RNA干扰沉默Cathepsin L基因表达对肝癌细胞生物学特性影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰技术沉默Cathepsin L基因对肝癌细胞生物学特性的影响.方法 实验组为肝癌细胞CathepsinL siRNA转染基因沉默组(沉默组),实验对照为肝癌细胞空白对照组(空白组)和siRNA转染荧光蛋白对照组(荧光对照组).观察时间为Cathepsin L siRNA转染后1、3和6 d.观察各组肝癌细胞Cathepsin L siRNA转染效率.用免疫荧光、RT-PCR法及WB法检测肝癌细胞Cathepsin L表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化,侵袭小室法测定肝癌细胞侵袭力变化.结果 沉默组与空白组、荧光对照组比较,Cathepsin L mRNA水平和蛋白水平显著下降,细胞生长受抑制,增殖指数显著下降,细胞凋亡率显著增加,肝癌细胞侵袭力显著下降.结论 RNAi可有效沉默肝癌细胞Cathepsin L表达,降低肝癌细胞增殖活力及细胞侵袭力.     

靶向MMP-2的RNAi抑制胰腺癌PANC-1细胞侵袭性的研究

目的 观察RNAi体外沉默胰腺癌PANC-1细胞MMP-2基因对胰腺癌细胞MMP-2表达及细胞侵袭能力的抑制作用.方法 设计靶向MMP-2的siRNA并构建到pGCsi-U6质粒,重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000转染PANC-1细胞,流式细胞仪检测质粒的转染率,RQ-PCR检测细胞MMP-2的mRNA表达水平;ELISA检测细胞MMP-2蛋白的分泌量;Transwell小室侵袭观察各组细胞侵袭能力;MTT比色法检测各组细胞增殖活性.结果 测序鉴定证实,干扰质粒构建成功,重组质粒转染率最高达82.1%.转染干扰质粒PANC-1细胞的MMP-2基因mRNA表达抑制了71.74%(P＜0.05);MMP-2蛋白分泌下降了49.82%(P＜0.05);细胞侵袭能力抑制率达33.0%(P＜0.05);细胞的增殖活性无明显变化(P＞0.05).结论 靶向MMP-2的RNAi能抑制胰腺癌PANC-1细胞的体外侵袭能力,提示MMP-2可以作为胰腺癌基因治疗的靶点,亟待RNAi能为肿瘤治疗开创崭新局面.     

RNA干扰对兔血管平滑肌细胞bcl-2基因表达的影响

目的研究RNA干扰(RNAi)对兔血管平滑肌细胞(VSMCs)bcl-2基因表达的干扰效应。方法用脂质体法将构建的装载靶向bcl-2基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体(pshRNA-bcl-2质粒)转染VSMCs(基因组),以转染空载体的细胞和加DMEM的空白细胞作为对照,采用半定量RT-PCR和Westernblot法检测bcl-2基因的表达,用MTT法检测VSMCs生长情况。结果转染siRNA的表达载体可以抑制内源性bcl-2基因在转录和转译水平上的表达,基因组bcl-2的mRNA和蛋白表达较空载体组和空白对照组明显减少(P<0.01);基因组的VSMCs生长也较空载体组和空白对照组明显受到抑制(P<0.01)。结论载体介导的RNAi技术可明显抑制内源性bcl-2基因的表达和VSMCs生长。     

靶向TRPV6的siRNA对前列腺癌LNCaP细胞抑制作用的体外研究

目的:运用RNA干扰(RNAi)技术阻断前列腺癌LNCaP细胞中瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚家族6(TRPV6)基因的表达,探讨TRPV6基因沉默对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:针对TR-PV6基因,构建2条小干扰RNA(siRNA)序列;在脂质体介导下转染前列腺癌LNCaP细胞,用RT-PCR测定TRPV6mRNA的表达;MTT法和流式细胞技术测定siRNA对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果:两条siRNA序列均能有效地阻断LNCaP细胞中TRPV6基因在mRNA水平上的表达(P<0.01),且mRNA表达随着转染时间的延长而减少,转染72h后TRPV6mRNA的表达减少至对照组的27%和23%;siRNA转染能显著抑制LNCaP细胞增殖,转染48h细胞增殖抑制率最高,分别为34.53%和29.32%,与转染24h和72h比较有统计学意义(P<0.05);转染48h后,siRNA转染组G0～G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少,与空白对照组及阴性对照组相比有统计学差异(P<0.01);siRNA转染组细胞的凋亡率分别为14.45%和12.73%,显著高于空白对照组及阴性对照组3.78%和5.22%(P<0.05)。结论:针对TRPV6的siRNA在体外能有效地抑制LNCaP细胞TRPV6mRNA的转录,同时能够抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,使细胞周期出现G0/G1期阻滞,细胞凋亡率显著增加。     

靶向survivin的RNA干扰对裸鼠前列腺癌的影响

目的探讨利用RNA干扰技术在裸鼠体内抑制survivin基因表达并诱导前列腺癌细胞凋亡的作用。方法设计、构建靶向survivin的重组质粒载体并导入裸鼠皮下移植瘤,称量瘤重,计算抑瘤率,应用RT-PCR法检测survivin基因的干涉效率,TUNEL染色法技术检测细胞凋亡效果。结果PBSsi-survivin A和PBSsisurvivin B两种阳性表达载体转染组均具有显著低瘤重和高抑瘤率特点,两组均显著抑制了Survivin mRNA表达,并诱导前列腺癌细胞凋亡。结论RNAi可有效抑制前列腺癌PC-3细胞survivin基因mRNA表达,减缓肿瘤生长,并诱导细胞凋亡。     

Zeste增强子同源物2在前列腺癌中的表达及对前列腺癌细胞生物学功能机制研究

目的观察Zeste增强子同源物2(EZH2)在前列腺癌中表达情况和在体外对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响, 并探究作用机制。方法通过肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析EZH2在前列腺癌组织和前列腺增生组织中表达差异和预后关系。DU145细胞来源于上海中国科学院细胞库。对DU145细胞进行小干扰RNA(siRNA) EZH2沉默, 并通过蛋白质印迹法(Western blot)和RT-qPCR检测干扰效率。通过细胞计数试剂盒(CCK-8)和Transwell实验检测EZH2对DU145生物学行为的改变。通过Western blot检测EZH2与p21相关性。结果前列腺癌组EZH2的信使RNA(messenger RNA, mRNA)表达高于正常前列腺组织, 且EZH2表达水平和Glesaon分级正相关。前列腺癌细胞系DU145、PC3组中EZH2的mRNAs和蛋白水平表达高于WPMY-1细胞组, 且在DU145中表达高于PC-3。CCK-8实验结果显示, si-EZH2组增殖能力显著低于于Control组(t=4.17, P<0.05);Transwell实验结果表明, si-E...     

siRNA靶向沉默OCT4基因对前列腺癌DU145和PC3细胞等生物学行为的影响

目的 观察siRNA靶向沉默OCT4基因对前列腺癌DU145细胞和PC3细胞的生物学行为影响.方法 通过脂质体介导的方法将OCT4 SiRNA分别转染人前列腺癌细胞株DU145细胞和PC3细胞,采用RT-PCR和Western-blot方法分别检测特异性siRNA对0ct4基因在mRNA和蛋白水平上的沉默效果,CCK8法测定细胞生长曲线观察细胞增殖的抑制情况,运用Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化.结果 转染OCT4 SiRNA的两组细胞OCT4的表达均低于阴性对照组(NC)与空白组(P＜0.05),OCT4SiRNA抑制两种细胞的增殖并降低细胞的侵袭能力.结论 OCT4-siRNA可以有效抑制DU45细胞和PC3细胞的OCT4基因的表达,从而抑制细胞增殖,抑制侵袭和迁移,表明OCT4基因在前列腺癌的发生发展中发挥重要作用.     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA(siRNA)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响. 方法 根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体.以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率.实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组.转染后24、48和72 h,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率. 结果 与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48 h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52%.实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强.转染48 h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13.6%±1.8%. 结论 在RNAi研究中,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值.     

RNAi技术沉默Bcl-2基因对人膀胱癌细胞株T24增殖影响的研究

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bcl-2基因表达对人膀胱癌细胞株T24增殖的影响。方法针对Bcl-2 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,转染T24细胞。采用Western blot检测重组质粒对Bcl-2蛋白表达的影响,MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用,Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FCM)检测转染重组质粒后细胞的凋亡状况。结果成功构建了pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,并成功转染T24细胞。重组质粒抑制Bcl-2基因的表达接近70%;转染重组质粒后,T24细胞的活力降低为(66.9±5.6)%;重组质粒组的T24细胞凋亡率为34.55%～45.39%。结论pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒明显下调Bcl-2在膀胱癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞生长,促进其凋亡。     

小干扰RNA特异性沉默c-myc基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学影响

目的 观察小干扰RNA(siRNA)沉默c-myc基因的表达对人胰腺癌细胞株SW1990细胞生物学影响.方法 用siRNA沉默胰腺癌SW1990细胞中c-myc基因,用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot技术检测c-myc mRNA及蛋白的表达量;噻唑蓝(MTT)法检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞增殖的影响;膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测沉默c-myc基因细胞凋亡水平;Transwell细胞迁移实验检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞迁移能力的影响.结果 靶向c-myc的特异性siRNA可以高效抑制人胰腺癌SW1990细胞c-myc基因表达,在mRNA水平(0.263±0.048)较转染对照质粒组(0.970±0.012)明显降低,c-myc蛋白质表达量及细胞增值率均较转染对照质粒组明显降低;转染后48 h c-myc siRNA组细胞凋亡率为(19.90±2.09)％,明显高于siRNA阴性对照组(4.93±0.25)％和空白对照组(4.40±0.34)％;Transwell实验结果示细胞穿膜数c-myc siRNA组[(34.3±1.2)个]较siRNA-NC组[(68.3±5.8)个]和空白组[(72.3±1.2)个]均明显降低.结论 c-myc siRNA能够显著抑制c-myc基因在人胰腺癌SW1990细胞中的表达,降低细胞的增殖和迁移能力,促进细胞的凋亡.     

稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1的构建

目的 应用RNA沉默技术下调前列腺癌CWR22RV1细胞株的Rictor基因表达,并筛选具有稳定转染Rictor-shRNA的细胞株,为进一步研究Rictor在前列腺癌中的作用打下基础.方法 针对Rictor基因设计合成siRNA序列;鉴定、测序并转染293T细胞观察基因表达情况;构建Rictor-shRNA慢病毒载体;进行Rictor-shRNA慢病毒包装及滴度测定;筛选稳定表达Rictor-shRNA的前列腺癌CWR22RV1细胞株;Western blot检测稳定转染前列腺癌CWR22RV1细胞株Rictor的表达水平.结果 Rictor-shRNA慢病毒成功包装后转染前列腺癌CWR22RV1细胞,进行嘌呤霉素筛选,获得沉默Rictor基因的前列腺癌CWR22RV1细胞株,Western blot检测显示该细胞株Rictor水平明显降低(P＜0.01).结论 成功构建了稳定沉默Rictor表达的前列腺癌CWR22RV1细胞株,为后续的实验了打下坚实的基础.     

小干扰RNA对LNcap细胞CXCR4基因表达的影响

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对LNcap细胞中CXC趋化因子4(CXCR4)基因表达的影响。方法:用针对CXCR4基因的siRNA表达质粒pSilencer-CXCR4转染人前列腺癌细胞株LNcap细胞,用RT-PCR方法检测其CXCR4基因表达水平的变化。结果:重组体pSilencer-CXCR4转染LNcap细胞后,能明显抑制CXCR4基因的表达;转染48 h后,其表达水平下降75%,与空白对照组和阴性对照组比较,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为下一步有关CXCR4的研究奠定一定的基础。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.001,P＜0.001).体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关(P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005).结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

携带报告基因EGFP的CXCR4 RNA干扰质粒的构建及生物活性的鉴定

目的构建携带报告基因EGFP的CXCR4RNA干扰质粒,证实其高效抑制靶基因表达的生物活性。方法设计有发夹状结构的两条DNA序列,用PCR扩增CXCR4特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pGensil-1质粒,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切及测序鉴定。重组质粒转染PC-3m细胞株,检测绿色荧光蛋白表达及对细胞CXCR4表达的抑制情况。结果成功构建了CXCR4靶向的RNA干扰质粒pGensil-1/siCXCR4,在靶细胞可同时表达siRNA及绿色荧光蛋白。结论pGensil-1/siCXCR4质粒的成功构建对利用基因干扰技术治疗前列腺癌转移方面的研究奠定了一定的实验基础。     

RNA干扰沉默JMJD2A基因表达对人乳腺癌细胞MCF-7的影响

目的 观察特异性小干扰RNA(siRNA)技术沉默JMJD2A基因表达对人乳腺癌细胞MCF-7生物学特性的影响.方法 体外化学合成JMJD2A序列特异性双链siRNA,经HiPerFect Transfection Reagent转染人乳腺癌细胞株MCF-7.收集siRNA干扰的细胞,Real time逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白印迹分别检测JMJD2A mRNA和蛋白的抑制水平,并采用WST-8法、流式细胞仪测定细胞增殖能力和细胞周期的变化,Transwell小室测定细胞侵袭、迁移能力的变化.结果 JMJD2A siRNA能有效抑制JMJD2A mRNA和蛋白的表达(P<0.05);经siRNA干扰后的细胞,细胞增殖能力显著减低[1.45±0.05比1.73±0.02(48 h A值),P<0.05];Go/G1期细胞百分比明显增加(53.80±1.80比44.84±1.86,P<0.05).S期细胞百分比明显减少(36.55±1.52比47.06±1.26,P<0.05);细胞侵袭、迁移能力明显降低(P<0.05).结论 采用siRNA干扰JMJD2A mRNA和蛋白表达后,能有效逆转乳腺癌细胞的某些恶性生物学特点,表明JMJD2A与乳腺癌的发生、发展及转移有一定关系.     

RNA干扰PLK1基因表达对肝癌细胞增殖的影响

目的探讨靶向PLK1基因在肝癌基因治疗中的可行性。方法采用PLK1小干扰核糖核酸分子(siRNA)转染人肝癌HepG2细胞,分别以荧光实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因和蛋白的表达水平,观察PLK1 siRNA转染对肝癌细胞体外增殖的影响。并于转染不同时间后收集细胞,分别采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测肝癌细胞的凋亡情况。结果 PLK1基因明显抑制癌细胞体外生长(P0.05)。肝癌HepG2细胞经siRNA转染处理后,PLK1 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P0.05)。DNA电泳出现明显的梯度图谱;转染组癌细胞凋亡指数明显增加。结论 PLK1 siRNA转染可明显抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡有关。本结果为肝癌以PLK1基因治疗提供了一条新的思路。     

靶向沉默SPHK1基因诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨用小干扰核酸（SmallinterferingRNA,siRNA）靶向沉默神经鞘氨酸激酶1（sDhingosinekinasel,SPHKl）基因敲除后对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法人工化学合成SPHKlsiRNA和对照siRNA,分别转染胃癌SGC-7901细胞。Westernblot法检测SPHKl、Bcl-2和Bax蛋白的表达;流式细胞术（FlowCytometry,FCM）检测细胞凋亡的变化。结果SPHKlsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,SPHKl蛋白表达明显下调;与对照组相比,SPHKlsiRNA转染组Bcl一2蛋白表达下调了55％（P〈0．01）,Bax蛋白表达差异无统计学意义,Bcl-2／Bax比值下调54％（P〈0．05）;SPHKlsiRNA转染组早期凋亡细胞明显增多（P〈0．01）,晚期凋亡细胞无明显变化。结论SPHKl特异性siRNA可阻断SGC-7901细胞SPHKl蛋白的表达,并通过影响Bcl-2通路诱导细胞凋亡。     

siRNA靶向抑制GHR对人结肠癌SW480细胞增殖的影响

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人结肠癌SW480细胞人生长激素受体(GHR)基因的表达,观察GHR基因沉默对SW480细胞增殖的影响。方法设计特异性siRNA,构建针对人GHR真核质粒的表达载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFP-siRNA-GHR),用电转染法转染人结肠癌SW480细胞,培养48~72 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性;Western Blot检测GHR蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测GHRmRNA水平变化。结果转染siRNA后,与对照组相比,转染组细胞增殖速率、GHR的蛋白表达量、GHRmRNA水平均明显降低(均P<0.05)。结论构建的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-GHRsiRNA能有效地下调SW480细胞中GHR的表达,从而抑制SW480细胞的增殖。