,其活性逐渐减弱 ,其中SDH活性下降较快 ,培养 5d大部分细胞SDH活性已极弱 ;而LDH活性下降则较缓 ,培养 5 6d细胞仍具LDH活性。结论　体外培养的日本血吸虫成虫细胞的能量代谢类型与成虫相似 ,既存在三羧酸循环需氧型呼吸链 ,也具有无氧糖酵解 ,但以无氧糖酵解为主。     

日本血吸虫血红素加氧酶活性及免疫组化研究

目的　探讨日本血吸虫成虫是否具有血红素加氧酶 (HO)活性 ,并对其进行免疫学定位。方法　从日本血吸虫成虫匀浆中提取微粒体蛋白 ,与HO的特异性底物氯化血红素共孵育 ,观察血红素的降解情况及 pH值对降解活性的影响。制作日本血吸虫成虫组织切片和培养细胞涂片 ,用间接免疫荧光法及碱性磷酸酶免疫细胞化学试验研究HO在血吸虫体内的分布。结果　成虫的微粒体蛋白可在体外将血红素降解为胆红素 ,酶活性为 5 6 7nmol/(mg·min) ,最适 pH为 8 7。成虫组织切片显示 ,特异性荧光在虫体内呈散在性分布 ,细胞碱性磷酸酶免疫染色试验表明该酶位于成虫的细胞质。结论　首次证实日本血吸虫具有HO。     

日本血吸虫成虫呕吐和排泄分泌物的蛋白质组学分析

目的探讨日本血吸虫成虫呕吐物和排泄分泌物的蛋白质组成,寻找高丰度蛋白分子。方法将日本血吸虫成虫浸泡于无菌水中15～30min,收集成虫的呕吐和排泄分泌物。通过蛋白质二维电泳,考马斯亮蓝染色与飞行质谱分析,确定各蛋白点的基因种类。结果日本血吸虫成虫的呕吐及排泄分泌物的二维电泳获得1012个蛋白斑点,456个斑点的蛋白质种类被质谱分析成功鉴定。这些蛋白可归为139种,其中76种为虫源性蛋白,主要是由一些与血吸虫生命代谢、生长发育、免疫调控相关的蛋白组成,其中烯醇化酶、70kDa热休克蛋白(HSP70)、果糖二磷酸醛缩酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、谷胱甘肽转移酶、抑免蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶、14-3-3蛋白等含量丰富,是高丰度的排泄分泌蛋白。结论本研究揭示了日本血吸虫成虫呕吐和排泄分泌物的蛋白组成,为进一步开发用于控制血吸虫病或其他寄生虫病的疫苗、新的治疗药物及诊断方法创造了条件。     

丝状真菌Pythium sp.GY1938菌株蛋白图谱染色方法的比较及优化

目的探索制备灭蚊丝状真菌Pythiumsp.GY1938菌株菌丝体可溶性蛋白图谱的最佳染色方案。方法采用不同的破壁方法制备Pythiumsp.GY1938菌丝体可溶性蛋白,并通过SDS-PAGE进行蛋白质电泳分离,进一步采用考马斯亮蓝R-250染色法、Vorum银染法、EMBL银染法、Blum银染法4种染色方案分别进行凝胶染色,对不同染色方案的染色效果进行分析和比较。结果对于Pythiumsp.GY1938菌丝体可溶性蛋白样品中的中、高分子质量蛋白(≥44ku),考马斯亮蓝R-250的染色效果较好,且简单、快捷;对于低分子质量(<44ku)的可溶性蛋白,Vorum银染法染色效果较好;Blum银染法和EMBL银染法的染色效果均不理想。结论考马斯亮蓝R-250染色法和Vorum银染法均可应用于Pythiumsp.GY1938菌丝体可溶性蛋白图谱的制备,前者适合对中、高分子质量蛋白染色,后者适合对低分子质量蛋白染色。     

肝基质与MNNG对日本血吸虫成虫培养细胞糖细胞化学作用的研究

目的研究肝基质与甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质的影响。方法日本血吸虫成虫细胞分别接种于普通小盖玻片(实验1组)和铺敷有肝基质的小盖玻片上(随机分为实验2组和3组),培养于含20%小牛血清及常量抗生素的RPMI-1640常规培养基中。培养第4d,实验1组和3组细胞分别在含3μg/ml MNNG的常规培养基中培养48h,彻底清洗后继续用常规培养基培养;实验2组细胞用不含MNNG的常规培养基处理相同时间。培养第4w,均换用含5%小牛血清的低血清培养基培养。培养第5~7w,每周取各组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和唾液淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的含量及分布变化。取培养第6w(MNNG作用后第5w)的各组染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖含量的光密度,并作统计学分析。结果实验3组细胞与实验1、2组比较,PAS染色显示的四种类型细胞其着色均显著增强,淀粉酶处理后的PAS染色显示细胞内糖原含量增多,差异均具显著性(P<0.01)。培养过程中,第二类细胞数目逐渐增多,体积增大;分裂细胞增多。这种状况在MNNG处理后第5w最为明显。结论肝基质和MNNG联合可显著增强日本血吸虫培养细胞的糖代谢和分裂增殖能力,二者具协同作用能力。     

正交试验法筛选日本血吸虫细胞的培养条件

目的　筛选日本血吸虫成虫细胞的培养条件及评价细胞培养条件优劣的指标。方法　以琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(L DH)和葡萄糖- 6 -磷酸脱氢酶(G- 6 - PDH )为指标,运用正交试验法进一步研究合成培养基、细胞外基质和血清浓度3个因素在3个不同水平对虫龄为2 1d的日本血吸虫细胞的影响。培养第5天对日本血吸虫培养细胞进行SDH染色;培养第14天分别进行L DH、G- 6 - PDH染色,Olympus- BH2 显微镜观察并拍照,HPIAS- 2 0 0 0图像分析仪测量其含量,用SPSS10 .0作统计分析。结果　不论以SDH或L DH,还是G- 6 - PDH为指标,均显示RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。血清浓度对培养细胞酶活性的影响最大,其次是细胞外基质(ECM) ,影响最小的是合成培养基。其中,血清浓度对3种酶活性的影响差异均显著;基质对SDH、L DH活性的影响差异显著,而对G- 6 - PDH活性的影响差异不显著;合成培养基的影响均无差异。结论　RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。选择3种酶中任一,均可用来评价日本血吸虫细胞培养条件的优劣。     

肝基质对日本血吸虫培养细胞生长的影响

目的研究肝基质对日本血吸虫培养细胞形态、增殖的影响.方法联合法将虫龄为21 d的日本血吸虫童虫细胞接种于预先铺敷有肝基质(实验组)和未铺敷肝基质(对照组)的小盖玻片上,培养于常规培养基中,用高碘酸雪夫(PAS)法染色培养细胞,Olympus-BH2显微镜下观察并拍照;并将接种第3天的实验组和对照组培养细胞用胶银法进行核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)染色,HPIAS 2000图像分析仪测定AgNORs平均光密度值进行图像分析.结果实验组中的培养细胞其细胞质突起和分裂细胞增多,AgNORs的平均光密度值显著高于对照组细胞(P＜0.01).实验组的细胞分裂方式除常见的一分为二方式外,还观察到一分为三的多极分裂方式;而对照组未观察到分裂细胞.结论肝基质可明显影响日本血吸虫培养细胞的形态,显著促进培养细胞的增殖.     

肝基质鼠尾胶对日本血吸虫培养细胞AKP和ACP影响的研究

目的 研究肝基质、鼠尾胶对日本血吸虫成虫培养细胞碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响,筛选适合日本血吸虫细胞培养的基质。方法 将虫龄28d的日本血吸虫成虫细胞,接种于预先铺敷有肝基质和鼠尾胶的小盖玻片上常规培养,未铺敷基质者作对照。运用酶细胞化学方法,分别于培养5、14、21、35d对日本血吸虫成虫培养细胞进行AKP和ACP染色,显微镜下观察并拍照,图像分析仪测定其含量,并作统计分析。结果 铺敷的基质不同,培养细胞的AKP和ACP活性不同。AKP、ACP着色深浅均按对照组、鼠尾胶组、肝基质组依次加深。定量分析显示,培养14d内,肝基质组与鼠尾胶组细胞AKP活性明显高于对照组(肝基质组P<0.01;鼠尾胶组P<0.05);两基质组培养细胞之间差异也有显著性(P<0.05)。培养21d后,肝基质组细胞AKP活性分别高于鼠尾胶组和对照组(P<0.01);后两者培养细胞之间的AKP活性无明显差异(P>0.05)。培养5d细胞的ACP活性,肝基质组与鼠尾胶组明显高于对照组(P<0.05),两基质组相互比较差异无显著性(P>0.05);培养14d后,各组之间两两比较均有差异(P<0.05),肝基质组培养细胞ACP活性最强,鼠尾胶组次之,对照组最弱。结论 肝基质较为适合日本血吸虫培养细胞的存活与生长。     

血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老及对细胞骨架的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老及对细胞骨架的影响。方法体外培养HUVEC,采用CCK-8法检测细胞存活率,用AngⅡ干预,分为对照组、10mol/LAngⅡ诱导组(AngⅡ组)。主要观察衰老相关β-半乳糖苷酶活性和细胞的增殖能力。β-半乳糖苷酶活性采用免疫化学染色方法,流式细胞术检测细胞增殖能力;考马斯亮蓝染色显示内皮细胞骨架,利用Western blot印迹法分析波形蛋白表达的变化。结果与10~(-6)mol/L AngⅡ细胞存活率(77.15±6.83)%比较,10~(-5)mol/L AngⅡ存活率(55.61±7.92)%明显降低(P<0.01);AngⅡ组β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数目明显增加(P<0.001),流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0/G1期[(80.11±7.92)%];AngⅡ组细胞骨架及波形蛋白较对照组明显降解。结论 AngⅡ可以诱导HUVEC衰老,其分子机制可能与细胞骨架蛋白裂解有关。     

用组织化学方法鉴别日本血吸虫细胞来源的研究

目的　探讨用组织化学方法鉴别血吸虫体外培养细胞来源或种类的可能性。　方法　取日本血吸虫肝期童虫,经酶消化处理后取混合细胞涂片,用成虫制作组织切片。将细胞涂片和组织切片分别平行作高碘酸希夫氏(PAS)、硫堇 (Thionin)、嗜银反应(根据Grimelius)、苦味酸 酸性品红(根据VanGieson,VG)、甲苯胺蓝(Tolui dineblue,TB)和苏木素伊红(HE)6种组织化学方法染色。光镜下比较观察,判定结果。　结果　PAS染色的大细胞呈亮红色与组织切片中卵黄腺着色接近,表明着色的大细胞来源于卵黄腺;含特有尼氏体的神经细胞胞浆被硫堇染色呈深蓝色 ;Grimelius染色的细胞和消化道上皮细胞均呈黑色;VG染色,部分细胞和虫体肌纤维组织均呈黄色;TB染色,细胞涂片仅见1个紫红色细胞,组织切片未见相同颜色的组织和细胞。　结论　PAS、硫堇、Grimeliu s、VG、TB和HE 6种组织化学染色,对体外培养的血吸虫细胞的显色特征与虫体相应器官或组织细胞的化学染色定位相一致。本法可用于鉴别血吸虫体外培养细胞的来源或种类,且操作简便、快速。