实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

基孔肯雅病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法:人工合成基孔肯雅病毒部分有代表性的序列核酸作为阳性对照模板,设计几组实时荧光PCR引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应体系条件.结果:建立的基孔肯雅病毒的实时荧光PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CHIK-FP终浓度500 nM,反向引物CHIK-RP终浓度1000 nM,探针CHIK-Probe终浓度250 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃ 10 min,95℃10 s→62℃30 S 45次循环.结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,检测基孔肯雅病毒。方法通过序列比对挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列,在此序列上设计引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达21拷贝/μl,通过检测与传播媒介相似的流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应。结论该方法的建立在基孔肯雅热的疾病防控方面有较好的应用前景。     

基孔肯雅病毒实验室检测方法研究进展

基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒引起的一种急性虫媒传染病,基孔肯雅病毒属甲病毒属,披膜病毒科。近年来,该病毒曾引起全球多处疫情暴发,并造成全球性的公共卫生问题。本文对基孔肯雅病毒及其实验室检测方法作一综述,以指导国内开展对该病的检测。     

纳米磁分离实时荧光PCR定量检测登革2型病毒

目的建立一种登革2型病毒的快速提取和检测的方法。方法根据登革2型病毒的基因保守区,设计一套特异的实时荧光PCR的引物与探针,设计一对引物用于构建定量检测的标准品,以建立登革2型病毒实时荧光定量PCR检测方法;选用纳米磁微粒,建立纳米磁分离提取登革2型病毒RNA的方法,并对其核酸提取效果进行评估。结果纳米磁分离实时荧光PCR方法检测登革2型病毒具有快速、灵敏、特异的特点。在2.9×102~2.9×109copies/μl的范围内循环阀值(C)t值与病毒拷贝数的对数值存在线性关系(R2=0.99)。结论建立的纳米磁分离实时荧光定量PCR方法能够快速准确地检测登革2型病毒,在口岸卫生检疫中具有很好的应用价值。     

扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR快速检测技术。方法 人工合成扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白GP基因上1 969～2 113 bp的保守特异片段,克隆到pUC57重组质粒中,构建阳性模板;以103～109拷贝数的重组质粒样品共7组作为标准品,制作标准曲线;设计上游引物5' - GAACCACATGATTGGACCAAGA - 3'、下游引物5' - TAACTCCAATACCTGCCGGTATC - 3'及TaqMan探针FAM 5' - TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG - 3' BHQ1,采用普通PCR和实时荧光定量PCR,检测其特异性和灵敏度。结果 克隆出含GP 1 969～2 113 bp片段的阳性重组质粒pUC57 - GP,其浓度为97.75 ng/μl;以pUC57 - GP为标准品,制备标准曲线,拷贝数为103～109 copies/μL有较好线性关系,相关系数R2 = 0.999;能特异性检测扎伊尔型埃博拉病毒,而与I型登革病毒、寨卡病毒无交叉反应,其检测最低拷贝数达3.10×101copies/μl。 结论 建立了扎伊尔型埃博拉病毒荧光定量PCR快速检测技术,具有快速、灵敏、特异、定量检测等特点,可为埃博拉疫情的综合防控提供技术支撑。     

基孔肯雅病毒LAMP检测方法的建立及其应用研究

目的:建立快速、灵敏、特异的基孔肯雅病毒(CHIKV)环介导等温基因扩增(LAMP)检测方法,将该方法应用于基孔肯雅热(CHIK)可疑患者的快速筛查。方法:根据CHIKV核酸序列多重比对结果设计并合成LAMP专用的扩增引物,摸索最佳反应条件,建立灵敏、特异的CHIKV核酸LAMP检测新方法;应用该方法对疑似患者血清中提取的核酸进行快速检测。结果:本方法对CHIKV样本的检测灵敏度达到27拷贝/反应,检测灵敏度高于普通PCR法,略低于实时荧光PCR法。本方法快速、灵敏,并具有较高的特异性和很好的重复性,可在两小时内对CHIK疑似病例进行准确诊断。利用本方法对入境CHIK患者及国内患者样本进行检测,均取得了良好的效果。结论:本方法适合国境口岸一线及基层卫生机构对CHIK可疑患者进行快速检测,对防止CHIK疫情向我国的传播及保障我国公共卫生安全均具有重要意义。     

实时荧光PCR检测诺瓦克病毒的应用研究

目的应用实时荧光PCR方法对诺瓦克病毒性急性胃肠炎进行快速检测，为疾病预防控制提供准确可靠的实验诊断依据。方法采集一起急性胃肠炎暴发流行患者的1份粪便、5份肛拭和1份呕吐物，进行实时荧光PCR检测。结果实时荧光PCR检测有1份病人粪便和1份病人肛拭样本中诺瓦克病毒核酸呈阳性。结论这是一起由诺瓦克病毒感染引起的急性胃肠炎暴发流行。     

亚洲型寨卡病毒实时荧光定量PCR检测方法建立

目的分析亚洲型寨卡病毒基因组序列特征,建立亚洲型寨卡病毒的荧光定量PCR检测技术。方法通过分析亚洲型寨卡病毒全基因组核酸序列,选取亚洲型寨卡病毒的保守区设计引物和TaqMan探针,建立标准曲线并检测其特异性与敏感性。结果荧光定量PCR测试结果表明所设计的引物和探针特异性良好,对非洲型寨卡病毒、Ⅰ～Ⅳ型登革病毒和丙型肝炎病毒核酸检测无交叉反应;同时灵敏度较高,可达3.415×10~0 copies/μL;构建了标准曲线,回归方程为Y=–3.227 3logX+38.79,相关系数R^2=1,扩增效率E=102%。结论建立了一种检测亚洲型寨卡病毒的荧光定量PCR技术,可用于临床亚洲型寨卡病毒感染患者的病原分型、早期诊断及预防。     

实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的建立和应用

目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的早期诊断和疫情监测。方法:根据GenBank登录的IHHNV毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqm an探针。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性、灵敏度、重复性,并与普通PCR进行盲样测试的比对。结果:本法线性范围5×102~5×107拷贝/ml,检出限5×101拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR100倍,特异性高于普通PCR,重复性极好(S=0.035~0.39,CV=0.13%~1.05%),检测时间为普通PCR的1/5,现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR 26.00%。结论:本研究建立Taqm an实时荧光定量PCR用于对虾IH-HNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点。     

转基因食品多重定性PCR及实时荧光定量PCR检测方法的研究

多重PCR方法是建立在传统PCR检测技术基础上的快速简便的检测手段。本研究以国际市场上转基因食品的主流产品转抗除草剂大豆 (RR大豆 )、Bt176玉米及我国自行研发的抗菌肽辣椒为材料 ,以多重PCR方法为基础 ,通过基因片段筛选及引物比例调整 ,进行了转基因食品的调控元件、外源结构基因及物种内源特性基因三种片段的单管同时扩增。结果与常规PCR方法检测结果完全相符。同时 ,针对RR大豆 ,对几类大豆产品运用实时定量PCR方法进行定量分析 ,得到相应的转基因成分的含量。操作简便快速 ,检测结果与标准相符 ,检测灵敏度较常规PCR更高。     

实时荧光定量PCR技术在疫情和食物中毒检测中的应用

实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术是一种日益成熟的生物体核酸检测技术,由于其具有快速、特异、敏感、定量、安全、操作简便等特点,在医学诊断、卫生防疫等领域中得到广泛的应用。目前,针对常见疫情和食物中毒中的病源微生物,已设计和开发了相应的特异性引物及探针,可以对这些微生物进行快速检测,从而提高了政府及相关部门应对和解决突发公共卫生事件的能力。     

荧光定量PCR快速检测幽门螺杆菌的研究

目的:建立一种快速检测幽门螺杆菌的荧光定量PCR方法。方法:根据每个幽门螺杆菌有一个拷贝的尿素酶A基因,设计并优化SYBGReen荧光定量PCR条件,评价荧光定量PCR的灵敏度与重复性;收集胃粘膜标本65份,并对其同时进行培养和荧光定量PCR检测。结果:该方法连续8个浓度模板良好线性关系(相关系数,0.997),灵敏度达1拷贝/微升;随机选取两个浓度的样本做重复试验,结果显示具有较高的重复性。65份标本中采用荧光定量PCR方法检出幽门螺杆菌42例(64.62%);细菌培养方法检出31例HP(47.69%)。结论:荧光定量PCR技术能够快速、准确检测幽门螺杆菌,适合于临床检测及科学研究。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

实时荧光PCR在食源性疾病中的应用

目的:探讨实时荧光PCR快速检测在食物中毒中病原学基因诊断的应用。方法:采用实时荧光PCR检测技术对一起副溶血性弧菌引起的食物中毒患者的粪便和肛拭增菌液进行快速检测,同时采用传统的分离方法和细菌生化鉴定仪的生化鉴定,及日本生研株式会社生产的肠炎溶血性弧菌型别免疫血清(K型别)分型。结果:在这一起食物中毒的患者中,实时荧光PCR检测6份粪便和肛拭增菌液,其中,4份阳性,并从PCR阳性的增菌液中分离到4株副溶血性弧菌K6型。结论:实时荧光定量PCR技术特异性强,灵敏度高,能在采样后数小时内检测到病原菌的DNA,达到快速诊断的目的,在食物中毒的快速诊断上起重要作用。     

实时荧光定量PCR快速检测无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染

目的　探讨将实时荧光定量PCR（qPCR）检测细菌16S rRNA基因用于快速判断无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染,并评价其分析性能。方法　以细菌16S rRNA基因为目标设计通用引物、通用探针及革兰阴性（GN）菌探针,对14种标准菌株、20种临床菌株、白色念珠菌、乙型肝炎病毒(HBV)、人基因组及阴性对照进行qPCR检测,评价该方法引物和探针的通用性和特异性及检测限。以104 cfu/ml菌悬液、阴性对照的循环域（Ct）值99%置信区间下限分别作为尿路、其他无菌性体液细菌感染判定的分界值。用271例临床无菌性体液标本评价qPCR法的临床效能。结果　通用探针-qPCR,所有实验菌株检测为阳性。GN探针-qPCR,所有实验革兰阴性菌株检测为阳性。通用探针的检测限为1×101～1×102 cfu/ml。GN探针的检测限可低至1.0×101 cfu/ml。判定尿路、其他无菌性体液细菌感染的分界值分别为23.76、29.37。结论　应用细菌16S rRNA基因通用探针和GN探针的qPCR方法通用性好、特异性强、检测限低,可快速检测临床无菌性体液常见细菌感染,为临床提供准确、可靠的病原学诊断依据。     

肠出血性大肠埃希菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立快速、灵敏、特异、有效的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)双重实时荧光PCR检测方法。方法根据GenBank公布的EHEC的stx1和stx2基因序列设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针分别用FAM-BHQ1和HEX-BHQ1标记stx1及stx2,建立双重实时荧光PCR反应体系,并对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。结果显示该方法特异性、重复性好、灵敏度高,最低检出限可达102cfu/ml,117.5fg/μl。结论建立的双重实时荧光PCR方法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

某再生资源利用企业3人溺亡事故调查

正2015年7月,某再生资源利用企业1名作业人员进入反应池内收集移除填料时不慎坠入池中,另2名作业人员在现场情况不明的条件下盲目施救,造成3人相继昏迷,经送医院抢救无效死亡。现报告如下。1事故经过2015年7月29日上午8时许,某再生资源利用企业分管生产副总经理上班后先打开了给车间内各反应池通风的罗茨阀,并打开各反应池内的通风开关。随后分派4人清理2个好