RNA干扰沉默Sp1基因抑制大肠癌SW620细胞的恶性增生

目的采用RNA干扰技术沉默大肠癌SW620细胞转录因子特化蛋白1（Sp1）的表达,观察其对细胞增生的影响。方法构建靶向人Sp1基因的干扰载体（pGenesil-1-Sp1）,脂质体介导转染SW620细胞,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用实时荧光定量PCR和Western blotting检测其对Sp1 mRNA及蛋白质水平的影响,MTT法检测SW620细胞增生活性的改变。结果成功构建针对Sp1的干扰载体,转染后能够有效抑制大肠癌SW620细胞中Sp1 mRNA和蛋白的表达,且在转染48h抑制作用最强,其对Sp1 mRNA和蛋白质抑制率分别为68．47％和73．82％,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。MTT实验显示,下调Sp1表达可显著抑制大肠癌SW620细胞的体外增生能力。结论Sp1基因沉默能够抑制人大肠癌SW620细胞的增生,为以Sp1为靶点的大肠癌基因治疗提供新的思路和手段。     

AP-2α基因转染对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响

目的 探讨AP-2α基因对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响.方法 构建PODNA3.1(+)-AP-2α真核表达载体,利用脂质体介导pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)转染5W480细胞,并以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR与Western blotting分别检测转染48 h后各组细胞中AP-2αmRNA与蛋白的表达情况;采用平板克隆、软琼脂克隆形成试验以及Transweil侵袭试验,分别检测各组细胞体外增生及侵袭能力.结果 SW480细胞内源性AP-2α蛋白表达缺失;转染AP-2α基因后,在SW480细胞中可检测到高水平的AP-2αmRNA及蛋白,细胞克隆形成率降低(P<0.05),软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 转染AP-2α基因可以抑制人类结肠癌SW480细胞的体外恶性增生以及侵袭能力.     

联合转染PTEN与PINCH siRNA对结直肠癌细胞增殖、侵袭及凋亡影响的机制研究

目的:研究联合转染PTEN与PINCH siRNA对结直肠癌SW620细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法:在结直肠癌SW620细胞中转染pcDNA-PTEN或/和si-PINCH,qRT-PCR检测PINCH和PTEN mRNA的表达,Western blot检测PINCH、PTEN、CDK1、MMP-2、Bcl-2和 Bax蛋白表达, MTT法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭能力和凋亡率。结果:在结直肠癌SW620细胞中联合转染pcDNA-PTEN和si-PINCH后,PTEN的mRNA和蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,PINCH的mRNA和蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;转染pcDNA-PTEN或/和si-PINCH均可抑制SW620细胞增殖和侵袭并促进细胞凋亡,抑制SW620细胞内增殖蛋白CDK1、侵袭蛋白MMP-2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进凋亡蛋白Bax的表达;联合转染pcDNA-PTEN和si-PINCH比单独转染pcDNA-PTEN或si-PINCH效果更显著。结论:联合转染pcDNA-PTEN和si-PINCH可抑制结直肠癌SW620细胞增殖和侵袭并促进细胞凋亡,且比单独转染效果更显著。     

RNAi干扰AP-2α对人乳腺癌细胞HER2表达及细胞增殖的影响

目的探讨RNAi干扰转录因子AP-2α对乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER2表达及细胞增殖的影响。方法通过siRNA抑制MDA-MB-453细胞中AP-2α的表达,采用半定量RT-PCR和Western blot法,检测其对HER2表达的影响,采用MTT法测定细胞增殖情况。结果siRNA抑制AP-2α表达后,HER2 mRNA及其蛋白水平显著下降,RNAi干扰组与对照组比较MDA-MB-453细胞生长明显受抑制（P〈0.01）。结论AP-2αsiRNA可以下调乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER2 mRNA及其蛋白的表达水平,抑制MDA-MB-453细胞的生长,提示AP-2α基因在乳腺癌细胞的发生、发展中具有重要作用,AP-2α可能是HER2过量表达乳腺癌的治疗靶点。     

miR-30c表达调控对大肠癌细胞生物学行为的影响及其机制探讨

目的:探讨上调miR-30c的表达对大肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响及可能的机制。方法:将miR-30c模拟物转染CRC细胞株SW620,qRT-PCR方法检测转染后miR-30c的表达,CCK-8法检测细胞增殖情况,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变,qRT-PCR和Western blot检测转染后SNAI2 mRNA和蛋白的表达。结果:转染miR-30c模拟物后,SW620细胞的miR-30c表达明显增高,细胞增殖减少（P＜0.05）,凋亡增加（P＜0.05）,侵袭能力显著降低（P＜0.05）。SNAI2 mRNA及蛋白表达水平明显下调,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:SW620细胞miR-30c表达上调,可抑制细胞增殖和侵袭、诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制SNAI2表达相关。     

siRNA敲减NEK2表达可提高结直肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性

目的：探讨敲减中心体相关激酶2（never in mitosis A-related kinase 2,NEK2）对结直肠癌细胞5-FU化疗敏感性的影响及其可能的机制。方法：采用 qPCR 和 Western blotting 检测结直肠癌细胞中 NEK2 mRNA 及蛋白的表达水平。构建针对NEK2基因的小干扰RNA（siRNA）并转染至结直肠癌细胞HCT116及SW620,实验分为阳性干扰组1（转染NEK2 siRNA1）、阳性干扰组2（转染NEK2 siRNA2）和阴性对照组（转染si-NC）,均用5-FU处理。采用CCK-8实验、V-FICT/PI Annexin双染色流式细胞术实验观察敲减NEK2基因对5-FU作用下结肠癌细胞的增殖、周期分布及凋亡的影响,采用Western blotting检测敲减NEK2基因对5-FU作用下结直肠癌细胞内Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。结果：NEK2蛋白及mRNA在结直肠癌细胞HCT116、SW620中均呈高表达（P<0.05或P<0.01）,转染NEK2 siRNA可高效抑制HCT116、SW620细胞中NEK2蛋白及mRNA表达（均P<0.01）。经不同浓度5-FU作用后,阳性干扰组1和阳性干扰组2的细胞存活率和IC50均显著低于阴性对照组（均P<0.01）,细胞发生G0/G1期阻滞且凋亡率显著升高（均 P<0.01）,胞核 β-catenin、c-myc 和 cyclin D1 表达水平显著下降而胞质β-catenin表达水平升高（均P<0.01）。结论：敲减NEK2基因可有效提高人结直肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性,该作用可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达来实现的。     

Id1 和Id3 协同诱导结肠癌SW620 细胞EMT并影响其侵袭与迁移

目的：探讨分化抑制因子1 基因（inhibitor of differentiation-1, Id1）和Id3 是否协同促进结肠癌SW620 细胞EMT和细胞的侵袭迁移能力及其可能的机制。方法：利用慢病毒载体构建Idl 和Id3 单或双基因敲减的结肠癌SW620 细胞,实验分为4组：SW620-Sh-Id1 组（转染shRNA-Id1）、SW620-Sh-Id3 组（转染shRNA-Id3）、SW620-Sh-Id1-Id3 组（共转染shRNA-Id1 和shRNAId3）、SW620-NC组（转染阴性空载慢病毒）。用qPCR 法和Western blotting 法分别检测敲减效果,显微镜下观察稳定下调Idl 和Id3 后SW620 细胞形态的变化,划痕愈合实验和Transwell 小室法检测SW620 细胞迁移和侵袭的变化,Western blotting 检测EMT标志分子及迁移、侵袭相关蛋白的表达。结果：成功构建了Idl 和Id3 单基因敲减与双基因敲减的结肠癌SW620 细胞株。（1）Idl和Id3 的敲除诱导SW620 细胞形态由上皮样向间质样转变;（2）与对照组相比,SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组SW620 细胞侵袭和迁移的能力显著下降(均P<0.05);SW620-Sh-Id1-Id3 组细胞侵袭和迁移的能力较SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组也明显下降(均P<0.05);（3）与对照组相比,SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组β-catenin、snail1 及MMP2 蛋白表达降低,上皮黏蛋白及TIMP2 蛋白表达增高(均P<0.05);SW620-Sh-Id1-Id3 组与SW620-Sh-Id1 组和SW620-Sh-Id3 组相比,β-catenin、snail1 及MMP2蛋白表达也下降,同时上皮钙黏蛋白及TIMP2 蛋白表达也增高(均P<0.05)。结论：Id1 和Id3 可能通过诱导EMT协同影响结肠癌SW620 细胞侵袭与迁移的能力。     

ERβ1对乳腺癌MCF-7细胞Efp基因表达的抑制作用

目的 了解雌激素受体β1（ERβ1）对雌激素敏感性指状蛋白（Efp）基因的调节作用,为进一步探讨ERβ对Efp基因的调控机制奠定基础.方法 应用脂质体法将ERβ1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞中,再用Western blot检测转染细胞中Efp蛋白表达的变化.MTT比色试验观察ERβ1真核表达质粒转染后MCF-7细胞增殖活性的变化.结果 外源性ERβ1真核表达质粒组MCF-7细胞较未转染组MCF-7细胞Efp蛋白表达明显减弱.ERβ1基因转染后的MCF-7细胞的增殖活性降低.结论 ERβ1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞中Efp基因的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖能力,可能在乳腺肿瘤发生、发展机制中具有重要的作用.     

沉默BRCAA1基因对胃癌MGC-803细胞的抑制作用及其可能的机制

目的：研究沉默乳腺癌相关抗原1（breast cancer—associated antigen1，BRCAA1）基因对胃癌细胞株MGC-803的抑制作用及其可能的机制。方法：构建BRCAA1基因shRNA载体，将构建的shRNA—BRCAAI质粒与阴性对照质粒shRNA—N转染胃癌MGC-803细胞，24h后用荧光显微镜观察转染效率，实时定量PCR检测BRCAA1和GAPDH基因mRNA表达水平。MTT法检测转染后24、48与72h的细胞增殖水平，Annxin—VPE／7AAD检测转染24h后的细胞凋亡水平，Westernblotting检测转染48h后细胞的凋亡相关蛋白表达水平。结果：BRCAA1siRNA表达质粒转染MGC-803细胞24h的转染效率为（81．2&#177;2．6）％。转染后48hMGC．803细胞的BRCAA1mRNA水平下降了61．4％，MGC-803细胞增殖的抑制率达45．0％，转染siRNA细胞的凋亡率明显高于未转染细胞和对照质粒转染细胞[（14．4&#177;1．6）％vs（5．4&#177;2．0）％，（4．4&#177;2．5）％，P〈0．05]。转染siRNA细胞的凋亡相关蛋白Rb与Bax的表达量显著增加（P〈0．05），Bcl-2的表达量显著减少（P〈0．05）。结论：BRCAAI基因的沉默可有效抑制人胃癌MGC．803细胞的增殖和诱导细胞凋亡，其机制与其促进Rb和Bax蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达有关，     

RNAi 抑制GSK-3β 基因表达增强卵巢癌 SKOV3细胞对紫杉醇敏感度的研究

 目的构建GSK-3β基因特异性短发卡状（shRNA）干扰载体,观察RNA干扰技术对卵巢癌SKOV3细胞 GSK-3β基因表达的抑制作用,并且探讨促进紫杉醇药物敏感度的机制。 方法设计合成并构建针对GSK-3 β mRNA的特异性shRNA干扰质粒,将干扰质粒转染SKOV3细胞。筛选稳定转染的单细胞扩大培养,应用 RT-PCR、Western blot方法检测各组细胞GSK-3β表达抑制情况。流式细胞学检测法（FACS）检测细胞凋 亡率。比较抑制GSK-3β 基因前后卵巢癌SKOV3细胞抵抗紫杉醇药物的差异。结果成功构建pGSK3β-shRNA 干扰载体。SKOV3 细胞转染pGSK3β-shRNA干扰载体后,RT-PCR、Western blot方法显示,转染后GSK-3β mRNA 和蛋白表达均显著下降。FACS检测结果显示,转染pGSK3β-shRNA干扰载体,不同浓度紫杉醇作用 24h后,卵巢癌SKOV3细胞对紫杉醇敏感度都有显著性提高。细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。结论运用 RNAi 技术构建的pGSK3β-shRNA干扰载体能特异、高效抑制靶基因GSK-3β表达;降低卵巢癌细胞中GSK-3 β基因表达水平,能增强卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感度,促进肿瘤细胞凋亡。     

shRNA干扰BAMBI 基因对人结肠癌SW480 细胞恶性生物学行为的影响

[摘要] 目的: 探讨shRNA 干扰骨形成蛋白和激活素的穿膜抑制剂(bone orphogenetic protein and activin membrane bound inhibitor, BAMBI)基因对人结肠癌SW480 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法: 转染SW480 细胞sh-BAMBI成功后,实时定量PCR（qRT-PCR)和Western blotting 检测BAMBI mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测SW480 细胞增殖能力,Hoechst33258 染色检测细胞凋亡情况,Transwell 实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测SW480 细胞迁移能力,Western blotting检测TGF-β/Smad2 通路相关蛋白的表达水平。结果: 转染成功后sh-BAMBI组中BAMBI的mRNA和蛋白水平均低于对照组(P<0.05);与对照组相比,sh-BAMBI 组细胞增殖率明显降低(P<0.05)、细胞凋亡率显著升高(P<0.01),同时其侵袭和迁移能力明显减弱(均P<0.05)。sh-BAMBI组TGF-β 蛋白水平和p-Smad2/Smad2 比值明显高于对照组(P<0.05)。结论: shRNA干扰BAMBI可诱导人结肠癌SW480 细胞凋亡并抑制细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能与激活TGFβ/Smad2 通路有关。     

hCaMKⅡNα对结肠肿瘤分泌免疫抑制因子的抑制作用

探讨钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制蛋白α（human calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ inhibitory alpha,hCaMKⅡNα）对结肠肿瘤细胞分泌免疫抑制因子的影响及其作用机制。方法：将hCaMKⅡNα基因表达载体（pKⅡNα）或siRNA（si-KⅡNα）转染至结肠肿瘤细胞（LoVo细胞、SW620细胞和HT29细胞）,形成过表达或干扰表达细胞。RT-PCR检测结肠癌LoVo细胞过表达hCaMKⅡα后白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）、白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）和血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor, VEGF）mRNA表达水平,ELISA法检测转染pKⅡNα或si-KⅡNα对SW620和LoVo细胞中VEGF、PGE2、 IL-8和IL-10分泌的影响。为观测细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）在hCaMKⅡNα介导的细胞因子调控中的作用,利用U0126抑制HT-29细胞中ERK1/2活性后,检测hCaMKⅡNα表达下调对VEGF和IL-8分泌的影响。结果： hCaMKⅡ 可显著抑制结肠癌LoVo细胞中VEGF、IL-8和IL-10 mRNA水平的表达;可抑制SW620和LoVo细胞中IL-8和VEGF蛋白的分泌,但对PGE2和IL-10的分泌没有影响。相应地,利用RNA干扰技术下调hCaMKⅡNα表达可显著上调HT29细胞中IL-8和VEGF的分泌;并且发现MEK1/2活性的抑制可完全阻断hCaMKⅡNα对IL-8的影响,但只能部分阻断对VEGF的影响。结论：hCaMKⅡNα通过抑制ERK活性下调结肠肿瘤细胞VEGF和IL-8的分泌,在结肠肿瘤免疫逃逸中起到负相调控作用。     

Notch3-siRNA增强结肠癌细胞对托泊替康的化疗敏感性

目的：探讨下调Notch3表达是否可增强结肠癌SW620细胞对化疗药托泊替康（topotecan）的敏感性。方法：将Notch3siRNA转染到SW620细胞中,Westernblotting检测转染后SW620细胞中Notch3的表达水平。转染后不同时间加入托泊替康,MTr法检测SW620细胞的增殖;Hoechst33342染色和流式细胞仪检测SW620细胞的凋亡;Caspase-3活化试剂盒检测SW620细胞中caspase-3的活化。结果：Notch3siRNA转染可明显抑制SW620细胞中Notch3蛋白的表达;托泊替康作用于Notch3siRNA转染组细胞的IC50较对照CtrlsiRNA转染组显著降低（P〈0．05）;流式细胞仪检测显示沉默Notch3的表达可显著增强托泊替康诱导的结肠癌细胞凋亡（P〈0．05）和caspase-3活化（P〈0．05）。结论：siRNA沉默Notch3的表达可增强SW620细胞对托泊替康的化疗敏感性。     

siRNA沉默S100P基因对胰腺癌细胞的生长抑制作用

[目的]探讨小干扰RNA（siRNA）沉默S100P基因后对胰腺癌SW1990细胞株生长的影响。[方法]化学合成针对S100P基因的siRNA,用脂质体转染试剂将siRNA体外转染至人胰腺癌SW1990细胞中,48h后收集细胞,分别提取细胞总RNA和蛋白。用实时定量RT-PCR测定S100P基因mRNA水平的表达;免疫印迹测定S100P蛋白的表达;MTT法测定细胞的生长曲线。[结果]转染siRNA后,S100P基因在mRNA水平上表达减少了77%,蛋白表达降低了74%,均显著性低于对照组。siRNA-S100P明显抑制细胞生长。[结论]应用RNAi技术沉默S100P基因可以降低人胰腺癌SW1990细胞株中S100P表达,抑制细胞生长。     

微小RNA-199b-3p靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-199b-3p（miR-199b-3p）靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖及凋亡的影响。方法 采用Lipofectamine脂质体法将miR-199b-3p抑制剂及阴性对照（NC）转染至SW620细胞并分为抑制剂组和NC组,同时以未转染的SW620细胞作对照。采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测3组miR-199b-3p的表达以评价转染效果,MTT法和Annexin Ⅴ-FITC／PI流式细胞术检测转染后的增殖活性及凋亡率,QPCR和Western blotting检测各组凋亡相关基因（Bax和caspase-3）及SOX6的mRNA和蛋白水平,构建含有野生型及突变型SOX6-3’UTR的荧光报告基因质粒并采用双荧光素酶报告实验验证miR-199b-3p对SOX6的靶向调控作用。结果 QPCR检测显示,转染48 h后抑制剂组的miR-199b-3p的表达水平为0.526±0.034,低于未转染组的1.009±0.064和NC组的0.960±0.057,差异有统计学意义（P＜0.05）;与其余两组相比,抑制剂组转染24、48、72 h后的SW620细胞的增殖活性均降低（P＜0.05）;抑制剂组的凋亡率为（37.533±1.459）％,高于未转染组的（6.101±0.663）％和NC组的（8.753±1.061）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制剂组SW620细胞的SOX6、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均高于未转染组和NC组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明 miR-199b-3p可显著抑制野生型 SOX6-3’UTR的荧光荧光素酶活性,而对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论miR-199b-3p可靶向调控SOX6的表达,且下调miR-199b-3p表达可抑制SW620细胞的增殖并诱导凋亡,为结肠癌的治疗提供潜在的分子治疗靶点。     

抗增殖基因BTG2在人胰腺癌组织中的表达及其抗增殖作用

目的 研究BTG2（B cell translocation gene2）在人胰腺癌中的表达以及对胰腺癌细胞生长的作用。方法利用RT-PCR法研究31例人胰腺癌及同例癌旁组织BTG2mRNA的表达。利用免疫沉淀法检测其BTG2蛋白的表达。用pcDNA3．1-BTG2质粒转染人胰腺癌细胞株sw1990,用MTT法测定质粒转染后sw1990／pcDNA3．1．BTG2细胞生长曲线;应用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂,用流式细胞仪测定sw1990／pcDNA3．1．BTG2细胞凋亡的情况。结果人胰腺癌BTG2mRNA的表达明显低于癌旁正常组织的表达（P〈0．05）;人胰腺癌BTG2蛋白的表达低于癌旁正常组织的表达（P〈0．01）;pcDNA3．1-BTG2质粒的转染能明显抑制胰腺癌细胞株sw1990的生长。结论BTG2基因在人胰腺癌中的表达下调可能与其恶性行为有关;BTG2基因的过度表达可通过诱导凋亡而抑制人胰腺癌细胞株sw1990的生长。BTG2可能是胰腺癌基因治疗的一个靶点。     

MYEOV对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨骨髓瘤过表达基因MYEOV在人胰腺癌细胞中的表达情况及其下调对胰腺癌SW1990细胞增殖和迁移能力的影响。方法 构建慢病毒载体GV248，转染胰腺癌细胞株SW1990获得SW1990-sh1和SW1990-sh2两个实验组，以空白质粒转染作为阴性对照组，未干预细胞为空白对照组。qPCR和Western blot检测转染前后MYEOV mRNA与蛋白的表达水平；CCK-8法测定细胞增殖能力；划痕实验分析细胞迁移能力。qPCR检测TGF-β/SMAD通路中相关SMADs mRNA表达水平。结果 与正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6相比，MYEOV mRNA在6株胰腺癌细胞中表达水平明显增加（P<0.01）；但仅在PANC-1和SW1990细胞系中检测到低水平MYEOV蛋白表达。实验组中MYEOV mRNA和蛋白表达均明显下调。与对照组相比，SW1990细胞的增殖和迁移能力明显下降（P<0.001）。下调MYEOV能降低TGF-β通路中SMAD1、SMAD4、SMAD5和SMAD9 mRNA表达（P<0.01），而SMAD2、SMAD3和SMAD7 mRNA仅在SW1990-sh2组中表达下调（P<0.01）。结论 MYEOV在胰腺癌细胞系中转录水平高，MYEOV可通过TGF-β/SMAD通路促进胰腺癌细胞的增殖和迁移能力。