空肠弯曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A壳聚糖佐剂疫苗对小鼠免疫原性和保护性研究

目的:研究空肠弯曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A壳聚糖佐剂疫苗的免疫原性和保护性。方法:健康雄性昆明小鼠分为实验组和对照组。实验组设pcDNA3.1(-)-peb1A组3个剂量和壳聚糖-pcDNA3.1(-)-peb1A组3个剂量;对照组设空载体pcDNA3.1(-)(100μg/100μl)组和生理盐水(NS)组,各组均采用小鼠股四头肌注射法。在第0、10、20天免疫,于每次免疫后第10天采集各组小鼠血清,以间接ELISA法检测血清中特异性IgM、IgG的含量。分离各组小鼠脾淋巴细胞包被细胞培养板,以细胞ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞CD20、CD21表达水平。设空肠弯曲菌液灌胃攻击免疫后小鼠,检测肠道分泌液细菌培养数量。结果:裸DNA组和壳聚糖-DNA组各组特异性IgG水平均高于两对照组(P<0.05)。裸DNA组和壳聚糖-DNA组小鼠脾淋巴细胞CD20、CD21表达水平均高于两对照组(P<0.05),壳聚糖-DNA组高于裸DNA组(P<0.05)。肠道分泌液细菌培养结果细菌指数裸DNA组的低于两对照组;佐剂DNA组低于裸DNA组。结论:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性和保护作用,壳聚糖能增强pcDNA3.1(-)-peblA的免疫原性,有望成为空肠弯曲菌基因疫苗的候选佐剂。     

空肠弯曲菌PEB1-LTB DNA疫苗构建及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:研究粘膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)辅助的空肠弯曲菌(C.jejuni)外膜蛋白PEB1基因重组DNA疫苗诱导小鼠免疫应答水平。方法:构建pcDNA3.1(-)-PEB1-LTB真核重组表达载体,转染Hela细胞,Westernblot鉴定蛋白表达。滴鼻免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,测定小鼠血清中IgG、IgA及气管、小肠粘膜冲洗液sIgA抗体;脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4水平。末次免疫后4周,采用空肠弯曲菌重复攻击的方式进行灌胃攻击,攻击后,根据动物疾病指数评价疫苗临床保护率。结果:构建的重组表达质粒能在Hela细胞内表达,重组蛋白。疫苗免疫小鼠后,不仅诱导了高水平血清IgG、IgA抗体,而且诱导了高水平粘膜sIgA抗体。其诱导的特异性免疫应答能有效保护免疫后小鼠免遭空肠弯曲菌的感染攻击。结论:构建的DNA疫苗经粘膜免疫能诱导小鼠产生较高水平的特异性免疫应答,能有效预防空肠弯曲菌感染。     

人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定

目的 构建人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)真核表达载体PcDNA3.1(-)-ICAM-1,并在真核细胞COS-7中表达.方法 设计特异性引物,用PCR方法扩增ICAM-1全编码区基因片段,将其连接人真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过酶切进行鉴定.用脂质体转染法将真核表达载体pcDNA3.1(-)-ICAM-1转染COS-7细胞,通过免疫荧光和Western印迹分析人ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达情况.结果 PCR扩增得到人ICAM-1的cDNA片段大小为1800 bp,重组质粒经酶切鉴定和DNA序列分析确定得到真核表达载体peDNA3.1(-)-ICAM-1.荧光显微镜下可见转染重组质粒的COS-7细胞膜上存在荧光分布,而转染空质粒的细胞未见荧光分布.Western印迹检测发现转染重组质粒的细胞存在外源性的人ICAM-1表达,而转染空质粒的则未见ICAM-1表达.结论 成功构建了人ICAM-1真核表达载体,ICAM-1高效表达在转染的真核细胞COS-7表面,为进一步建立稳定表达ICAM-1的COS-7细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件.     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

人MUC1与GM-CSF基因融合真核表达质粒的构建与表达

目的：构建人MUC1重复序列串联体基因与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片段经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。结论：人MUC1重复序列串联体与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒的成功构建,为对其免疫原性、生物学特性及免疫治疗的进一步研究奠定了基础。     

野生型/突变型PSD-95真核表达载体的构建及其表达

目的 构建野生型和突变型PSD-95(postsynaptic density protein 95)的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞系中表达.方法 采用RT-PCR扩增大鼠PSD-95的cDNA,以PSD-95-GW1为模板,以PCR扩增PSD-95序列的突变体Myc-ΔSG(-SH3-GK)和Myc-ΔG(-GK),分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ).以脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞,免疫印迹法鉴定PSD-95及其突变体的蛋白表达.结果 限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型/突变型PSD-95基因完全正确;免疫印迹法检测表明,转染的重组质粒能在COS-7细胞中高效表达.结论 构建的PSD-95-pcDNA3.1( )、Myc-ΔSG-pcDNA3.1( )和Myc-ΔG-pcDNA3.1( )重组载体在COS-7细胞系中高效地表达,为深入研究PSD-95在缺血性脑损伤中的作用及机制打下基础.     

HSV-2gD核酸疫苗的构建及免疫效果观察

目的:在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建P6与IL-18串联的重组表达质粒,并在真核细胞中表达。将重组质粒免疫小鼠,观察免疫效果。方法:采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18,以酶切、测序鉴定。将重组质粒分别转染CHO细胞进行瞬时表达,通过间接免疫荧光和Western blot法检测P6的表达情况。将构建的真核表达质粒肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔1周。末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后1个月,处死小鼠,无菌分离脾脏,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率。结果:构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,经间接免疫荧光、Western blot法检测可证实模拟抗原表位序列P6具有近似天然序列的生物学活性。重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体的产生,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18。可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论:成功构建和表达了重组质粒pcD-NA3.1-IL18-P6,其能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,从而为构建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基础。     

空肠弯曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A壳聚糖佐剂疫苗的Th免疫应答及作用

目的:探讨以壳聚糖为佐剂的空肠弯曲菌基因疫苗免疫小鼠后的Th细胞免疫应答状态。方法:昆明小鼠随机分组:设空白对照组、空载体组、pcDNA3.1(-)-peb1A组、壳聚糖+pcDNA3.1(-)-peb1A组,各组均采用小鼠股四头肌注射法。在第0、10、20天免疫,于每次免疫后第10天采集各组小鼠血浆,间接ELISA法检测免疫后不同时间小鼠血浆中Th1、Th2细胞因子的含量。结果:Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ,在第10、20、30天,裸DNA组、佐剂DNA组、空载体组及NS组两两相比均无显著性差异(P>0.05);Th2类细胞因子IL-4、IL-10:实验组高于两对照组,在IL-4的检测中有显著性差异(P<0.05),在IL-10的检测中裸DNA组高于空白对照组有显著性差异(P<0.05),其裸DNA组高于空载体组,仅在第20天有显著性差异(P<0.05);佐剂DNA组高于裸DNA组,在IL-4的检测中有显著性差异(P<0.05),在IL-10的检测中,仅在第10、20天有显著性差异(P<0.05);佐剂DNA组高于两对照组,有显著性差异(P<0.05)。结论:以壳聚糖为佐剂的空肠弯曲菌基因疫苗可促进Th2细胞为主的免疫反应。     

粘膜佐剂LTB优化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻饲免疫效果研究

目的:用真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻饲免疫小鼠,探索粘膜佐剂LTB辅佐NspA所诱发的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平。方法:对真核重组质粒行PCR及双酶切鉴定后大量制备,经鼻饲途径免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA法检测血清中NspA特异性IgG抗体水平及小鼠生殖道灌洗液中NspA特异性sIgA抗体水平;MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量。结果:融合基因pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组小鼠生殖道灌洗液中sIgA(A450:0.316±0.045)明显高于pcDNA3.1(-)/nspA单基因组(P0.05)和其它对照组(P0.01);小鼠血清中IgG(A450:0.643±0.156)水平、脾淋巴细胞刺激指数(SI:1.65±0.32)和脾淋巴细胞诱生的IFN-γ(160.56±25.67pg/ml)水平均明显高于pcDNA3.1(-)/ltB、空质粒pcDNA3.1(-)和PBS对照组(P0.01)。结论:pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因疫苗经鼻饲免疫,能够诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答;粘膜佐剂LTB可辅佐NspA诱导小鼠产生更高水平的生殖道粘膜免疫。     

靶向金黄色葡萄球菌α溶血素人单链重组抗体的制备及功能鉴定

目的 构建靶向金黄色葡萄球菌α溶血素(α-HL)的全人源重组抗体互补片段融合单链抗体(scFv-Fc),并进行表达及功能鉴定.方法 将前期筛选的抗金黄色葡萄球菌α-HL的全人源scFv538通过同源重组的方式插入pcDNA3.1-人IgG1 Fc质粒,构建成scFv538-Fc/pcDNA3.1重组载体,瞬时转染HEK...     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

Cpn0308真核表达载体的构建及对小鼠免疫功能的影响

目的:构建Cpn0308重组质粒pcDNA3.1/His A-Cpn0308,将重组质粒腹腔注射小鼠后观察小鼠免疫反应变化,以期为进一步研究Cpn0308免疫保护性奠定基础。方法:构建pcDNA3.1/His A-Cpn0308,并用菌落PCR、双酶切、序列测定等多种技术确定其正确性;将重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光法检测细胞内蛋白表达情况;重组质粒免疫BALB/c小鼠,一定时间后Western blot检测血清Cpn0308抗体特异性,间接ELISA法检测小鼠血清中Cpn0308 IgG抗体水平、ELISA试剂盒检测血清中细胞因子。结果:pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒构建成功且序列正确;重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光;重组质粒组血清抗体A450x±s为0.343±0.024,pcDNA3.1/His A质粒组为0.174±0.018,PBS组为0.156±0.023,WB结果显示重组质粒组小鼠血清稀释800倍后仍有特异性目的条带出现,对照组不出现;重组质粒组小鼠IFN-γ浓度均值为264 ng/L,IL-4浓度均值为22 ng/L,pcDNA3.1/His A质粒组为:IFN-γ120 ng/L,IL-4 10 ng/L,PBS组为:IFN-γ99 ng/L,IL-4 9 ng/L。重组质粒组IgG抗体水平和细胞因子水平明显升高,与对照组相比有统计学差异。结论:pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达重组质粒构建成功,且能够在真核细胞中表达目的蛋白;重组质粒对小鼠进行免疫后,提高了小鼠血清IgG抗体水平和细胞因子水平,为进一步研究Cpn DNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。     

两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较

目的 利用登革2型病毒(dengue type 2 virus,DENV2)M株和NGC株NS1基因部分扇列PcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 分别构建两株DENV2 NS1基因部分序列(1-413 bp)的PcDNA3.1真核重组质粒和pET28a(+)质粒,进行原核蛋白的表达、鉴定、纯化和定量;并用pcDNA3.1重组质粒免疫BALB/c小鼠,初次免疫及第7天、14天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第7、14、28和56天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血清特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异保护性抗体水平.结果 构建了pET28a(+)-NS1m/pET28a(+)-NS1n原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,NS1基因部分序列获得表达,其相对分子质量均约22.3×103;Western blot表明该目的 蛋白可与抗His标签单克隆抗体结合;经Ni柱亲和层析法得到纯度达92%的表达蛋白,对C6/36细胞有毒性,并可用于ELASA检测.不同DENV2毒株NS1基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类和中和抗体的产生存在差异,M株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DENV2两毒株NS1基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.

Abstract：

Objective To compare the humoral immune response of BALB/c mice immunized by recombinant plasmids PeDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1.Methods Dengue type 2 virus(DENV2)NS1 gene were constructed two partial sequences(1-413 bp)of the pcDNA3.1 eukaryotic plasmids and pET28a(+)plasmid for prokaryotic expression,identification,purification and quantification.The BALB/c mice were immunized by pcDNA3.1-M-NS1,pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmids with adjuvant.Each animal received a primary inoculation and two boosts at 1-week intervals.Then the blood samples of BALB/c mice were collected from different experiment groups at day 7,14,28 and 56,respectively after first immunization.The specific IgM/IgG antibodies for NS1 protein in serum were confirmed by indirect ELISA.And then the activities of the specific protective antibody were determined by cytopathic effect inhibition(CPEI).Results Construction of the pET28a(+)-NS1 m/pET28a(+)-NS1n prokaryotic expression plasmid,SDS-PAGE analysis showed that,NS1 gene partial sequence was expressed,both the relative molecular weight of about 22.3×103:Western blot showed that the protein can bind anti-His tag monoclonal antibody;byNi affinity chromatographywith apurity of 92% protein,on the C6/36 cell toxicity,and can be used ELASA detection.The results showed that the levels of specific IgM/IgG antibody and neutralizing antibody activities were increased in pcDNA3.1-M-NS1 booster immunization group than other groups.The result had been observed longer duration of antibody level in peDNA3.1-M-NS1 booster immunization group.Conclusion Humoral immune response were significantly different between pcDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmid immunized mice groups.     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在QSG7701细胞中的表达和鉴定

目的：进行丙型病毒肝炎核心蛋白真核表达载体的构建，并在人源肝细胞QSC7701中进行表达与鉴定。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1—3011质粒中扩增出HCV核心（core）基因片段，构建peDNA3．1（-）／core重组真核表达质粒。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701，用免疫组织化学SP法检测丙型肝炎病毒核心蛋白的表达，再通过Western blot印迹法进行鉴定。结果：所克隆的core片段大小正确，序列正确；成功的构建了pcDNA3．1（-）／core重组表达质粒，瞬时转染QSG7701细胞，用SP免疫组化检测到了核心蛋白的表达，Western blot印迹法显示其分子量约为21000。结论：丙型病毒肝炎核心蛋白的真核表达载体pcDNA3．1（-）／core在人肝细胞中能有效表达HCV核心蛋白，从而为进一步研究和解析核心蛋白在肝细胞癌变机制中的所起的作用提供了良好的核心蛋白表达系统，同时也为开发丙型肝炎DNA疫苗提供了前期条件。     

α-1,2岩藻糖基转移酶基因293C＞T和658C＞T突变真核细胞稳定表达的研究

目的 建立α-1,2岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-fucosyltransferase gene,FUT1)293C＞T和658C＞T突变真核表达细胞,阐明FUT1突变引起H抗原减弱的机制.方法 抽提类孟买型先证者基因组DNA扩增FUT1全长编码序列,扩增片段与真核表达载体pcDNA3.1连接构建重组表达质粒.采用脂质转染技术将重组质粒转染COS7细胞并进行稳定表达筛选.采用实时荧光定量PCR检测mRNA表达量,应用HPLC检测酶活性,采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western印迹技术鉴定蛋白.结果 构建了pcDNA3.1-FUT1野生型、pcDNA3.1- FUT1 293C＞T、pcDNA3.1-FUT1 658C＞T真核表达重组质粒,转染后通过G418筛选获得了稳定表达FUT1的COS7细胞.以野生型重组体转染细胞中FUT1 mRNA量作为对照,293C＞T和658C＞T重组体转染细胞FUT1 mRNA量分别为野生型的97.10％和104.74％.经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测显示细胞表达相对分子质量约46000大小的目的蛋白片段,pcDNA3.1-FUT1野生型重组体转染细胞表达蛋白可催化相应的酶促反应,而pcDNA3.1-FUT1 293C＞T、pcDNA3.1- FUT1 658C＞T转染细胞蛋白完全失去酶活性.结论 体外实验提示293C＞T和658C＞T突变并不影响FUT1 mRNA转录和蛋白生成,但表达蛋白的酶活性明显下降,从而导致H抗原生成减弱.