大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的：建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法，探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性。方法：采用10％BSA＋7．5％DMSO作冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力，形态及分化能力作鉴定。结果：不同的冻存时间，细胞代数，组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异（P＞0．05）。冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活，能在体外多次传代，并能分化成神经元，星形胶质细胞细胞和少突胶质细胞。结论：大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的，增殖能力和多向分化能力。     

胚胎干细胞在神经移植治疗中的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是一种高度未分化的全能性细胞,具有极强的增殖能力和发育分化为三个胚层组织细胞的潜能[1]。ESCs可以从哺乳动物着床前胚胎的内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离,并能在体外培养。利用ESCs分化潜能可以为组织工程和细胞移植治疗提供良     

小鼠胚胎干细胞诱导的神经前体细胞纹状体移植对PD大鼠的治疗作用

目的 观察来源于小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞移植PD大鼠纹状体后的存活、分化以及细胞移植对PD大鼠的治疗作用。方法 采用无血清方法将小鼠胚胎干细胞定向诱导为神经前体细胞，免疫组化技术观察移植细胞的存活、分化。结果 胚胎体在N2选择性培养基选择生长5d后，85％以上的小鼠胚胎干细胞分化为nestin阳性的神经前体细胞。移植到PD大鼠纹状体后大部分神经前体细胞存活良好，移植细胞分别保持为未分化的nestin阳性的神经前体细胞和TH阳性的神经元。移植后3周，PD大鼠的旋转次数明显减少。结论 胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植PD大鼠纹状体后能分化为TH阳性的神经细胞，对PD有治疗作用。     

大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究

目的：探索大鼠神经干细胞在胚胎脑内的分布特点,并用三种不同的方法对干细胞进行克隆化培养。方法：对胚龄16天左右的大鼠胚胎脑组织做连续冠状位冰冻切片,特异的抗nestin免疫组化染色,以显示干细胞在胚胎的分布特点。我们还把胚龄16天左右的胎鼠室管膜下脑进行原代及传代培养,传代的神经干细胞用三种方法有限稀释法,饲细胞克隆培养法,软琼脂克隆培养法进行克隆培养。结果：1．神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位如：脑室、脑室下区,中脑导水管周围。神经干细胞多表现为复层上皮样排列,细胞突起呈放射状伸向脑的表层并之与保持密切联系。有的干细胞在离室管膜较远处呈簇状分布好似群状迁移的干细胞群也好似干细胞的发生中心。2．干细胞的原代及传代培养显示：神经细胞易呈聚集状生长的特点及神经细胞的迁移性的生长特点,各细胞群之间有密切的纤维联系。3．神经细胞生长的细胞密度依赖效应与细胞之间的接触在生长发育中的重要作用。结论：神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位,软琼脂克隆法是一种成功的干细胞克隆方法。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。     

大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究

目的 研究大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的可行性。方法 从孕龄16天的大鼠胚胎脑组织中分离、培养神经干细胞并诱导其分化，通过免疫组化学技术研究其特性。制作大鼠脑出血模型，3天后将未分化的神经干细胞注入血肿同侧或对侧的尾状核内，记录损伤和移植后的大鼠运动功能。不同时间杀死大鼠，研究移植后的干细胞在体内分化和迁徙的情况。结果 实验中分离、培养的神经干细胞体外能够被诱导分化成神经元、光突胶质细胞和星形胶质细胞，血肿同侧移植干细胞的大鼠运动功能的改善显著好于血肿对侧移植干细胞组及未移植干细胞的对照组。免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可分化成神经元和胶质细胞，并向损伤区域迁徙。结论 大鼠胚胎神经干细胞体内、体外均具有多向分化潜能，其分化成各种类型神经细胞的比例与所处的外界环境有关，在脑内靠近损伤部位移植胚胎神经干细胞后能够有效改善脑出血动物的运动功能。     

神经干细胞移植促进脑出血大鼠功能恢复

目的:观察胎鼠神经干细胞体外的生长、分化及移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况。研究神经干细胞对脑出血后神经功能损害的可能修复作用。方法:通过尾状核内注射自体动脉血制作大鼠脑出血模型。分离、培养大鼠胎鼠神经干细胞并移植于成年大鼠尾状核,对大鼠脑出血后的神经恢复情况进行功能评价。结果:神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化,神经干细胞移植组大鼠运动功能较对照组明显改善。结论:神经干细胞移植能促进改善大鼠脑出血的神经功能恢复。     

胚胎干细胞分化的神经前体细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的探讨胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）来源的神经前体细胞（Neural precursorcell）移植治疗帕金森病的可能性。方法将胚胎干细胞诱导分化到神经前体细胞阶段后移植到大鼠帕金森病模型纹状体中,并设生理盐水组做对照研究,观察两组移植后行为学改变及检查纹状体内DA、DOPAC的含量。结果移植组在2～4周后与对照组相比行为学上有明显改善（P〈0．01）,纹状体内DA、DOPAC的含量显著提高（P〈0．01）。结论胚胎干细胞经诱导分化成神经前体细胞可用于帕金森病的修复治疗,胚胎干细胞是良好的干细胞移植治疗用细胞来源。     

大鼠胚胎神经干细胞两种不同分离、传代方法的比较

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),比较不同分离、传代方法对其生长的影响。方法取怀孕15d的大鼠,分别用机械分离法和含0.01%EDTA的胰蛋白酶消化法分离海马区细胞,均以1×106/mL的活细胞密度接种到无血清的NSCs培养基中培养,分离纯化至P5代。以含10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸的DMEM/F12诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果机械分离组获得的活细胞及培养后的神经干细胞球数目明显多于胰蛋白酶消化组,其细胞贴壁率却高于胰蛋白酶消化组。取神经干细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈Nestin、β-tubulin-Ⅲ、GFAP和O4阳性反应。结论大鼠胚胎海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。机械分离法和胰蛋白酶消化法各有利弊,可以根据实验情况交叉采用两种不同的分离方法,以稳定高效地培养出NSCs。     

甲基强的松龙和神经干细胞移植联合治疗大鼠脊髓损伤

目的：观察甲基强的松龙和神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的治疗作用并探讨其作用机制。方法：制备大鼠胸10脊髓损伤模型，体外培养、诱导分化大鼠神经干细胞，定量评价甲基强的松龙和神经干细胞移植对脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的影响。结果：与对照组相比，移植组明显地增强了生长相关蛋白（GAP－43）mRNA的表达，促进了乙酰胆碱转移酶（ChAT)阳性脊髓运动神经元的再生、神经结构的修复和下肢运动功能的恢复（P＜0．05）。结论：甲基强的松龙和神经干细胞移植通过增强GAP－43 mRNA的表达、运动神经元的再生而促进了脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复，是急性脊髓损伤的一种有效的治疗方案。     

胚胎大鼠神经干细胞双向凝胶电泳方法的建立**◆

背景：神经干细胞是当今研究热点,双向电泳是蛋白质组学研究的技术基础,有必要建立稳定的神经干细胞蛋白质组双向凝胶电泳技术体系。目的：通过对神经干细胞双向凝胶电泳几个关键步骤的分析,建立稳定、重复性好的神经干细胞双向凝胶电泳的分离方法。方法：采用无血清体外细胞培养方法,培养胚胎大鼠神经干细胞并进行鉴定。提取样品蛋白并裂解,被动水化,采用不同IEF参数,使用PDQuest8.0软件对图谱进行分析和比较。观察不同等点聚焦参数下双向电泳图谱质量,蛋白质点的数目及重复性。结果与结论：不同IEF参数条件下的双向电泳图谱的质量有所不同,增加低电压的除盐步骤有助于去除电泳胶图上的横纹。在80 000 Vh聚焦总能量下,获得较理想的电泳图。通过选用适当的IEF参数,建立了适当的神经干细胞双向凝胶电泳方法。     

神经干细胞移植对脑出血模型大鼠神经功能的影响☆

背景：外源性神经干细胞具有神经修复作用，可能对脑出血后的神经功能恢复起到一定的作用。 目的：观察胎鼠神经干细胞的体外生长、分化及移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况，探讨神经干细胞对脑出血模型大鼠受损神经功能的修复作用。 设计：完全随机分组设计，对照动物实验。 单位：复旦大学附属华山医院神经外科 材料：选用健康雄性成年SD大鼠18只为受体，体质量280~320 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。实验用鼠抗BrdU为Neomarkers产品, 鼠抗胶质纤维酸性蛋白和兔抗微管相关蛋白2 为Chemicon产品。 方法：实验于2006-02/12在复旦大学附属上海医学院解剖组胚实验室完成。从胎龄14 d的胎鼠海马中分离、培养、鉴定神经干细胞。16只受体SD大鼠被随机分为3组：对照组，PBS组和移植神经干细胞组。均通过尾状核内注射自体动脉血制作大鼠脑出血模型。移植NSC组在造模后30 min在血肿腔周围四点分别移植浓度为2×1011 L-1神经干细胞悬液5μL；PBS组于相同时间点在脑内相同部位注射PBS；PBS和神经干细胞的移植方法同自体血的移植方法。对照组大鼠在造模后30 min只造成四点损伤，不注射任何物质。 主要观察指标：在造模后立即，1，3，5，14，21，28 d采用前肢评分和转身评分对大鼠神经功能进行评估。大鼠于造模后28 d麻醉后取脑，并通过双标胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2、BrdU免疫组化来检测移植入脑的神经干细胞在体内的分化情况。 结果：①神经功能评分：造模后5 d，各组差异无显著性意义（P > 0.05）。造模后14~28 d，干细胞移植组较其他3组明显改善（P < 0.05）。②脑组织切片双免疫组织学双标染色结果：干细胞移植组血肿周围凋亡细胞少于PBS组。受体大鼠脑组织切片显示有BrdU, 微管相关蛋白2,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，说明神经干细胞可以在宿主脑内存活、迁徙和分化，可以分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞。 结论：神经干细胞移植可能通过分化为神经元样细胞和神经胶质细胞促进大鼠脑出血的神经功能恢复。     

胚胎大鼠神经干细胞电生理特性检测

目的 探讨胚胎大鼠神经干细胞体外培养分化的子代细胞电生理特性。方法 传代细胞单层贴壁培养,细胞内电流钳记录静息膜电位、动作电位、膜阻抗等电生理指标。结果 神经干细胞在现有培养条件下可初步分化为神经元和胶质细胞,并表现出不同的电生理特性。结论 神经干细胞表现出多向分化潜能,但现有培养条件尚不能使子代细胞电生理功能完全成熟。     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的:建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法,探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性.方法:采用10%BSA+7.5%DMSO作冷冻保护剂,于液氮中冻存;采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力、形态及分化能力作鉴定.结果:不同的冻存时间、细胞代数、组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异(P＞0.05).冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活,能在体外多次传代,并能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.结论:大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的形态、增殖能力和多向分化能力.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

雪旺氏细胞促进共培养大鼠胚胎神经干细胞的分化

目的 探讨诱导神经干细胞分化的因素。方法 新生大鼠雪旺氏细胞与大鼠胚胎神经干细胞在无血清培养液中共培养，观察神经干细胞的形态变化及分别检测特异性标志蛋白tubulin-β、GalC和GAFP的表达。结果 相差显微镜下大部分神经干细胞伸出多个细长突起，且免疫莹光染色tubulin-β高度表达；少数细胞为有多个短小突起的小细胞，且GalC或GFAP阳性表达。结论 雪旺氏细胞与大鼠胚胎神经干细胞共培养可诱导神经干细胞分化。     

大鼠胚胎神经干细胞的体外培养及冻存

目的体外培养、冻存大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点及复苏后的活性。方法取孕15d的大鼠海马区细胞,体外培养。以20%牛血清白蛋白(BSA)加10%二甲基亚砜(DMSO)作冷冻保护剂,于液氮中冻存。复苏后计数活细胞数,免疫细胞化学鉴定其分化状态。结果第1~4代NSCs复苏后神经干细胞存活率在40%~63%之间,差异无统计学意义。冻存复苏后的NSCs能够存活、传代,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外增殖、分化,并且冻存复苏不影响其生物学特点和细胞活性。     

神经干细胞移植治疗Alzheimer病

阿尔茨海默病是一种中枢神经系统进行性变性疾病,为痴呆的常见原因,其较明确的病理变化是前脑胆碱能投射系统胆碱能神经元变性、细胞数量减少。神经干细胞具有自我更新和多分化潜能属性,可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞移植后可分化成胆碱能神经元,有潜力替代AD病程中丢失的细胞,从而达到治疗疾病的目的。     

SD大鼠胚胎神经干细胞分离、培养及鉴定

目的 体外培养并鉴定神经干细胞，为相关实验研究奠定基础。方法 分离SD大鼠胎鼠的间脑，加入神经生长因子EGF和bFGF在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果 分离培养的细胞具有不断增殖的能力，表达神经巢蛋白（nestin），并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法，可用于进一步的实验研究。     

GFP转基因小鼠神经干细胞移植治疗大鼠帕金森病的实验研究

目的观察GFP(绿色荧光蛋白)转基因小鼠胚胎神经干细胞植入帕金森病大鼠纹状体后的存活、分化情况及治疗作用。方法建立PD模型大鼠及体外培养神经干细胞,然后将GFP转基因小鼠神经干细胞定向植入帕金森病大鼠毁损侧纹状体内,于移植后不同时间诱发旋转行为,并与对照组相比,观察症状的改善,并用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色方法检测移植GFP转基因小鼠神经干细胞的存活及分化状况。结果 GFP转基因小鼠神经干细胞脑内移植后,帕金森病大鼠的旋转行为明显改善。移植后2至4周时可检测到成片或散在的TH免疫阳性细胞。结论 GFP转基因小鼠神经干细胞移植至帕金森病大鼠纹状体后,可分化为多巴胺能神经元并能改善旋转症状。