损伤与正常脊髓蛋白质组的差异分析

目的从整体水平探究损伤与正常脊髓在蛋白质组表达上的差异，并寻找两者间的差示蛋白。方法以横断损伤和正常大鼠脊髓为研究对象，应用三氯乙酸／丙酮法制备蛋白样品，经双向电泳和银染，分别获取大鼠损伤和正常脊髓的蛋白质组双向电泳银染图谱，通过图像扫描及图像分析，建立损伤与正常脊髓蛋白质组的匹配差示图谱，分析两者在蛋白质组表达上的变化。结果损伤脊髓蛋白质组图谱经图像分析后，可检测到746个蛋白点，正常脊髓蛋白质组图谱可检测到847个蛋白点；蛋白质组匹配差示图谱的分析发现，两者间存在411个差示蛋白，即：损伤脊髓蛋白质组中有155个蛋白点在正常脊髓蛋白质组中未找到相应的匹配蛋白点；同时，正常脊髓蛋白质组中也有256个蛋白点在损伤脊髓蛋白质组中未找到相应的匹配蛋白点。结论损伤与正常脊髓的蛋白质组存在明显差异。     

正常大鼠脊髓蛋白质组学实验研究

目的调整和优化实验条件,建立正常大鼠脊髓蛋白组学双向电泳体系。方法取正常大鼠腰部脊髓,运用BIO-RAD PROTEAN IEF Cell加垂直SDS-PAGE BIO-RAD PROTEANRⅡXi Cell,进行等电聚焦(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果采用不同的聚焦条件,获得了较清晰的大鼠脊髓蛋白质2-DE谱。根据标准蛋白的回归方程,在正常脊髓的2-DE图中,清晰获得大约800多个蛋白点的等电点和分子量信息。结论在大鼠脊髓蛋白组学双向电泳过程中,样品的制备和实验条件得到进一步优化。初步获得正常大鼠脊髓蛋白组学信息。     

乳小鼠培养肝细胞蛋白质双向电泳技术的建立

目的 :建立培养乳小鼠肝细胞蛋白质的双向电泳技术。方法 :取乳小鼠肝脏组织 ,进行肝细胞原代培养 ,提取肝细胞蛋白 ,以固相pH梯度 (IPG)等点聚焦为第一向 ,垂直SDS -PAGE为第二向进行双向电泳 ,并对样品处理方式、蛋白上样量、IPG等电聚焦和SDS -PAGE电泳参数设置、凝胶浓度等关键因素和环节进行了比较研究。结果 :通过实验条件的筛选和优化获得了较满意的双向电泳图谱。结论 :本文建立乳小鼠双向电泳分离技术 ,具有较高的分辨率和重复性 ,为研究肝脏不同条件下特异性蛋白的表达及分子标记奠定了基础     

大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系的建立

目的:建立大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系。方法:提取大鼠肾脏组织的样品蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化。结果:最终选择的裂解液配方是1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/LTris,8mol/L尿素,2mol/L硫脲;使用pH 4～7的IPG胶条进行被动水化上样,等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整;改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。从而获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。结论:成功建立具有较高分辨率和重复性的大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系,为后续实验研究提供有力的技术保障。     

人角质形成细胞蛋白质双向电泳技术的建立和优化

目的 建立和优化人角质形成细胞蛋白质组研究样品制备方法和双向电泳技术条件.方法 体外无血清培养人角质形成细胞,以裂解液成分、上样量的选择和等电聚焦参数为侧重点,通过比较分析不同条件下电泳图谱,建立最佳双向电泳技术条件.结果 成功建立了人角质形成细胞总蛋白制备方法,优化了人角质形成细胞双相电泳技术,获得了重复性和分辫率都较理想的角质细胞总蛋白质双向电泳图谱.结论 优化后的双相电泳条件为人角质形成细胞蛋白质组学分析奠定基础.     

督脉电针对急性脊髓损伤6 h后大鼠差异蛋白质组学的机理研究

目的确定急性脊髓损伤(SCI)后差异表达蛋白,初步探讨其功能,从差异蛋白组学角度研究SCI的病理机制,以及电针对该病的治疗作用。方法大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、药物组、电针组,每组15只大鼠,共75只。采用自制的改良式Allen’s打击装置造模。术后6h取脊髓损伤区2cm的脊髓组织称重,保存。对样本蛋白进行提取、定量、蛋白双向电泳图像分析,找出差异点进行质谱分析和数据库检索。结果成功鉴定出6种蛋白质:假定蛋白LEF3-IAP2、泛素羧基末端水解酶、先驱B环蛋白3、假定蛋白ORF F-93、角蛋白16、泡溶酶蛋白。结论通过本动物实验可见,针刺对早期脊髓损伤具治疗效果。鉴定出的蛋白质可能通过引起炎症细胞浸润、神经细胞凋亡等途径参与了SCI的损伤及修复过程。     

人胃黏膜蛋白质组双向电泳图谱的获得和分析

目的:建立和优化人胃黏膜组织蛋白质双向凝胶电泳技术,获得高分辨率和重复性的人胃黏膜双向电泳图谱.方法:采用双向电泳技术分离人正常胃黏膜组织总蛋白,并对其关键环节和因素,如样品处理、上样量、电泳参数、染色方法等进行一系列的优化,凝胶染色后扫描图谱,Imagemaster 6.0软件比较分析.结果:获取的人胃黏膜双向电泳图谱蛋白质斑点清晰、重复性好,主要分布在等电点pI 4~7、相对分子质量20 000~90 000范围内.结论:成功建立了人胃黏膜组织蛋白双向电泳技术,获得了分辨率和重复性较好的人胃黏膜双向电泳图谱.     

志贺菌全菌蛋白质双向电泳技术的建立

目的:建立针对志贺菌全菌蛋白质组学研究的双向电泳及其相关技术体系.方法:采用超声兼尿素-3-[(3-胆酰胺丙基)-乙二胺]-1-丙磺酸(CHAPS)-二硫苏糖醇(DTT)裂解法提取临床分离志贺菌全菌蛋白,利用固相pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳,银染后获得的双向电泳图谱进行Image Master 2D Platinum软件分析,并对实验条件进行调整优化. 结果:成功构建了高重复性的志贺菌全菌蛋白质双向电泳图谱,共获得946±37个蛋白质斑点, pI值主要集中在4.94～7.23之间.结论:通过相关条件的调整优化提高了双向电泳的分辨率,为后续志贺菌蛋白质组学研究奠定了基础.     

中药作用后神经细胞蛋白质双向电泳技术的建立

目的：建立中药作用后神经细胞蛋白质组的双向电泳技术,提高其分辨率及重复性。方法：中药四君子汤作用小鼠神经细胞,提取蛋白质,以固相pH梯度等电聚焦为第一向,再以垂直SDS-PAGE进行第二向分离,银染显色。结果：通过实验条件的多次优化获得了较为满意的四君子汤作用小鼠神经细胞蛋白质双向电泳图谱。结论：初步建立了中药四君子汤作用后小鼠神经细胞蛋白质组双向电泳分析方法,具有较好的分辨率和重复性,为进一步较为系统、全面、准确的评价中药及其复方制剂的作用机制和药效提供方法学基础。     

肝癌细胞株HepG2蛋白双向电泳条件的优化

目的优化双向电泳条件,以获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱。方法比较不同的细胞总蛋白质裂解液、不同的蛋白上样量、不同的等电聚焦电泳条件,选择最佳双向电泳条件。结果确定了适合肝癌细胞株HepG2的最佳细胞总蛋白质裂解液5、最佳蛋白上样量650μg和最佳等电聚焦电泳条件为最大电压34kV、30min。结论优化双向电泳方法获得的肝癌细胞株HepG2蛋白质双向电泳图谱高分辨率、重复性好。     

大鼠急性脊髓损伤后血小板衍化生长因子-B的表达

目的:探讨血小板衍化生长因子-B(PDGF-B)在脊髓损伤(SCI)后对脊髓功能恢复的作用。方法:健康雌性SD大鼠48只随机分为免疫组化组(30只)和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)组(18只)。麻醉后,用改制的Ⅱ型纽约大学装置建立大鼠脊髓急性损伤模型。用免疫组化检测急性SCI后不同时段PDGF-B在脊髓中的表达,用RT-PCR检测PDGF-B的mRNA在急性SCI后不同时段表达的变化。结果:①PDGF-B蛋白表达:急性SCI后24 h,PDGF-B在损伤区周围神经元的表达开始增加(5.92±3.23),并于7 d后维持在一定水平,14 d后PDGF-B阳性细胞数增多,28 d达高峰(85.00±13.49),主要表达于坏死区增生的神经胶质细胞。②PDGF-B mRNA表达:SCI后1 d,PDGF-B mRNA表达降低,3 d接近正常,随后略有下降,14 d后mRNA表达升高,28 d基本回到正常。结论:急性SCI后,PDGF-B对损伤脊髓的功能恢复有重要作用。     

实验性脊髓损伤后中枢性疼痛动物模型的建立

目的 建立脊髓损伤后中枢性疼痛的动物模型.方法 选用成年SD大鼠45只,分为正常组、脊髓损伤组、假手术组,每组15只.用自制Allen氏打击装置,以400 gcm(下落重物的质量与下落高度的乘积)的打击力度撞击L1节段脊髓造成大鼠脊髓损伤,分别在损伤前后T12节段记录刺激胫神经引起的体感诱发电位,假手术组大鼠仅打开椎板而不损伤脊髓.术后4、8、12、16、24 h及此后每天对大鼠的机械性痛敏压力阈值(paw withdrawl pressure threshold,PWPT)和热痛敏潜伏期(paw withdrawl latency,PWL)进行测量,同时观察大鼠自发痛的行为学变化,共观察3个月.结果 脊髓损伤组大鼠对机械刺激和热刺激均发生痛觉过敏,与正常组和假手术组比较,其PWPT和PWL均显著下降(P＜0.05),且出现自发痛现象;而假手术组PWPT、PWL与正常组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).结论 用Allen氏重物坠击法建立的脊髓损伤后中枢性疼痛动物模型具有较好重复性和临床相关性.     

猴脊髓半横断模型的制作及后肢功能评价

目的建立恒河猴半横断脊髓损伤模型,观察脊髓形态及神经功能改变。方法动物分为半横断组和假手术组,椎板切开横断左侧脊髓,采用改良Tarlov评分及皮层体感诱发电位(CSEP)评价神经功能,同时行HE染色组织学观察,计数脊髓前角神经元数。结果术后3个月时,脊髓半横断切口处形成不规则的空腔,内有少许组织充填,脊髓灰质前角神经元计数,半横断下端伤侧较对侧减少,但后肢功能在伤后14d至3月有一定程度的渐进性恢复。结论建立脊髓半横断模型,横断侧后肢神经功能有一定程度代偿恢复,提示脊髓半横断伤后有一定功能可塑性。     

中药脊髓I号对脊髓损伤大鼠背根节CGRP表达的影响

为研究在脊髓损伤后服用中药脊髓I号 (SCI)对背根节 (DRG)神经元降钙素基因相关肽 (CGRP)表达的影响 ,探讨SCI促进脊髓修复再生效应的机制 ,用免疫细胞化学法和定量图像分析法 ,检查了SCI对Wistar大鼠下胸髓半横断损伤诱发的局部DRG神经元CGRP表达的影响。结果发现 :①脊髓半横断引起同侧首、尾向各 3个DRG内CGRP表达的明显和持续性下调 ;②损伤后投给SCI冲剂 ,可以明显减轻、但不能完全阻止脊髓损伤诱发的CGRP表达下调 ;③损伤后投给中药补阳还五汤 ,或用大剂量的氢化可的松治疗 ,不能减轻脊髓损伤诱发的CGRP表达下调 ;④在服用SCI大鼠脊髓的损伤区 ,显示有明显的修复再生。提示 :CGRP表达程度与脊髓损伤及其修复再生的情况相关 ;SCI可能通过对CGRP mRNA基因表达的调节 ,激发损伤脊髓组织的修复再生。     

大剂量甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的:探讨大剂量甲基强的松龙(Methylprednisolone,MP)对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。方法:60只Wistar成年大鼠分为MP治疗组与对照组。Allen氏重物坠击法制作T8脊髓损伤模型,治疗组经尾静脉注射大剂量MP,对照组注入等量生理盐水。术后1、3、7、14、28 d取脊髓组织分别进行HE染色、TUNEL法检测凋亡细胞、SABC法检测bcl-2和bax的含量,并对大鼠神经功能评分。结果:大鼠脊髓损伤后神经细胞发生凋亡,1 d后出现,3 d达高峰,28 d下降明显。MP组凋亡率较对照组明显降低,其bcl-2/bax比例增加,大鼠双下肢运动功能改善明显。结论:大剂量MP通过增强大鼠脊髓损伤后bcl-2/bax比例,抑制神经细胞凋亡,从而减轻损伤后的继发性损害。     

脊髓损伤早期神经细胞C-fos基因表达及其意义

目的：从分子水平探讨脊髓损伤发病机制，为临床治疗脊髓损伤寻求有效手段。方法：选用Wistar大鼠30只，制造脊髓压迫性损伤模型，以免疫组织化学方法，动态观察大鼠脊髓损伤早期神经细胞C-fos基因表达变化。结果：脊髓损伤后2h，损伤区胶质细胞中C-fos基因表达已明显，伤后6，8，24h更为显著。结论：脊髓损伤后C-fos基因表达的情况可能与脊髓原发性损伤和继发性损伤机制有关。     

电针关元穴对脊髓损伤后尿潴留模型大鼠逼尿肌兴奋性的影响

目的 观察电针关元穴对急性脊髓损伤后尿潴留模型大鼠逼尿肌兴奋性的影响.方法 将健康成年雌性SD大鼠80只,随机分为正常组、假手术组、模型组、电针关元穴治疗组,每组20只.采用重物坠击法建立急性脊髓损伤后尿潴留大鼠模型,穴位电针治疗10次,每天1次,治疗结束后行离体逼尿肌最小收缩张力和收缩频率的测定.结果 与正常组和假手术组相比,模型组逼尿肌最小收缩张力增高,收缩频率减慢(P＜0.05);正常组和假手术组比较,无明显统计学差异(P＞0.05);与模型组相比,针刺组最小收缩张力明显降低,收缩频率增加(P＜0.05).结论 电针关元穴可以降低尿潴留大鼠逼尿肌的最小收缩张力并提高其收缩频率;电针治疗神经源性尿潴留的机制可能是通过提高逼尿肌兴奋性、增加膀胱收缩能力、改善逼尿肌的收缩频率,从而到达膀胱排尿功能的重建.     

小鼠脊髓损伤中的长链非编码RNA表达谱

目的:研究脊髓损伤中的差异性长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）表达谱。方法:应用MASCIS脊髓撞机仪制造小鼠脊髓损伤模型,按照损伤后取脊髓时间再分成1 d、3 d、7 d和21 d组及正常对照组,分别提取总RNA,进行芯片分子杂交,构建脊髓损伤后差异性LncRNA表达谱,挑选神经组织特异性LncRNA通过荧光定量PCR实验验证芯片结果可靠性,对差异性表达LncRNA所参与的信号通路进行分析。结果:脊髓损伤后LncRNA出现差异性表达,损伤后7 d出现了差异性表达最大值,荧光定量PCR实验验证芯片结果可靠,差异性LncRNA涉及较多信号通路。结论:LncRNA在脊髓损伤中病理过程中发生了差异性表达。     

针刺对大鼠慢性脊髓损伤后Bax和Bcl-2表达的影响

目的：探讨针刺治疗慢性脊髓损伤的作用机理。方法：60只2月龄的Wistar大鼠为受试对象，置入后路渐进性压迫装置，造成中度压迫性损伤，采用针刺进行治疗，应用免疫组化法、原位末端标记法(TUENL)观察针刺对凋亡基因Bax和Bcl—2表达的影响。结果：针刺组中Bax蛋白表达较非针刺组明显少，凋亡指数(AI)低，而Bcl—2表达则较非针刺组多，且着色深，有显著性差异。结论：针刺治疗慢性脊髓损伤可能是通过调控Bax和Bcl—2的表达而起作用。     

慢性渐进性压迫对大鼠行为功能及脊髓bcl-2和bax基因表达的影响

目的:观察脊髓慢性受压后实验动物的行为功能与bcl_2和bax基因表达的变化。方法:以30只Wistar大鼠为受试对象,采用大鼠后路渐进性脊髓压迫模型,然后进行联合行为评分(CBS)、常规病理和免疫组化,用原位末端标记法(TU ENL)检测凋亡基因bcl_2和bax的表达。结果:免疫组化示实验组bax阳性细胞数明显增多,且CBS升高(P<0.05)。TUENL结果示对照组有极少量散在的凋亡标记阳性细胞,而实验组则出现大量的阳性细胞,凋亡指数高。结论:脊髓受压促进大鼠脊髓神经元合成bax蛋白,从而影响实验动物的行为功能。