TGF-β1、TβRⅡ、c-myc在急性白血病中的表达及其意义

为了探讨转化生长因子β（transforming growth factor—beta，TGF-β）信号转导途径失活与急性白血病的关系，用S—P免疫细胞化学法检测急性白血病患者骨髓单个核细胞中TGF—β1及其Ⅱ型受体（TβRⅡ）和信号下游靶基因蛋白C-myc的表达。结果发现，白血病患者骨髓单个核细胞中TGF—β1的表达水平与正常对照无显著性差异（P〉0．05），TβRⅡ的表达水平明显低于正常对照（P〈0．05），c-myc的表达水平明显高于正常对照（P〈0．05），但以上各指标在急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病之间无显著性差异（P〉0．05），TβRⅡ和c-myc表达率有负相关关系（r=-0．474，P〈0．01）。结论：TGF-β信号转导途径失活使细胞逃逸了TGF-β的生长抑制，TGF-β信号转导途径失活的一个重要机制就是通过TGF-βⅡ型受体的下调使c-myc失去抑制而高表达，促进白血病发生。     

银染PCR-SSCP检测卵巢癌TGF-β及Smads信号改变的意义

目的：通过检测卵巢癌TGF-β介导的信号转导通路的受体、Smads基因突变，研究该信号转导在卵巢癌发生中的作用，揭示卵巢癌的发病机制。方法：收集卵巢癌手术切除标本，并以病人正常组织作为对照，提取DNA，依据待测基因的核心高突变区设计引物，采用银染PCR—SSCP法检测TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2及Smad4基因突变。结果TBRⅠ(16／46)、TβRⅡ(29／46)、Smad2(18／46)在卵巢癌中有较高突变率，Smad4(1／46)仅零星突变。结论：TGF-β介导的信号转导途径在卵巢癌的发生中起重要作用。     

全反式维甲酸诱导NB4细胞分化过程中IL-3受体系统表达变化

IL-3受体（IL-3R）是异源二聚体膜受体,由相应的α亚基（IL-3Rα,GM-CSFRα,IL-5Rα）和β共同亚基（hβc）组成,α亚基能够特异性与相应的配体结合,β共同亚基通过与相应α亚基组成高亲和力的受体,传递细胞信号,调节造血祖细胞的增殖与分化。为研究IL-3受体系统（IL-3Rα,GM-CSFRα和hβc）在髓系分化中的作用,采用实时定量RT-PCR检测全反式维甲酸（ATRA）诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞分化过程IL-3Rα,GM-CSFRα和hβc的表达变化,同时应用DNA序列分析检测IL-3Rα,GM-CSFRα和hβc mRNA序列变化。结果显示：全反式维甲酸处理NB4细胞后,细胞发生分化,同时细胞增殖受抑制。ATRA作用24小时NB4细胞IL-3Rα mRNA表达水平显著下调,但随着细胞分化,其表达水平又逐渐恢复;而GM-CSFRα mRNA和hβc的mRNA表达水平则随着细胞分化逐渐上调。DNA序列分析表明,NB4细胞分化前后IL-3Rα和GM-CSFRα的mRNA序列没有变化,而NB4细胞分化前hβc的mRNA序列以截短突变为主,NB4细胞分化后hβc的mRNA序列以野生型为主。结论：NB4细胞存在IL-3受体异常表达,表现为高表达IL-3Rα和hβc的胞内区截短突变,两者在NB4细胞的过度增殖与分化受阻的过程起重要作用。     

PML-RARα融合蛋白对Smad蛋白转录调节作用的影响

目的:探讨急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML-RAR$融合蛋白对Smad蛋白转录调节作用的影响及其机制。方法:用PML-RAR$融合蛋白表达质粒与(CAGA)9-lux报告基因质粒共转染293T细胞,测定荧光素酶活性,分析PML-RAR$融合蛋白对(CAGA)9-lux报告基因转录活性的影响;利用共聚焦显微镜观察APLNB4细胞中间接免疫荧光法标记的PML-RAR$融合蛋白和Smad2、Smad3蛋白。结果:PML-RAR$融合蛋白可使(CAGA)9-lux报告基因转录活性下降(P<0.05);NB4细胞中PML-RAR$融合蛋白和Smad2、Smad3蛋白有共定位现象。结论:NB4细胞中的PML-RAR$融合蛋白可与Smad2、Smad3蛋白结合,抑制TGF-β1信号途径的传导。     

全反式维甲酸诱导APL细胞分化过程中钙信号途径基因表达水平的变化

为研究钙信号途径在髓系分化中的作用,采用基因芯片技术检测了钙信号途径相关基因在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中的表达情况,并运用实时定量RT-PCR验证基因芯片部分结果,同时检测这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独和联合作用于NB4-R1细胞和ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化时的表达情况。结果发现:在ATRA诱导NB4细胞分化过程中,许多能直接调节胞内钙离子浓度的基因发生了变化,同时发现许多钙信号途径下游的效应分子的表达上调,并得到实时定量RT-PCR验证。这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独作用于NB4-R1细胞时变化不大,而在ATRA和8-CPT-cAMP联合作用于NB4-R1细胞分化时与ATRA诱导NB4细胞分化时的表达变化相似。另外,以上基因在ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化的变化情况与诱导NB4细胞分化时相似。结论:钙信号途径可能参与了ATRA诱导的APL细胞分化。     

全反式维A酸诱导的部分分化的白血病细胞具有去分化能力

目的:观察人急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞系NB4细胞株经全反式维A酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)诱导分化作用后,部分分化的白血病细胞的去分化能力。方法 :采用1μmol/L的ATRA处理NB4细胞48 h、72 h、96 h、120 h、168 h、216 h、288 h、336 h后,并通过瑞氏染色观察细胞形态学,流式细胞术检测CD11b的表达,用单克隆形成实验分别检测分化细胞的核型及撤药后各时间点单个CD11b+细胞的克隆形成能力,用蛋白印迹法观察细胞PML/RARα、RARα及PU.1等蛋白的表达变化。结果:NB4细胞CD11b的表达水平在ATRA处理48 h后达到高峰,之后稳定表达;ATRA处理后,NB4细胞中成熟中性粒细胞的比例也随处理时间的延长而增加,ATRA处理120 h比处理96 h,成熟中性粒细胞的比例有明显的增加(P<0.01)。结论:人类APL系NB4细胞经ATRA诱导后发生不同程度的分化,在撤去ATRA后,处于部分分化阶段的白血病细胞仍能通过"去分化"而重新获得无限增殖的特性。     

转化生长因子β1及其受体以及Smad4和Smad7在胃癌组织表达的临床病理学意义

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)及其受体(TGF-βRⅡ)和Smad4、Smad7蛋白在胃癌组织中表达的临床病理学意义.方法 采用免疫组织化学方法检测109例胃癌、28例高度不典型增生、20例低度不典型增生、30例慢性萎缩性胃炎、29例肠上皮化生和21例正常对照的胃黏膜组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4和Smad7蛋白的表达变化.结果 在胃癌和不典型增生组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ和Smad7蛋白表达均明显高于慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和正常胃黏膜组织(P均<0.001).而Smad4蛋白在高度和低度不典型增生组织中虽呈高表达状态(细胞质染色分数分别为4.89±2.38、5.80±1.54;细胞核染色分数分别为3.89±1.52、3.80±1.33),但在胃癌组织中其表达水平(细胞质染色分数为2.41±2.27、核染色分数为2.02±2.14)又明显降低(P均<0.001).在胃癌组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ和Smad7蛋白的表达在进展期胃癌(分别为4.36±2.66、3.05±1.93、4.84±3.06)高于早期胃癌(分别为2.93±1.85、2.17±1.87、4.14±2.46),差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.05),而Smad4蛋白的表达则在早期胃癌中表达更高(P<0.001).同时,Smad4蛋白表达与肿瘤的大小(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.001)、组织学分期(T分期)(P<0.001)和临床分期(P<0.001)均有关系,而TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达则与患者的5年生存率有密切关系(P<0.05,P<0.01).在蛋白表达相关性上,TGF-β1蛋白表达与TGF-βRⅡ和Smad7蛋白表达之间存在正相关性(r1=0.45,P<0.05;r2=0.49,P<0.05),而与Smad4蛋白的表达呈负相关(r=-0.21,P<0.05).结论 TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4和Smad7蛋白共同参与胃癌的形成,且Smad4蛋白是TGF-β信号传导通路中的最关键因素.四种蛋白的检测对反映胃癌的侵袭、转移和预后是一个非常有意义的指标.     

Staurosporine诱导维A酸耐药早幼粒细胞白血病细胞株分化的研究

目的:研究蛋白激酶C抑制剂staurosporine对全反式维A酸(ATRA)耐药的急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株的诱导分化作用及其可能的机制。方法:以ATRA耐药的APL细胞株NB4-R1为模型,通过检测细胞表面分化抗原CD11b,并进行四唑氮蓝(NBT)还原实验和形态学观察,分析Staurosporine对NB4-R1细胞分化的影响;应用蛋白印迹法检测staurosporine对C/EBPβ、C/EBPε和PML-RARα蛋白表达水平的影响。结果:与对照组相比,staurosporine处理72 h后,细胞CD11b阳性率从(5.84±1.89)%上升到(65.90±2.00)%,差异有统计学意义(P     

α干扰素联合全反式维甲酸对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4、NB4-R1增殖和分化的影响北大核心CSCD

急性早幼粒细胞白血病（APL）是临床常见的一种急性白血病,全反式维甲酸（ATRA）是诱导APL缓解的主要药物,90％的APL患者通过ATRA治疗可获得完全缓解,但APL复发和ATRA耐药仍是困扰临床医师的主要难题,也是目前APL治疗方面研究的热点之一.有研究发现APL患者ATRA耐药与缺乏干扰素合成的一些蛋白质有关,我们通过探讨IFN-α联合ATRA对APL细胞系NB4及ATRA耐药APL细胞系NB4-R1增殖和分化的影响,为治疗ATRA耐药的APL提供理论依据.     

全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中分化抑制因子1表达水平的变化

目的 探讨分化抑制因子1(ID1)在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的作用.方法 运用基因芯片、放线菌酮抑制试验、实时定量RT-PCR和Western blot.方法 检测ID1存ATRA诱导的APL细胞系及原代APL细胞分化过程中表达情况.结果 在ATRA污导的NB4细胞和APL初诊患者原代细胞分化过程巾ID1基因的表达上调,ATRA诱导NB4细胞2hID1表达达高峰,其相对表达水平与对照相比升高359.4±48.7倍;ATRA处理APL患者骨髓细胞ID1表达水平2 h达高峰,其中1例患者晕复3次检测的.结果 为对照的(311.1±48.7)倍.而且ID1基因的上调不需要其他蛋白的合成.而在ATRA处理ATRA耐药细胞系NB4-R2细胞未见ID1的表达发生明显变化.结论 ID1基因可能作为ATRA的靶基因参与了ATRA诱导的粒系分化.     

丹参酮ⅡA对初治、复发及耐药人急性早幼粒细胞白血病细胞体外诱导分化作用

丹参酮ⅡA（TanⅡA）是从活血化瘀中药丹参中提取的有效成分。体外研究表明，TanⅡA对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用及诱导分化作用。近来有学者发现，0．5μg／ml TanⅡA在体外能诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞及维甲酸耐药APL细胞株MR-2细胞分化成熟。在此基础上，我们选择11例临床初治、复发及全反式维甲酸（ATRA）耐药的APL患者白血病细胞进行原代培养，进一步证实TanⅡA对APL细胞体外诱导分化作用，为其临床运用提供更加可靠的实验室依据。     

全反式维甲酸诱导Rig-g基因表达的调控机制研究

为了揭示全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中rig-g基因表达的分子机制,进一步阐明ATRA在APL细胞分化中的信号转导网络,采用荧光素酶报告基因试验、蛋白质免疫共沉淀试验以及染色质免疫共沉淀试验等对直接启动rig-g基因表达的转录因子及其作用机制进行研究。结果显示:在NB4细胞中,STAT2、IRF-9和IRF-1均能够被ATRA诱导表达,但表达时相有所不同。STAT2和IRF-9可以发生相互作用,形成复合物,并与rig-g基因启动子上的序列结合,激活rig-g基因的表达。IRF-1单独也能激活含rig-g基因启动子的报告基因,但是C/EBPα能强烈抑制IRF-1的这种转录激活作用。结论:在维甲酸诱导APL细胞分化过程中,ATRA首先诱导IRF-1的表达;随着C/EBPα的逐渐下调,IRF1-继而又进一步使细胞内的IRF-9和STAT2的蛋白水平上升。IRF-9和STAT2相互作用形成的复合物是直接诱导rig-g基因表达最基本的转录因子。本研究对于深入理解ATRA诱导APL细胞分化的信号转导网络具有一定的意义。     

丹参酮ⅡA抑制心肌细胞的纤维化

背景：转化生长因子β-Smads信号通路是心肌纤维化的关键通路;丹参酮ⅡA具有抑制心肌纤维化作用.目的：验证丹参酮ⅡA对转化生长因子β1致心肌纤维化的作用并探讨其机制.方法：取出生24 h内的SD大鼠心脏,利用酶消化法结合差速贴壁体外培养心肌成纤维细胞.取上述第3代心肌成纤维细胞,用5μg/L转化生长因子β1培养15,30,60,120 min或6,12,24 h后收集细胞,用不同浓度（10-5 mol/L、10-4结果与结论：转化生长因子β1在一定范围内以时间依赖方式诱导结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原、磷酸化Smad3及Smad7的表达,刺激终末结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原mRNA的表达量明显上升（均P 〈0.01）;磷酸化Smad3及Smad7蛋白表达量在刺激后1 h达到峰值,表达量显著增加（均P 〈0.01）.高浓度丹参酮ⅡA预处理可显著下调磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原表达（均P 〈0.01）.两种浓度的丹参酮ⅡA预处理均可上调Smad7蛋白表达（P 〈0.05,P 〈0.01）.提示丹参酮ⅡA对心肌纤维化有抑制作用,可能与其上调Smad7蛋白表达,抑制转化生长因子β1诱导的Smad3磷酸化,部分阻断转化生长因子β1-Smads信号通路有关. mol/L）丹参酮ⅡA预处理2 h后再加入5μg/L转化生长因子β1培养120 min或24 h后收集细胞,并设空白对照组.免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定,反转录聚合酶链反应检测结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达,Western Blot检测Smad7及磷酸化Smad3蛋白表达.免疫组织化学染色及免疫荧光法检测磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白表达.     

XIAP表达在ATRA诱导APL细胞分化中的意义

目的 探讨X染色体相关凋亡抑制蛋白在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化过程中的表达意义.方法 以急性早幼粒白血病细胞NB4为细胞模型,利用细胞计数、瑞氏染色、蛋白质免疫印记等方法.观察细胞经ATRA处理不同时间后细胞分化情况以及XIAP蛋白表达情况.结果 1μmol/L的ATRA可抑制NB4细胞的生长,在用药处理72h后细胞出现明显的分化,XIAP蛋白含量明显下降.结论 在ATRA诱导APL细胞分化过程中,凋亡抑制蛋白XIAP表达明显下调.     

NB4细胞株分化中NDRG1表达的研究

目的:应用多种分化诱导剂处理急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞系NB4细胞株,探讨NDRG1表达在白血病细胞诱导分化中的作用.方法:采用1×10-7mol/L全反式维甲酸(ATRA)、1%二甲基亚砜(DMSO)和20nmol/L佛波酯(TPA)分别处理NB4细胞48h,并通过细胞染色、流式细胞检测、蛋白印迹(Western blot)和实时PCR分别检测分化细胞的核型、CDllb、CDllc、CDl4表达,观察ndrgl mRNA与蛋白的变化.结果:3种分化诱导剂分别处理细胞株后,细胞核缩小且呈分叶状改变,细胞内NDRG1蛋白表达均呈时间依赖性上调;经ATRA和DMSO处理的细胞,其ndrgl mRNA发生上调,而经TPA处理的细胞却未发生ndrgl mRNA表达上调.结论:细胞信号调控分子NDRG1与细胞分化密切相关.     

白血病细胞系纤溶活性及全反式维甲酸对其影响

目的研究不同白血病细胞系的纤溶活性，观察在全反式维甲酸（ATRA）作用下白血病细胞纤溶活性的变化及对尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）和膜联蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）表达的影响。方法用发色底物法测定白血病细胞系NB4、SHI-1、K562、Jurkat、Raji细胞的纤溶活性。用流式细胞术检测上述细胞表面uPAR和AnnexinⅡ的表达，以RT—PCR方法检测uPARmRNA和AnnexinⅡ mRNA的表达。结果NB4细胞和SHI-1细胞与纤溶酶原作用后上清液纤溶酶活性明显升高，ATRA处理后的NB4细胞纤溶活性明显下降。uPAR单抗可使SHI-1细胞和NB4细胞的纤溶活性明显下降。SHI-1细胞与NB4细胞表面的uPAR和AnnexinⅡ及其相应的mRNA表达较高，ATRA能下调NB4细胞AnnexinⅡ和uPAR及其相应的mRNA表达。结论不同白血病细胞使纤溶酶原转化为纤溶酶的能力不同，其中SHI-1细胞和NB4细胞促纤溶活性较强。白血病细胞表面AnnexinⅡ和uPAR共同参与了促纤溶作用。ATRA主要通过下调NB4细胞的AnnexinⅡ和uPAR蛋白及其mRNA的表达，纠正早幼粒细胞白血病的高纤溶状态。     

原肌球蛋白、丙酮酸激酶在急性早幼粒细胞白血病耐药细胞中表达上调

目的应用蛋白质组学方法筛选人急性早幼粒细胞白血病（APL）维甲酸敏感细胞株（NB4细胞株）和维甲酸耐药细胞株（NB4-R1细胞株）的耐药相关蛋白。方法利用双向凝胶电泳技术检测，比较NB4和NB4-R1细胞株的总蛋白，建立二维凝胶电泳（two-dimensional gel ectmphoresis，2-DE）图谱。从多个差异蛋白质点中选择出2个在NB4-R1细胞株中表达明显上调的蛋白质点进行MALDI-TOF-MS生物质谱分析，并用Mascot软件在SwissProt和NCBInr数据库中进行同源比较和分析鉴定。结果确定表达明显上调的两个蛋白质分别为原肌球蛋白（tmpomyosin，TM）和丙酮酸激酶（Pymvate kinase，PK）。结论本研究表明维甲酸耐药细胞中原肌球蛋白和丙酮酸激酶表达上调，提示它们在肿瘤耐药中有重要作用。     

丹参酮ⅡA对NB4细胞PML-RARαmRNA和融合蛋白的影响

我们采用急性早幼粒细胞白血病(APL)NB4细胞株作为体外细胞模型，检测丹参酮ⅡA(TanⅡA)作用NB4细胞后早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α(PML-RARα）mRNA和融合蛋白的变化，探索TanⅡA诱导NB4细胞分化与凋亡的分子机制。     

PML-RARα对BHLHB2基因转录调控的影响

本研究探讨异常转录因子PML-RARα对BHLHB2基因的转录调控机制,进一步揭示急性早幼粒细胞性白血病(APL)的致病机理。利用RT-PCR技术研究PML-RARα融合蛋白及ATRA在APL模式细胞株PR9和APL病人来源的NB4细胞中对BHLHB2转录的影响;利用ChIP-PCR技术探讨PML-RARα在体内调控BHLHB2转录的作用方式;通过分析病人样本数据,观察BHLHB2在各种急性髓系白血病(AML)中的表达情况。结果表明,随着PML-RARα融合蛋白的表达升高,BHLHB2的转录受到明显抑制,并且无论在APL模式细胞株PR9还是APL病人来源的NB4细胞中,ATRA均能够解除这种抑制,诱导BHLHB2的表达上调;而在不表达PML-RARα的U937细胞株中,ATRA不能诱导BHLHB2的表达上调。研究结果提示,PML-RARα通过结合于BHLHB2的启动子区域抑制其转录。与其他类型的AML和正常的骨髓细胞相比,BHLHB2在APL中表达较低。结论:BHLHB2是PML-RARα的靶基因,PML-RARα通过与其启动子区域结合对其转录进行负调控。     

乌苯美司增强全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化的体外研究

目的探讨氨肽酶N抑制剂乌苯美司（ubenimex）对全反式维甲酸（ATRA）诱导人急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞分化的影响及可能机制。方法采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b，四氮唑蓝（NBT）还原实验检测细胞分化；Western blot法检测细胞c—Myc、ERK1／2及P—ERK1/2 、p38MAPK及p—p38MAPK蛋白表达。结果ubenimex单独应用对NB4细胞的NBT还原能力及CD11b表达无明显影响，但ubenimex能增强ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力及CD11b的表达。100μg／mlubenimex能增强10nmol／LATRA诱导原代APL细胞的NBT还原能力。100μg／mlubenimex增强10nmol／LATRA下调NB4细胞c—Myc蛋白的表达；抑制10nmol／LATRA引起的NB4细胞的p38MAPK磷酸化。结论ubenimex能够增强ATRA对APL细胞的诱导分化作用，可能与抑制p38MAPK的磷酸化及对原癌基因c—Myc表达的调控有关。