人早孕蜕膜基质细胞及免疫活性细胞趋化因子受体CXCR6的表达

目的分析人早孕期蜕膜基质细胞趋化因子配基受体对CXCL16/CXCR6的表达及免疫活性细胞趋化因子受体CXCR6的表达,以探讨CXCL16/CXCR6在蜕膜免疫活性细胞募集中的可能规律.方法收集早孕期蜕膜组织,分离蜕膜基质细胞和免疫细胞,分别采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术分析蜕膜基质细胞CXCL16和CXCR6的表达;流式细胞术分析蜕膜CD56^＋CD16^-NK细胞、CD56^＋CD16^＋NK细胞、NKT细胞、T细胞、γδT细胞、单核细胞CXCR6的表达.结果人早孕蜕膜基质细胞高水平转录趋化因子受体CXCR6,低水平转录其配体CXCL16,但CXCL16和CXCR6在蛋白水平的表达偏低.早孕蜕膜γδT细胞CXCR6阳性率为87.29%;CD14^＋单核细胞CXCR6阳性率为47.71%;NKT细胞CXCR6阳性率为44.14%;T细胞CXCR6表达率为32.91%;而蜕膜两种NK细胞（CD56^＋CD16^-、CD56^＋CD16^＋）几乎不表达CXCR6.结论人γδT细胞、单核细胞、NKT细胞、T细胞可能通过表达趋化因子受体CXCR6被募集到蜕膜局部并驻留,从而参与早孕期母胎界面的免疫调节.     

CXCR7分子对人早孕滋养细胞的调节作用

目的:已有研究表明CXCL12/CXCR4信号途径以自分泌的方式在人早孕滋养细胞增殖和信袭中发挥重要作用,探讨CXCL12的第二受体CXCR7信号对人早孕滋养细胞活力和侵袭功能的调节作用。方法:采用RT-PCR、免疫组化分析CXCR7在人早孕滋养细胞的表达;采用MTT和Transwell侵袭试验分别分析CXCL12/CXCR7信号途径对人早孕滋养细胞活力和侵袭功能的作用。结果:人早孕滋养细胞表达CXCR7分子,外源性给滋养细胞株HTR-8/Svneo添加anti-CXCR4(20μg/ml)和anti-CXCR7(10μg/ml)的中和性抗体后,均能显著抑制滋养细胞的增殖和侵袭能力。结论:人早孕滋养细胞表达CXCR7,通过CXCR7信号升调节滋养细胞的增殖和侵袭,其原因可能是与CXCR4形成二聚体共同参与CXCL12的信号传递。     

早孕滋养细胞膜型及可溶性趋化因子CXCL16表达调控

目的 探讨趋化因子CXCL16在人早孕滋养细胞表达和释放的调控机制.方法 原代培养人早孕滋养细胞,实时定量RT-PCR、免疫化学和ELISA方法分析CXCL16的表达和分泌;ELISA方法分析细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4刺激前后滋养细胞CXCL16的表达和分泌水平;ELISA方法分析ADAM10治疗前后滋养细胞CXCL16的表达及分泌水平.结果 滋养细胞表达并分泌趋化因子CXCL16;IFN-γ治疗后滋养细胞表达和分泌CXCL16水平均显著上升(P<0.01),但TNF-α和IL-4并不影响CXCL16的表达或分泌;ADAM10可以加速CXCL16自滋养细胞的脱落,但并不上调CXCL16的合成.结论 IFN-γ和ADAM10参与调控母胎界面滋养细胞趋化因子CXCL16的合成和分泌.     

人早孕滋养细胞条件培养液对外周血单个核细胞的趋化效应

目的:探讨人早孕滋养细胞在蜕膜免疫细胞选择性募集中的可能机制。方法:分离纯化人早孕滋养细胞进行原代培养,制备滋养细胞条件培养液(CM);将CM倍比稀释加入Transwell下室,分离的人外周血单个核细胞加入上室进行趋化实验,流式细胞术分析CM对PBMC各型免疫细胞的趋化效应。结果:4倍稀释的CM即显示对外周CD56+CD16-NK细胞、CD56+CD16+NK细胞、单核细胞的趋化活性,随CM浓度上升,各细胞的趋化活性也升高(P0.001);CM原液也可明显趋化外周T细胞和γδT细胞(P0.05);各浓度CM对NKT细胞均不表现趋化作用。CM趋化后的免疫细胞组成与趋化前显著不同,而与蜕膜免疫细胞的组成相似。结论:人早孕滋养细胞能够分泌多种趋化因子,募集外周血免疫细胞到达母胎界面,帮助形成蜕膜独特的免疫微环境,并维持母胎免疫耐受。     

人早孕期蜕膜基质细胞下调蜕膜NK细胞杀伤活性

通过分析人早孕期蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)对蜕膜NK细胞(dNK)表面趋化因子受体CXCR4与细胞内颗粒酶B表达水平的影响,研究早孕蜕膜基质细胞对局部NK细胞的训导作用。收集早孕蜕膜组织,分离DSC及蜕膜免疫活性细胞,进一步通过磁珠分选蜕膜CD3-CD56bright NK细胞,将分离的蜕膜NK细胞与DSC按1∶1比例共培养24h,收集蜕膜NK细胞,流式细胞仪检测其表面趋化因子受体CXCR4和细胞内颗粒酶B(granzyme B)的表达水平。结果显示,与对照组相比,在与DSC细胞共培养之后,趋化因子受体CXCR4+NK细胞的百分率明显上升,而蜕膜NK细胞内颗粒酶B阳性率显著下降(P<0.05)。结果表明,人早孕母-胎界面DSC细胞上调蜕膜NK细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达,下调NK细胞内颗粒酶B的表达水平,可能抑制其杀伤活性。     

人早孕期蜕膜基质细胞对蜕膜NK细胞分泌IL-22的调节作用

目的:探讨蜕膜基质细胞(Decidual stromal cells,DSCs)与蜕膜NK细胞(dNK)共培养后IL-22的分泌水平。方法:收集早孕蜕膜组织,分离蜕膜基质细胞(DSCs)及蜕膜免疫活性细胞(Decidual immunocytes,DICs),磁珠分选蜕膜CD56brightCD3-NK细胞,再与DSC按不同比例直接接触共培养(dNK∶DSC为1∶1、1∶2、1∶3)24小时,收集上清。ELISA检测上清中IL-22的表达。结果:与对照组相比,DSC能上调dNK分泌IL-22。结论:蜕膜基质细胞可以促进蜕膜NK细胞分泌IL-22。     

白细胞介素25促进早孕期母-胎界面滋养细胞的增殖

探索人早孕绒毛组织和滋养细胞中白细胞介素25(interleukin 25,IL-25)及其受体的表达,以及IL-25对滋养细胞的促增殖作用。免疫组织化学法检测IL-25在正常早孕期绒毛组织的表达;流式细胞术检测IL-25及其受体在正常妊娠和自然流产绒毛组织的滋养细胞中的表达;CCK-8实验分析重组IL-25(rhIL-25)及其中和性抗体对人绒毛膜滋养细胞株HTR-8/SVneo细胞活力的影响。结果显示IL-25在正常绒毛组织滋养细胞中呈阳性表达,自然流产患者绒毛滋养细胞的IL-25及其受体的表达均低于正常妊娠(P0.001);重组IL-25处理后,HTR-8/SVneo细胞活力以时间依赖和剂量依赖方式显著增强(P0.001或P0.000 1);相反,IL-25中和性抗体明显抑制其细胞活力(P0.05或P0.01或P0.001)。结果表明人早孕母-胎界面滋养细胞表达IL-25,以自分泌方式促进自身增殖,IL-25异常低表达可能参与反复自然流产的发病机制。     

人早孕滋养细胞与蜕膜基质细胞共培养对外周NK细胞的影响

为了分析人早孕母-胎界面功能细胞对外周NK细胞表型及功能的调节作用,我们模拟母-胎界面微环境,建立滋养细胞和蜕膜基质细胞共培养系统,并将此共培养体系与外周NK细胞共培养,采用流式细胞术分析NK细胞的表型和细胞因子的表达,用细胞毒检测试剂盒检测NK细胞的细胞毒活性。研究发现,母-胎界面滋养细胞与蜕膜基质细胞共培养体系能够显著上调外周NK细胞抑制型受体KIR2DL1的表达,下调外周NK细胞杀伤性受体NKp44的表达;显著上调Th2型细胞因子IL-10的表达水平,下调外周NK细胞穿孔素perforin表达及其细胞毒活性。结果表明,母-胎界面功能细胞能够诱导外周NK细胞的耐受表型及Th2型优势,下调外周及蜕膜NK细胞的细胞毒活性,从而有利于形成母-胎界面免疫耐受微环境。     

早孕期人滋养细胞CXCR4/CXCL12的表达及低氧对其的影响

目的：研究人早孕期滋养细胞CXCR4/CXCL12的表达情况及低氧对其表达的调节作用.方法：免疫组织化学法检测早孕期绒毛组织中及原代培养的滋养细胞CXCR4/CXCL12的表达情况;实时定量PCR检测低氧状态下滋养细胞CXCR4 mRNA水平.结果：胎盘绒毛柱、滋养细胞及血管内均有CXCR4/CXCL12表达;低氧培养12、24、48和72小时后滋养细胞CXCR4 mRNA表达增加,显著高于正常氧条件下的表达情况.结论：早孕期胎盘表达CXCR4/CXCL12对于维系正常妊娠的顺利进行可能发挥重要作用;低氧是CXCR4表达的重要调节因子,可能参与了妊娠的病理生理过程.     

IgA肾病患者外周血γδT细胞分泌TGF-β1的功能

目的：研究IgA肾病患者外周血γδT细胞分泌TGF-β1的功能。方法：用流式细胞仪分析外周血γδT细胞比率并检测血清IgA的水平，以抗TCRγδ单克隆抗体（mAb）固相法，体外选择性地扩增γδT细胞住体外培养的条件下，以抗CD3抗体刺激48h后．用ELISA法测定培养体系中TGF-β1的水平。结果：IgA肾病患暂外周血γδT细胞的比例升高，并与血清IgA的水平呈正相关。用抗TCRγδmAb固相法能获得高纯度的γδT细胞。经抗CD3抗体刺激的IgA肾病患者的γδT分泌TGF-β1的量比正常对照组明显升高。结论：IgA肾病患者的γδT细胞可通过大量分泌TGF-β1参与该病的发生、发展。     

人早孕母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3表达

目的：研究正常早孕绒毛及蜕膜组织细胞因子信号转导负调控因子（Suppressors of cytoldne signaling，SOCS）基因和蛋白水平表达，以揭示SOCS在母胎界面生理性调节作用。方法：半定量RT-PCR检测早孕绒毛组织、蜕膜组织及原代培养早孕滋养细胞、蜕膜基质细胞SOCS1、SOCS2、SOCS3 mRNA水平；Western blot检测早孕绒毛组织及蜕膜组织SOCS1、SOCS2、SOCS3蛋白表达；免疫组化定位SOCS1、SOCS2、SOCS3在早孕绒毛组织、蜕膜组织表达；ELISA检测滋养细胞、蜕膜基质细胞分泌IL-10、IFN-γ。结果：正常母胎界面见SOCS1、SOCS2、SOCS3基因表达，其中SOCS3绒毛／蜕膜阳性率73．7％／71．1％；SOCS2绒毛／蜕膜阳性率50．0％／39．5％，SOCS1最少，绒毛／蜕膜阳性率34．2％／31．6％；SOCS1、SOCS2、SOCS3蛋白表达与转录水平基本一致；正常母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3表达主要定位于绒毛滋养细胞和蜕膜间质；体外无血清培养滋养细胞和蜕膜基质细胞SOCS2、SOCS3低表达，SOCS1未见表达，其分泌的IL-10随时间而增高（P〈0．05）。结论：正常早孕母胎界面表达SOCS1、SOCS2、SOCS3，无刺激条件下滋养细胞和蜕膜基质细胞低表达SOCS2、SOCS3，SOCS在正常妊娠Th平衡中具有重要意义。     

IgA肾病大鼠外周血、肾组织γδT细胞分泌TGF-β1功能的实验研究

目的研究IgA肾病大鼠外周血、肾组织γδT淋巴细胞分泌细胞因子TGF-β1的功能。方法流式细胞仪分析IgA肾病大鼠外周血、肾组织γδT淋巴细胞比例以及血清IgA水平,并体外选择性扩增γδT细胞,在体外培养条件下,测定培养体系中细胞因子TGF-β1的表达。结果IgA肾病大鼠外周血、肾组织中γδT淋巴细胞比例升高,并能异常分泌TGF-β1细胞因子。结论γδT细胞可能是通过分泌TGF-β1参与IgA肾病的发生与进展。     

趋化因子及其受体CXCL16/CXCR6在人肺癌转移中的作用

目的 探讨CXCL16/CXCR6在肺癌的表达模式及其对肺癌细胞系生物学行为的影响.方法 免疫组织化学技术分析CXCL16/CXCR6蛋白在人肺癌组织的表达;免疫细胞化学分析CXCL16/CXCR6在3种肺癌细胞系A549、95D和H292的表达;MTT试验及迁移、侵袭试验分别分析CXCL16时A549、95D和H292细胞体外增殖活力和侵袭能力的调节作用.结果 人肺癌组织高表达CXCR6和CXCL16蛋白;A549、95D和H292细胞均表达CXCL16和CXCR6蛋白;外源性CXCL16可明显促进A549、95D和H292细胞的体外增殖活力和侵袭能力,且CXCL16中和抗体可以有效阻断CXCL16蛋白对3种肺癌细胞系的刺激作用.结论 CXCL16/CXCR6可能是参与肺癌侵袭转移的分子.     

IL-37通过作用树突状细胞调节CD8~+T细胞功能

将小鼠骨髓细胞诱导分化为DC,用IL-37处理后,流式细胞术检测细胞表面共刺激分子(CD86、CD80),RT-PCR法检测TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12和TGF-βmRNA的表达,多重液相蛋白定量CBA试剂盒及ELISA试剂盒检测细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-12、IFN-γ、MCP-1和TGF-β蛋白的表达。Western blotting方法检测DC中磷酸化蛋白的表达。将DC与T细胞共培养,流式细胞术检测CD8+T细胞增殖及活化程度(CFSE、CD69)。结果显示,IL-37能够降低表达CD80+/CD86+的DC数量。促炎因子TNF-α、IL-12和IL-6的表达被明显抑制,而T淋巴细胞抑制因子TGF-β明显增高。IL-37预处理的DC明显降低T淋巴细胞的增殖和活化能力。IL-37能够降低DC中磷酸化ERK和NF-κB的表达。IL-37处理的DC对CD8+T细胞产生明显抑制作用。结果表明,IL-37能够通过影响ERK和NF-κB依赖的信号通路抑制DC的成熟和免疫反应,从而抑制CD8+T细胞的活化及增殖。     

结核分枝杆菌抗原和TCRγδ抗体诱导人γδT细胞分化并产生IL-17

目的探讨结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)和抗T细胞受体γδ单克隆抗体(TCRγδm Ab)在刺激人γδT细胞诱导分化产生IL-17中的作用。方法健康人外周血单个核细胞经过免疫磁珠分选得到纯化的γδT细胞后,加入MTB-HAg或包被的TCRγδm Ab,再加或不加CD28 m Ab进行刺激,同时加或不加IL-17极化细胞因子组合(CK)(IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-23),极化诱导培养10~12 d。然后收集诱导极化培养的γδT细胞,经佛波醇酯和离子霉素再刺激6 h后,用ELISPOT法检测产生IL-17的细胞数。结果经刺激和诱导分化培养的γδT细胞用ELISPOT法检测产生IL-17的细胞数发现,TCRγδm Ab联合CK组与TCRγδm Ab组相比明显增加,TCRγδm Ab联合CD28 m Ab组与TCRγδm Ab同时联合CD28 m Ab和CK组相比明显减少。TCRγδm Ab同时联合CD28 m Ab和CK组与TCRγδm Ab联合CK组相比明显增多。MTB-Hag同时联合CD28 m Ab和CK组与TCRγδm Ab同时联合CD28 m Ab和CK组相比显著减少,但与MTB-HAg联合CD28 m Ab组相比明显增多。结论诱导Th17分化的CK(IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-23)也能诱导人γδT细胞分化产生IL-17,TCRγδm Ab刺激γδT细胞增殖后诱导分化产生IL-17的活性比MTB-HAg更强。另外,CD28在TCRγδm Ab激活γδT细胞诱导产生IL-17的过程中也有重要作用。     

环孢素A对人蜕膜免疫细胞分泌IL-10与IFN-γ的调控作用

探讨环孢素A(CsA)对人早孕期母胎界面主要组成细胞IL-10与IFN-γ分泌的调节作用,为反复自然流产等妊娠疾患的治疗提供新线索。收集6~10孕周行人工流产术的正常妊娠妇女绒毛和蜕膜组织;分离、培养蜕膜免疫细胞、滋养细胞与蜕膜基质细胞;ELISA法检测给予环孢素A(0μmol/L,1μmol/L)24、48、72 h后蜕膜免疫细胞、滋养细胞及蜕膜基质细胞培养上清中IL-10与IFNγ-分泌水平。结果显示,(1)1μmol/L CsA可以明显促进人早孕期蜕膜免疫细胞分泌IL-10(P<0.01),并抑制其产生IFN-γ(P<0.01);1μmol/L CsA不影响原代培养的人早孕期滋养细胞与蜕膜基质细胞IL-10的分泌(P>0.05);不论是否给予CsA处理,原代培养的人早孕期滋养细胞与蜕膜基质细胞均不产生IFN-γ。结果表明,CsA通过促进蜕膜免疫细胞分泌IL-10,并抑制其产生IFNγ-,从而有利于母胎界面形成Th2型免疫优势。     

ESAT-6对人外周血γδT细胞IL-17的影响及其信号通路的研究

目的:观察ESAT-6对人外周血γδT细胞表达IL-17的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨。方法:用Ficoll密度梯度离心法从健康人外周血中分离单个核细胞,培养3天后用流式细胞仪分离纯化γδT细胞,并用唑来磷酸及IL-2刺激扩增γδT细胞,12天后用ESAT-6刺激γδT细胞,并给予信号传导及转录激活因子3(STAT3)抑制剂S3I-201,设置未加入ESAT-6及不加任何抑制剂的对照组,用PCR法检测IL-17、STAT-3的基因转录水平,用ELISA法检测细胞培养液中IL-17的含量,用Western blot检测STAT3蛋白的表达。结果:ESAT-6能显著提高STAT3及IL-17的基因转录及蛋白表达(P<0.01),且S3I-201能显著抑制ESAT-6所致的γδT细胞IL-17mRNA的转录及淋巴因子的增加(P<0.01)。结论:ESAT-6能提高外周血γδT细胞IL-17、STAT3的转录及表达,ESAT-6增强γδT细胞IL-17表达的机制可能与STAT3信号通路有关。     

蜕膜巨噬细胞通过外泌体调控滋养细胞生物学行为参与不明原因复发性流产

目的:研究蜕膜巨噬细胞分泌的外泌体是否调控滋养细胞生物学行为,参与不明原因复发性流产(URSA)的发生。方法:收集正常早孕人工流产妇女和URSA患者的蜕膜组织,采用免疫磁珠法分选巨噬细胞。分离蜕膜巨噬细胞外泌体,透射电镜观察其形态,Western blot检测外泌体标记蛋白CD63的表达。荧光显微镜检测外泌体能否被滋养细胞摄取。将正常蜕膜巨噬细胞外泌体和URSA患者蜕膜巨噬细胞外泌体分别与滋养细胞HTR8/Snveo共培养,采用MTS法检测共培养后1 d、2 d和3 d滋养细胞的细胞活力;Transwell迁移实验检测共培养后滋养细胞的迁移能力。结果:透射电镜显示,外泌体直径40～80 nm,近似圆形。Western blot结果表明蜕膜巨噬细胞外泌体高表达CD63。荧光显微镜结果显示,外泌体可被滋养细胞内吞。MTS实验结果显示,与正常组相比,URSA组蜕膜巨噬细胞外泌体在共培养后第2和第3天均抑制滋养细胞的活力(P0.05)。Transwell迁移实验结果表明,与对照组相比,URSA组蜕膜巨噬细胞外泌体明显抑制滋养细胞的迁移能力(P0.01)。结论:蜕膜巨噬细胞可能通过外泌体调控滋养细胞生物学行为,参与母胎免疫调节,与URSA发病相关。     

可溶性Jagged1/Fc对DC-T细胞共培养中细胞因子表达的影响

目的:研究可溶性Jagged1/Fc对DC-T细胞共培养体系中TGF-β1、IL-10、IL-4、IL-2、IFN-γ及TNF-α表达水平的影响.方法:应用IL-4和GM-CSF诱导培养小鼠骨髓细胞,流式细胞术检测髓系树突状细胞(DC)分化标志CD11c;将等量的淋巴细胞与之共培养,ELISA检测共培养上清TGF-β1的含量,Luminex100检测IL-10、IL-4、IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量.结果:可溶性Jagged1/Fc处理组TGF-β1和IL-10的水平与DAPT对照组之间无统计学意义(P>0.05),而IL-4、IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平升高(P<0.05).结论:Jagged1/Fc能促进DC-T细胞相互作用导致IL-4、IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平上调.     

调控γδT细胞受体对脑缺血再灌注小鼠Treg及细胞因子的影响北大核心CSCD

目的:探索γδT细胞受体对心脏骤停-心肺复苏(CPCR)后脑缺血再灌注小鼠体内Treg及相关细胞因子的影响。方法:90只雄性C57BL/6小鼠随机分为CPCR组、对照组和CPCR+γδT细胞受体拮抗组(CPCR后注射γδT细胞受体拮抗剂),每组30只。收集小鼠脑组织,TUNEL检测神经元凋亡,HE染色观察神经元损伤情况,Western blot检测脑组织Foxp3蛋白表达,ELISA检测血清中MPO活性、TNF-α、IL-6和IL-1β浓度。结果:与对照组相比,CPCR组小鼠神经元凋亡显著增加(P<0.05),脑组织损伤严重,MPO活性、TNF-α、IL-6和IL-1β浓度显著上升(P<0.05),Foxp3表达显著下调。与CPCR组相比,CPCR+γδT细胞受体拮抗组大鼠神经元凋亡减少(P<0.05),脑组织损伤减轻,MPO活性、TNF-α、IL-6和IL-1β浓度明显降低(P<0.05),Foxp3表达显著上调。结论:γδT细胞受体拮抗剂可通过抑制炎症反应缓解CPCR后脑缺血再灌注损伤。