粉尘螨Der f2变应原的分离纯化及其特征

目的 用粉尘螨（Dermatophagoides farinae）代谢培养基浸液（Dff）分离纯化粉尘螨2类变应原（Der f2）。方法 Sephadex G-100层析、DEAE离子交换层析、PAGE等方法分离纯化Der f2,并对Der f2作SDS-PAGE测定和热稳定性测定。结果 从Dff分离纯化得到较纯Der f2,经SDS-PAGE测定其相对分子质量为14000,并经100℃加热15min后,仍保留50%～83.3%生物学活性。结论 从Dff中分离纯化的变应原,其物化性质符合Der f2特征。     

粉尘螨Der fI变应原的免疫化学特征鉴定

作者在原制备Der f Ⅰ变应原基础上进行其免疫化学特征鉴定。Der fⅠ的交叉免疫电泳(CIE)结果证实提纯的Der f Ⅰ为均质性。Der f Ⅰ氨基酸组成与Dandeu(1982)、Heymann(1986)报道的Der f Ⅰ相应结果相关性比较表明,三者在氨基酸组成上有相似性。采用放射性变应原吸附试验(RAST)检测55份螨过敏性患者血清抗Der f ⅠIgE抗体水平,其中49.09％病人RAST阳性,平均阳性特异性IgE水平为6.58±3.90百分结合率。结果表明Der f Ⅰ是粉尘螨主要的变应原。     

粉尘螨主要变应原基因Der f1和Der f3改组的研究

目的:探索粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f1和Der f3基因片段两两混合,采用DNAshuffling技术对粉尘螨变应原Der f1和Der f3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子。结果:以Der f 2 F和Der f2 R为引物在酶切10、15、20、25、30min均可扩增出清晰条带;以Der f1 F和Der f1 R、Der f1 F和Der f2 R、Der f2 F和Der f1 R为引物在酶切10、15、20、25、30min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带。结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础。     

尘螨变应原Der f 2基因克隆及序列分析

目的:获得尘螨变应原Der f 2基因及其生物信息学资料.方法:提取粉尘螨总RNA,RT-PCR合成Der f 2的cDNA片段,回收PCR产物并连接至pMD19-T simple,经测序验证后亚克隆入表达载体pET-28a( ),转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒,双酶切鉴定.用ExPaSy,EBI,NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析.结果:RT-PCR扩增获得了Der f 2 cDNA片段,酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.与参考序列相比,测序结果多了87 bp(77～163),但Blastn发现中国广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87bp.同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示,该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近.推测该变应原由176个氨基酸组成,与附睾分泌蛋白E1具有同源性,信号肽位于1～17aa处,在6～24aa处有一跨膜螺旋.二级结构由a-螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成.结论:获得了粉尘螨变应原Der f 2编码基因及其分子特征,为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.     

粉尘螨过敏原Der f 13基因克隆表达与免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨过敏原Der f 13,并鉴定其免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,通过RT-PCR获得Der f 13的cDNA片段。根据已知Der f 13序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到T载体上并转入克隆菌Top 10中,涂板、培养,挑选阳性菌落,LB/AMP培养送测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,表达Derf 13蛋白,纯化、鉴定所得蛋白,并通过Western-blot等方法检测其免疫学活性。结果 RT-PCR结果显示,Der f 13基因片段大小为410 bp;同源性分析表明:本实验所克隆的Der f 13基因与NCBI数据库的Der f 13基因的同源性为95%;SDS-PAGE结果显示,重组质粒PET32-Der f 13在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白分子质量为35 ku,表达后的重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,经与尘螨过敏患者血清反应,检测出重组蛋白有较强免疫学活性。结论克隆出Der f 13基因,表达和纯化出目的蛋白,并具有免疫原性,为过敏性疾病的诊断和免疫治疗奠定理论基础。     

毛细管电泳测定粉尘螨主要变应原Der f2含量

目的　建立毛细管电泳测定Derf2方法。方法　采用毛细管电泳 安培检测系统 (CE AD)测定Derf2含量。结果　用CE AD测定了标准品Derf2的系列浓度 ,绘制标准曲线 ,线性好。并测定了药厂生产的各批不同浓度的粉尘螨注射液的Derf2含量。结论　CE AD方法具有简便快速、重现性好、样品用量少等优点 ,可用于生产各种变应原疫苗的质控     

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。     

尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体的构建

目的:构建尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体,为进一步转染真核细胞表达融合蛋白奠定基础.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,将其连接到小鼠IL-12(mIL-12)基因3′端,组成融合基因mI...     

粉尘螨过敏原Der f15的表达、纯化和生物信息学分析

目的表达纯化出粉尘螨过敏原Der f15蛋白,并预测其三维结构及B细胞抗原表位。方法利用实验室已有的Der f15质粒转化到大肠杆菌Rosetta,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过亲和层析纯化蛋白,经免疫印迹法(Western-blot)分析Der f15免疫原性,用生物信息学方法分析Der f15的三维结构及B细胞抗原表位。结果高效表达出Der f15蛋白。SDS-PAGE结果显示:表达的产物分子量约107ku。经亲和层析成功纯化蛋白,纯化蛋白以尘螨过敏患者血清为一抗进行Western-blot,结果显示:Der f15重组蛋白能与患者血清IgE发生特异性结合,而阴性对照没有反应条带出现,表明Der f15具有良好的抗原性。对B细胞抗原表位的预测表明,Der f15蛋白的第20~35、121~131、340~359及485~500是潜在B细胞抗原表位。结论粉尘螨Der f15表达、纯化和生物信息学分析研究有助于了解Der f15蛋白的分子生物学特性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。 更多还原     

粉尘螨DerfI变应原的免疫化学特征鉴定

作者在原制备ＤｅｒｆＩ变应原基础上进行其免疫化学特征鉴定。ＤｅｒｆＩ的交叉免疫电泳（ＣＩＥ）结果证实提纯的ＤｅｒｆＩ为均质性。ＤｅｒｆＩ氨基酸组成与Ｄａｎｄｅｕ（１９８２），Ｈｅｙｍａｎｎ（１９８６）报道的ＤｅｒｆＩ相应结果相关性比较表明，三者在氨基酸组成上有相似性。采用放射性变应原吸附试验（ＲＡＳＴ）检测５５份螨过敏性患者血清抗ＤｅｒｆＩＩｇＥ抗体水平，其中４９．０９％病人ＲＡＳＴ阳性，平均阳…     

胶体金免疫层析法检测Der f1变应原的研究

目的 开发一种灵敏度高且简单快速的胶体金免疫层析检测分析系统,为人居环境中Der fl变应原的检测提供检测基础.方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒.用胶体金标记的单克隆抗体建立免疫层析分析系统,用以检测Der fl.其检测效果与ELISA法相对照.结果 建立的胶体金免疫层析检测方法灵敏度达50 μg/L以上,特异...     

粉尘螨第五组主要变应原(Der f5)的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 克隆表达粉尘螨第五组变应原(Dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性.方法 提取活粉尘螨总RNA,扩增Der f5片段.PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a(+)连接,转化人大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果.Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性.结果 构建了重组质粒pMD18-Der f5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符.纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性.结论 获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白.初步鉴定了该蛋白的免疫原性.     

心钠素单克隆抗体的制备及鉴定

将心房肽Ⅲ(APⅢ)与牛血清白蛋白(BSA)偶联成大分子复合物,免疫BALB/C小鼠,制备出三株分泌心房肽Ⅲ单克隆抗体(APⅢ-McAb),行亚类鉴定为IgG_1型,琼脂双向扩散与BSA未出现沉淀线。应用APⅢ-McAb制备的亲和层析柱对心钠素有很高的亲和力,其洗脱峰管,有明显的降压作用。     

抗狂犬病疫苗单克隆抗体的制备和初步鉴定

用狂犬病疫苗为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/O融合,经过培养、克隆、ELISA鉴定,筛出3株分泌抗狂犬病疫苗单克隆抗体细胞株。双扩散结果证明:3株细胞均分泌IgG1。     

抗人尿激酶受体单克隆抗体的制备与鉴定

目的　制备抗人尿激酶受体单克隆抗体,为今后ｕＰＡＲ 病理生理作用及临床意义的研究提供新的手段。方法　利用杂交瘤技术,用经ＰＭＡ刺激的Ｕ９３７ 细胞与可溶性尿激酶受体（ｓｕＰＡＲ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠,与ＳＰ２／０ 细胞融合。结果　获得国内第１ 组４ 株抗人尿激酶受体（ｕＰＡＲ）单抗,分别命名为ＳＺ－ ９８、ＳＺ－ ９９ 、ＳＺ－ １００ 、ＳＺ－ １０１。结论　４ 株单抗均能与ｕＰＡＲ 特异性结合,能与Ｕ９３７ 细胞及经ＰＭＡ作用的Ｋ５６２ 细胞反应。ＳＺ－ １０１ 与国外抗ｕＰＡＲ单抗３９３６ 有相同的ｕＰＡＲ 结合位点;而ＳＺ－９８、ＳＺ－ ９９ 与ＳＺ－ １００ 在ｕＰＡＲ上有不同的结合位点     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。