几种有关DNA解旋和解链的酶

大肠杆菌(E.coli)的染色体含有约4×10~6个碱基对(bp),约40分钟即可完成复制。因为有两个复制叉,故在每个复制叉DNA合成速率为5×10~4bp/min,亦即解旋速率为5000r/min,这是一个很惊人的转速,但DNA分子不可能在细胞内如此旋转的。目前认为有几种蛋白质(或酶)在DNA复制时参与双螺旋的解旋和解链过程.国外文献对同一种酶有不同的命名,加之国内译名不一,以致比较混乱。本文主要就这些酶的名称、种类及作用机理简述如下。     

端粒酶的表达与癌症的发生风险

端粒酶一直是研究的热点 ,特别是近年来端粒酶的表达与癌症的发生风险之间的关系 ,更是不断地被人们去研究 ,去探索。但根据最近的一些相关文献报道来看 ,这种讨论该结束了。存在于真核生物染色体末端的端粒是重复的DNA单位 ,它保护染色体使之免受降解 ,融合和重组 ,是一个非常重要的结构。由于 DNA聚合酶不能在线性染色体末端发挥其复制作用 ,所以端粒随着每一次的有丝分裂周期而缩短。线性 DNA分子通过 DNA聚合酶只能由 5′→ 3′方向复制 ,而且需要一个 RNA引物去始动 DNA的合成。因此 ,RNA引物的移动导致每一次分裂都有 DNA丢…     

组蛋白的供需调节DNA复制叉进程

真核生物的DNA半保留复制时，亲代核小体在复制又之前打开，再重新组装，亲代组蛋白完整转移到子代分子的前导链，新合成的组蛋白与随从链组装成新的核小体。但是究竟组蛋白动力学在解链过程中如何协调复制叉进程从而维持染色体稳定还不清楚。来自法国和丹麦的研究人员利用质谱分析和免疫印迹的方法发现一种Asf1-（H3-H4）-MCM复合物，     

特异的DNA扩增

在一个简单的试管反应中,可以用PCR(聚合酶链反应)合成上百万拷贝数的某DNA片段。耐热的DNA聚合酶极大地促进了这一技术。近年来,临床上诊断遗传病和传染病的时候,越来越需要对某特殊的DNA顺序进行分析,只有PCR技术使这类DNA的快速、简便的分析成为可能。因为PCR能通过一个简单的试管内反应,使某特异的DNA顺序片段合成数百万个拷贝。 PCR扩增DNA的特异性是决定于两个人工合成的寡核苷酸引物。这两段引物的DNA顺序与待扩增DNA片段两端的DNA顺序分别相同,因此可同与之互补的一条链杂交。PCR是反复进行如下的循环过程:模     

DNA复制的研究进展

“半保留”的DNA复制是在多种酶及蛋白质因子作用下完成的复杂过程。DNA复制时,可能以特异的四文样寡聚核苷酸顺序为原点,在DNA解开酶及解链蛋白的协同作用下,由ATP为解提供能量,使DNA的双链解开,以间断复制的方式进行新链的合成。RNA引物是在引物酶及多种蛋白质因子参与下合成的。真核细胞的染色质是由组蛋白,NHC蛋白和DNA组成的复杂结     

不对称PCR制备单链探针检测登革Ⅱ型病毒复制型RNA和复制中间体RNA

登革病毒是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒 ,病毒的复制过程发生在感染细胞胞浆 ,复制型 (RF)RNA是病毒半保留复制的循环模板 ,复制中间体 (RI)RNA的合成则是病毒复制所必需的。经RT PCR获得的DNA模板进行不对称PCR扩增 ,当限制性引物终浓度为 2 5 0nmol L ,两引物比例为 1 0 0∶1时 ,即得到不对称PCR的预计单链和双链DNA产物。此单链产物用于标记探针进行核酸杂交。结果表明不对称PCR制备单链探针进行核酸杂交可用于检测病毒复制型RNA和复制中间体RNA的合成     

从MT2、HeLa细胞DNA及人和黑猩猩PBMC DNA中扩增GBV-C核苷酸

目的　检测MT2和HeLa细胞DNA、6例人和 1例黑猩猩PBMCDNA中是否存在与GBV C同源的核苷酸序列。方法　直接以上述DNA为模板、采用GBV C 5′ NCR和NS3区引物的直接套式PCR(dPCR)、核苷酸序列分析、引物介导原位扩增 (PRINS)NDA序列特异荧光标记技术。结果　从MT2和HeLa细胞DNA、4例人PBMCDNA标本中获得 5′ NCR引物扩增片段 ,从MT2和HeLa细胞DNA、5例人和黑猩猩PBMCDNA标本中获得NS3区引物扩增片段。这些扩增产物的核苷酸序列与GBV C同源性分别为 74 2 9%～ 77 14%和 73 80 %～ 79 15 %。PRINS检测结果显示 ,dPCR阳性的PBMC及其染色体上有荧光着色。结论　MT2和HeLa细胞DNA、人和黑猩猩PBMCDNA中存在与GBV C 5′ NCR和 或NS3区同源性较高的核苷酸序列 ,这些序列可能位于dPCR阳性的PBMC染色体上。     

真核生物细胞中的无义介导mRNA降解机制

真核生物细胞具有不同的机制用于监视转录本的准确性以保证翻译产物的完整性与正确性 ,无义介导mRNA降解 (NMD)的作用对象主要是由于编码氨基酸的密码子突变为终止密码子 ,而使翻译提前终止的无义mRNA ,其降解方式是直接进行 5′端脱帽和 5′→ 3′方向的水解。     

从MT2、HeTa细胞DNA及人和黑猩猩PBMC DNA中扩增GBV—C核苷酸同源序列的研究

目的 检测MT2和LeLa细胞DNA、6例人和1例黑猩猩PBMC DNA中是否存在与GBV－C同源的核苷酸序列。方法 直接以上述DNA为模板、采用GBV－C 5′－NCR和NS53区引物的直接套式PCR（dPCR)、核苷酸序列分析、引物介导原位扩增（PRINS）DNA序列特异荧光标记技术。结果 从MT2和HeLa细胞DNA、4例人PBMC DNA标本中获得5′－NCR引物扩增片段,从MT2和HeLa细胞DNA、5例人和黑猩猩PBMC DNA标本中获得NS3区引物扩增片段。这些扩增产物的核苷酸序列与GBV－C同源性分别为74．29％－77．14％和73．80％－79．15％。PRINS检测结果显示,dPCR阳性的PBMC及其染色体上有荧光着色。结论 MT2和HeLa细胞DNA、人和黑猩猩PBMC DNA中存在与PBMC及其染色体上有荧光着色。结论 MT2和HeLa细胞DNA、人和黑猩猩PBMC DNA中存在与GBV－C 5′－NCR和／或NS3区同源性较高的核苷酸序列,这些序列可能位于dPCR阳性的PBMC染色体上。     

Exosome的功能及作用机制的研究进展

Exosome(外切酶体 )是一种包含了至少 10种必要组分的蛋白复合物 ,它在真核细胞 RNA加工和 m R-NA3′→ 5′方向降解过程中都起重要的作用。近两年来 ,exosom e还被发现在 m RNA的质量控制和 5′端去帽中起关键作用。随着对 m RNA的 AREs功能研究的进一步深入和 ski复合物的发现 ,人们对 exosom e作用机制的认识取得了突破性进展     

慢性HCV感染者中分离的不同长度3′UTR-PolyU/UC段对IRES介导的翻译及NS5B合成RNA影响

目的　研究丙型肝炎病毒 3′非编码区 (3′UTR)及不同长度PolyU UC段对内在核糖体进入位点 (IRES)介导翻译的影响以及对NS5B聚合酶合成RNA的影响。方法　通过构建含有HCVIRES、荧光素酶 (fireflyluciferase)报道基因和内含不同长度PolyU UC区的 3′UTR序列的系列重组质粒 ,采用体外翻译和细胞转染等方法检测报道基因表达的水平。结果　体外翻译实验和细胞转染实验显示 3′UTR对IRES介导的翻译具有增强作用 ,在体外翻译体系中这种增强作用与PolyU UC区的长度相关 ,而在细胞中则与PolyU UC区的长度无明显相关性 ;3′UTR对共转染的重组NS5B质粒的复制活性具有抑制作用 ,这种抑制作用也与PolyU UC区长度不成正比。结论　HCV 3′UTR与蛋白翻译及RNA合成有关 ,在细胞中并不与PolyU UC区的长度相关。     

DNA复制的发动

DNA复制是遗传信息流的第一个枢纽。为什么衰老的细胞DNA不复制,而癌细胞DNA却异常复制,这些问题都与DNA复制的发动紧密相关。DNA复制的发动引人注目的原因还在于:复制发动在机制上是独立于复制中链延长阶段;复制子复制的特异性主要表现为复制发动的特异性,而其后的链延长阶     

聚合酶3′外切活性对3′硫化修饰引物聚合反应的影响

目的 探讨硫化修饰的次3′末端不配对引物能否引发高保真DNA聚合酶介导的聚合反应的非成熟性终止,即所谓聚合反应的“关”效应。方法 采用配对及非末端不配对的3′硫化修饰引物,研究其对不同保真度DNA聚合酶引物延伸反应的影响。结果 非末端不配对的3′硫化修饰引物也能引发高保真DNA聚合酶介导的聚合反应非成熟性终止,而对低保真DNA聚合酶所介导的聚合反应则无明显影响。同时,3′硫化修饰的配对引物对不同保真度DNA聚合酶引物延伸反应均无影响。结论 硫化修饰的次3′末端不配对引物与3′末端不配对引物对引物延伸的影响相似,同样能引起高保真DNA聚合酶介导的聚合反应的“关”的效应。显然,在单基因遗传病的诊断及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SHIP)的高通量分析等方面,硫化修饰的碱基特异性引物与高保真DNA聚合酶所构成的对SNP敏感的“开／关”系统,具有广阔的应用前景。     

真核细胞DNA聚合酶

近年来,其核细胞DNA体外复制模型的建立及蛋白纯化技术的提高,DNA聚合酶基因的克隆,真核细胞DNA聚合酶研究取得了很大进展。迄今为止,已发现α、β、γ、δ、ε、ζ等6类真核细胞DNA聚合酶,分别在DNA复制和修复等事件中起到重要作用。     

PCR中DNA聚合酶的忠实性

ＰＣＲ 中使用的耐热ＤＮＡ聚合酶会产生不同程度的ＤＮＡ 复制错误,直接影响基因分析的方法设计、准确性及灵敏度。常用聚合酶的ＤＮＡ复制错误率依次为Ｐｆｕ＜ ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ＜ Ｖｅｎｔ＜ Ｔａｑ＜ ＵＩＴｍａ,ＰｆｕＥｘｏ,各聚合酶有不同的突变热点。对聚合酶忠实性起决定性作用的是聚合酶本身的结构特性,３′５′核酸外切酶校正阅读活性有利于聚合酶的忠实性,Ｍｇ２ ＋ｄＮＴＰｓ、ｐＨ 等反应条件都会影响聚合酶的错误率。     

DNA聚合酶Y家族在跨损伤复制中的作用

普通的DNA聚合酶可以对正常的DNA完成复制,但是当DNA发生损伤,损伤位置就会成为DNA复制的阻滞点,普通的DNA聚合酶就无法完成基因组的复制。为了应对这种情况,生物体内还拥有另一类DNA聚合酶:聚合酶Y家族,又被称为跨损伤复制(TLS)聚合酶,它们的主要功能就是跨越损伤位点,完成基因组复制,解救濒死细胞。本文主要对Y家族聚合酶的结构特点、功能效应、作用机制等方面做一综述。     

乙肝病毒基因组的复制,转录与调控

本文综述了HBV DNA复制、转录及其调控的研究进展。HBV DNA的复制包括:cccDNA形成,前基因组RNA的合成与包装,DNA负链合成及DNA正链合成等四个主要步骤.HBV DNA转录的机理目前不十分清楚,其可能有赖于宿主体内的RNA聚合酶Ⅱ,转录的模板是cccDNA。目前已经证实HBV DNA可转录3.5kb,2.1kb和0.8kb三种主要的转录体。HBV DNA转录受顺式和反式激活因子调控,HBV增强子成分和启动子成分是主要的顺式激活因子;HBxAg可能是HBV DNA转录的反式激活因子,这些调控因子共同参与HBV DNA转录的调节。     

人类X染色体的异染色质的形成:复制型式的分类

人类基因组的某些部位看起来似乎不遵循DNA复制的一般规律。例如女性细胞中的2条X染色体在S期末产生的DNA合成产物的数量和分布不一致。有活性的一条X染色体,通过显带技术显示不出差异,它与常染色体同步进行合成,而它的同源染色体即失活的X染色体在合成的开始和终结过程都延迟了。在失活的X染色体中,DNA复制开始比较早的带是Xp22和q23—q28。最主要特征在复制末期进行Xq21和Xq23的复制。从8个正常女性取出的末梢血淋巴细胞     

新型超耐热菌的单链DNA结合蛋白表达和纯化及其增强DNA、cDNA的合成

目的 表达和纯化一种新的来自于超耐热菌(thermococcus kodakarensis) KOD1的单链DNA结合蛋白(缩写为kod-ssb),并探讨其对DNA、cDNA合成的影响.方法 采用Transrtta(DE3)表达kod-ssb,用镍柱亲和层析纯化,经SDS-PAGE分析检测表达纯化后的kod-ssb.使用PCR及qRT/qPCR检测kod-ssb对DNA、cDNA合成的影响.结果 将质粒pET11a-kod转化Transetta(DE3)中,得到重组菌株Transetta(pET11a-kod),经IPTG诱导.由SDS-PAGE分析可见表达的约40×103的特异条带;使用人类β球蛋白基因作为模板分别扩增5 kbp,9 kbp和13 kbp目的片段,结果加了kod-ssb的PCR目的片段比没加的产量高很多,而且kod-ssb显著降低了PCR反应的非特异性扩增.以流感细胞培养上清抽提的RNA为模板,实施RT-/qPCR反应.结果加kod的平均Ct值是19.42,而没加的为22.15.结论 kod-ssb在未来将被用于增强DNA和cDNA的合成.     

DNA修复研究的回顾与前瞻

DNA是生命活动中最重要的遗传物质，也是环境因索攻击的靶分子，DNA损伤可归纳为四种主要类型；①碱基损伤，包括嘧啶二聚体、碱基共价结合物、减基烷基化和碱基脱落；②糖基破坏；③链断裂，包括DNA单键断裂、双链断裂必DNA使交联，包括DNA链内交联、链间交联、DNA蛋白质交联．DNA损伤直接影响复制、转录和蛋白质合成，进而影响细胞生长、发育、遗传、代谢和繁殖等生命活动，是造成突变、癌变、老化和死亡的重要原因．DNA修复是活细胞利用各种途径对其基因组出现的上述损伤的一种保护性的反应，在很大程度上保证了遗传物质基础的…