LRIG3基因过表达对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原和Ki-67表达的影响

目的 探讨过表达LRIG3基因对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67表达的影响及其机制。方法 用携带LRIG3过表达特异性序列和只含空白载体的质粒用慢病毒法感染胶质瘤细胞株U251与U87,筛选稳定株,分别分成实验组和对照组,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测各组细胞LRIG3表达的变化,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测病毒感染后对胶质瘤细胞株U251与U87增殖的影响,用免疫组织化学链霉亲和素生物素复合物(SABC)法分别检测各组细胞中PCNA和Ki-67的表达差异。结果 LRIG3过表达组细胞中LRIG3 mRNA水平与对照组比较分别升高67.6％( U251)和79.9％ (U87),LRIG3蛋白表达水平分别升高62.3％(U87)和91.0％( U251)。MTT法结果显示两实验组细胞增殖率均低于相应对照组。U251细胞对照组PCNA阳性率为(47.81 ±4.67)％,实验组为(27.49±3.17)％,U87细胞对照组PCNA阳性率为(55.50±4.01)％,实验组为(33.60±4.82)％,差异均有统计学意义(P＜0.05)。U251细胞对照组中Ki-67的阳性率为(48.50±6.11)％,实验组为(24.30±3.76)％,U87细胞对照组Ki-67阳性率为(55.20±4.19)％,实验组为(23.50±4.60)％,差异均有统计学意义(P＜0.0l)。结论 LRIG3基因过表达可减少胶质瘤细胞的增殖。     

阻断信号传导和转录活化因子3对胶质瘤细胞侵袭性特征的影响

目的 观察用AG490阻断人胶质瘤细胞株中信号传导和转录活化因子3(STAT3)信号通路对肿瘤细胞侵袭性特征的影响.方法 体外培养的人胶质瘤U251、U87细胞株,应用AG490阻断STAT3信号通路;以Western blot检测STAT3和其激活状态p-STAT3蛋白在AG490作用前后的表达情况;通过Transwell细胞侵袭实验了解肿瘤细胞体外侵袭能力的变化;用明胶酶谱法检测肿瘤细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9的表达;用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)了解血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的变化.结果 AC490作用后胶质瘤细胞内p-STAT3表达下降,其程度随AG490浓度升高而增强,差异有统计学意义(P<0.01).而STAT3蛋白的表达不受AG490影响,与对照组比较差异无统计意义(P>0.05),说明AG490的作用机制是通过抑制STAT3蛋白的磷酸化激活过程从而阻断STAT3信号通路.AG490作用后,U251细胞的体外侵袭力下降,差异有统计学意义(P<0.01).STAT3信号通路阻断后,胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9的表达下调,差异有统计学意义(P<0.01).VEGF mRNA表达也相应下降(P<0.05).结论 应用AG490阻断STAT3信号通路能够抑制胶质瘤细胞的体外侵袭能力,STAT3信号通路有可能成为控制胶质瘤侵袭性生长的有效靶点.     

RNA编辑酶ADAR2在人胶质瘤细胞株中的表达

目的 观察人胶质瘤细胞株SHG44、BT325、U251和正常人脑星形细胞(NHA)中ADAR2mRNA表达水平及苯乙酸(PA)对U251细胞中ADAR2表达的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应( Real-time fluorescent quantitative PCR)方法检测胶质瘤细胞中ADAR2mRNA表达水平,检测PA处理前后U251细胞中ADAR2mRNA表达水平的变化;噻唑蓝(MTT)比色法检测PA作用24、48和72 h后U251细胞增殖.Western印迹法检测PA作用前后U251细胞中ADAR2蛋白表达.结果 Real-time PCR检测显示:ADAR2 mRNA在NHA中表达极弱(19.9±2.2),在SHG44和BT325细胞中明显表达(35.6±2.8、78.8±3.2),在U251细胞中表达水平最高(101.3±3.5).PA3.0和5.0 mmol/L作用U251细胞24h后,ADAR2mRNA分别为60.3±1.5和50.5±l.2(P＜0.01);MTT法检测显示PA对U251细胞的增殖呈时间和剂量依赖性抑制(P＜0.01);Western印迹法显示PA可降低ADAR2蛋白表达水平.结论 在不同的胶质瘤细胞中,ADAR2mRNA表达水平不同;PA可抑制U251细胞中ADAR2mRNA和蛋白水平的表达.     

膀胱移行细胞癌组织中VEGF和PCNA表达的关系及其临床意义

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)在同一膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中的表达及其与BTCC临床、病理的关系,探讨二者与肿瘤血管形成和肿瘤细胞增殖的关系。方法:采用免疫组织化学LDP法对77例BTCC组织中VEGF和PCNA的表达情况进行检测。结果:BTCC组织中VEGF与PCNA阳性表达率分别为66.23%和51.94%,VEGF表达和PCNA表达均与BTCC的组织学分级显著相关(P<0.05);浸润性肿瘤明显高于表浅性肿瘤(P<0.05);术后复发组明显高于未复发组(P<0.01);在VEGF阳性表达的病例中,PCNA表达随VEGF表达强度的升高而升高(P<0.05),且肿瘤复发率也升高,二者呈明显正相关性(P<0.05)。VEGF和PCNA阳性或同时表达阳性的患者复发迅速,PCNA阴性而VEGF阳性表达者较阴性表达者预后差。结论:VEGF和PCNA与BTCC组织学分级、恶性程度和预后密切相关。BTCC是典型的血管依赖性和增殖性肿瘤。VEGF和PCNA均可能通过不同的途径参与了肿瘤血管形成和肿瘤细胞增殖的调控。     

血管内皮生长因子基因沉默抑制人胶质瘤裸鼠移植瘤生长及血管生成的研究

目的 观察靶向血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹RNA(shRNA)对裸鼠人脑胶质瘤中VEGF基因表达的抑制作用.方法 体外培养人脑胶质瘤U251细胞株,建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型.将成功造模的30只裸鼠随机分为A、B、C 3组(每组10只),分别给予不同处理.观察肿瘤生长.免疫组织化学检测瘤组织中VEGF蛋白表达及组织内的微血管密度(MVD)改变.结果 治疗5周后,VEGF shRNA组(A组)的肿瘤体积为654.0 mm~3、抑瘤率达65.2%,与空质粒组(B组)1790.4 mm~3、4.7%或PBS组(C组)1880.3 mm~3、0%比较,差异有统计学意义(P<0.05).A组荷瘤组织中VEGF和MVD分别为9.52、22.02,与B组17.18、43.58或C组17.82、45.32比较,差异有统计学意义(P<0.05).VEGF蛋白表达与MVD间存在正相关性(r=0.721,P<0.01).结论 应用RNAi技术沉默VEGF基因能明显抑制人脑胶质瘤细胞株U251裸小鼠移植瘤的生长.     

骨形成发生蛋白4在阿霉素诱导的U251胞抑制中的表达

目的 观察骨形成发生蛋白4(BMP4)和Smad4在阿霉素诱导U251细胞抑制中的表达变化.方法 应用噻唑蓝(MTT)检测空白组和阿霉素组U251细胞增长活性,应用公式(1-阿霉素组A/空白组A)×100%计算阿霉素组U251细胞增长抑制率.应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测空白组和阿霉素组BMP4和Smad4的表达.结果 阿霉素在24、36、48、60、72 h对细胞抑制率为分别为10%、21%、56%、49%、43%.在24 h抑制率为最高(P<0.05).荧光定量PCR显示阿霉素组与对照组比较,BMP4表达增加了(13.0±0.7)%(P<0.05),Smad4表达增加了(35.0±1.0)%(P<0.05),Western blot显示BMP4和Smad4表达分别增加了23%和38%(P<0.05).结论 阿霉素抑制U251细胞的生长可能通过提高BMP4和Smad4的表达来实现,BMP4可能成为胶质瘤治疗的新靶点.     

SLC22A18表达抑制胶质瘤细胞增殖的分子机制

有研究表明,SLC22A18表达显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖和恶性生物学特征[1-2],推测SLC22A18调控U251细胞重要细胞周期调控蛋白p21和p27是其抑制U251细胞增殖的主要机制.本研究旨在探讨SLC22A18表达抑制胶质瘤U251细胞增殖的分子机制,揭示SLC22A18的基因功能.     

胶质瘤细胞放射敏感性与ATM蛋白表达的关系

目的 探讨胶质瘤细胞放射敏感性与ATM蛋白表达关系.方法 采用流式细胞仪检测22例原代培养胶质瘤细胞中ATM蛋白的表达,用噻唑蓝(MTT)比色法检测胶质瘤细胞以60C0 2 Gy放射剂世照射后的存活分数(SF2),探讨ATM蛋白的表达量与胶质瘤放射敏感性的相关性;同时检测其中5例胶质母细胞瘤细胞及U251细胞系经60Co照射前后ATM蛋白表达量,以了解放射对ATM蛋白表达的影响.结果 原代培养的胶质瘤细胞形态多样;SF2平均值为0.417±0.176(0.162.0.735).在胶质瘤Ⅳ级与Ⅱ、Ⅲ级间差异有统计学意义(P<0.05);ATM蛋白表达水平随胶质瘤恶性程度的增高而增加,在高、低级别间差异有统计学意义(P<0.05);直线相关与回归分析显示:ATM蛋白表达水平与SF2呈显著正相关(r=0.857,P<0.05);5例原代培养的胶质母细胞瘤细胞及U251细胞系经照射后ATM蛋白表达水平提高.结论 ATM蛋白的表达水平与胶质瘤放射敏感性密切相关,胶质瘤中存在不同放射敏感性的细胞群,放射治疗应体现个体化原则.     

胶质瘤中Hedgehog/Gli1信号通路活性变化与血管内皮生长因子表达的关系

目的 探讨胶质瘤中Hedgehog/Gli1信号通路的活化与肿瘤微血管新生之间的关系.方法 54例手术切除的胶质瘤肿瘤标本,免疫组织化学检测胶质瘤组织中Gli与肿瘤微血管密度(MVD)表达的关系;运用Western blot法及定量聚合酶链反应(PCR)检测U87、SHG44、U251及A172胶质瘤细胞中Gli1与血管内皮生长因子(VEGF)在蛋白及mRNA水平的表达;U87、SHG44中通过环巴胺(Cyclopamine)处理胶质瘤细胞束抑制Hedgehog/Gli1信号通路,观察这一信号通路活性下降后对胶质瘤中VEGF表达的影响.结果 随着Hedgehog/Gli1信号通路中Gli1表达数量的增加,MVD也相应地升高;在胶质瘤细胞株U87、SHG44、U251及A172中,U87及SHG44中Hedgehog/Gli1信号通路的活化程度较高,同时VEGF基因及蛋白的表达水平较高;通过Cyclopamine抑制这一信号通路可明显下调胶质瘤细胞中VEGF的表达,其中5μmol/L Cyclopamine组VEGF的表达分别下降至(33.3±3.3)％(U87细胞),(27.1±3.0)％(SHG44细胞);10 μmol/L组VEGF的表达分别下降至(14.7±29)％( U87),(16.3±2.4)％(SHG44).结论 部分胶质瘤中存在Hedgehog/Gli1信号通路活化,而且这一信号通路活化程度与胶质瘤的血管新生密切相关.     

肿瘤相关成纤维细胞培养液上清促进肿瘤细胞增殖和血管生成的研究

目的 探讨在体外实验条件下,肿瘤相关成纤维细胞如何通过旁分泌机制促进肿瘤细胞的增殖和血管生成.方法 分别提取原代卵巢癌相关成纤维细胞(TAFs)与正常卵巢相关成纤维细胞(N Fs)的培养液上清(CM);实验组为2ml TAFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),对照组为2 ml NFs-CM处理卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105/孔),空白组为正常培养的卵巢癌细胞(SKOV-3,1×105个/孔),干预组为在实验组中加入20 μmol转化生长因子-β(TGF-β)特异性小分子抑制剂SB-431542(10 μmol/ml);应用流式细胞仪分析各组细胞生长周期;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达,Western blot法检测各组细胞TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白的表达.结果 实验组卵巢癌细胞增殖较对照组显著增加(细胞S期比例:实验组22.10±1.84比对照组12.77±1.43,P＜0.05);而加入SB431542干预后则可明显抑制促增殖作用(细胞S期比例:干预组12.33±1.12比实验组22.10±1.84,P＜0.05);RT-PCR提示实验组PCNA、α-SMA、VEGF mRNA较其他组表达显著上调(P＜0.05),Western blot结果提示实验组TGF-β1、α-SMA、VEGF蛋白表达亦显著上调(P＜0.05),在加入SB-431542后以上基因及蛋白的表达均受到抑制(P＜0.05).结论 卵巢癌相关成纤维细胞可以通过旁分泌机制促进卵巢癌细胞的增殖,并上调血管生成相关基因及蛋白的表达,而通过抑制TGF-β信号通路作用后则可以有效抑制这类作用.     

七叶皂苷钠对胆管癌细胞株Hccc9810增殖和凋亡的影响

目的 观察七叶皂苷钠对人胆管癌细胞株Hccc9810增殖和凋亡的影响.方法 运用细胞染色、噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)等技术观察不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)七叶皂苷钠对胆管癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.结果 七叶皂苷钠呈时间剂量依赖性抑制胆管癌细胞Hccc9810的增殖,其24、48、72 h的50％抑制浓度(IC50)分别为:(45.34±2.12)、(33.00±1.92)、(25.00±1.65) μmol/L;G1期比例从(49.49±1.22)％上升到(70.20±1.52)％;胆管癌细胞形态发生典型凋亡特征性改变,凋亡率随浓度的升高从20.54％上升到62.56％,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 七叶皂苷钠通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而抑制胆管癌细胞Hccc9810增殖.     

去甲斑蝥素对人原发性胆囊癌GBC-SD细胞系增殖及相关基因的干预效应

目的　研究去甲斑蝥素 (NCTD)对人原发性胆囊癌GBC SD细胞系增殖及相关基因的干预效应。方法　实验分NCTD组 (7个浓度梯度组 ,每组 6孔 )和对照组 (n =6) ,分别应用四唑盐比色法和链霉素亲合生物素复合物法测定NCTD对体外培养GBC SD细胞的体外杀伤效应和对增殖细胞核抗原 (PCNA)、Ki 67表达的影响。结果　NCTD分别在浓度 10mg/L、时间 6h时 ,即对GBC SD细胞增殖有抑制作用 ,且随浓度升高、时间延长作用增强 ,呈剂量 时间效应关系 ;实验组PCNA和Ki 67表达的棕褐染色细胞数和阳性指数 (PCNA :0 .93 2± 0 .0 3 1vs 0 .3 18± 0 .0 2 3 ;Ki 67:0 .964± 0 .0 92vs 0 .2 97± 0 .0 18;n =10 )与对照组比较均显著减少 (P <0 .0 5 )。结论　NCTD能抑制人原发性胆囊癌GBC SD细胞的生长和PCNA、Ki 67增殖相关基因蛋白的表达。     

bcl-2基因表达在人膀胱癌多药耐药现象中的意义

目的探讨ｂｃｌ２基因在人膀胱癌多药耐药中的作用。方法应用原位ＤＮＡ末端转移酶标记法（ＴＵＮＥＬ）、免疫细胞化学及逆转录多聚酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）技术,分别对阿霉素诱导的人膀胱癌耐药细胞株（ＢＩＵ８７／ＡＤＭ）及敏感细胞株（ＢＩＵ８７）的细胞凋亡及其ｂｃｌ２基因表达进行研究。结果（１）在相同条件下,与敏感细胞株相比,耐药细胞株中细胞凋亡明显受到抑制;（２）耐药细胞株中ｂｃｌ２基因表达明显强于敏感细胞株。结论凋亡抑制基因ｂｃｌ２在人膀胱癌多药耐药细胞中的高表达,是导致其细胞凋亡受抑制的重要原因,对于人膀胱癌多药耐药的产生具有重要意义。     

PCNA反义cDNA基因转导抑制人膀胱癌细胞增殖的研究

目的 探讨增殖细胞核抗原（PCNA）基因反义cDNA对人膀胱癌细胞体外增殖活性的抑制作用。方法 构建PCNA反义cDNA真核表达载体并转染膀胱癌DJ细胞,通过细胞生长曲线、MTT比色分析、H^3-TdR掺入法检测癌细胞增殖活性,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期时相变化,SABC免疫组化观察癌细胞PCNA蛋白表达水平。结果 PCNA反义cDNA导入后,膀胱癌DJ细胞生长速率显著减慢（P＜0．01）,增殖活性抑制率59．02％（P＜0．05）,DNA合成速率降低52．31％（P＜0．01）,S期细胞减少,细胞周期阻滞于G0／G1期,PCNA蛋白表达显著减弱（P＜0．05）,差别均有显著性意义。结论 PCNA反义cDNA基因转导能有效抑制膀胱癌细胞的PCNA蛋白表达及体外增殖活性,为肿瘤基因治疗提供了有效途径。     

淫羊藿苷对肝癌细胞株SMMC-7721增殖与凋亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷对肝癌细胞株SMMC-7721的抑增殖和促凋亡作用及其机制。方法:以不同浓度(0,6.25,12.5,25,50,100,200,400,800μg/mL)的淫羊藿苷作用于SMMC-7721细胞株不同时间(24,48,72 h)后,用MTT法检测药物对SMMC-7721细胞增殖状态;以不同浓度淫羊藿苷作用SMMC-7721细胞48 h后,用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况,用Western blot检测细胞PCNA,Bcl-2,Bax蛋白的表达。结果:与对照组(0μg/mL)比较,各浓度的淫羊藿苷均明显抑制SMMC-7721细胞的增殖,并呈明显的时间与浓度依赖性(均P<0.05);淫羊藿苷呈浓度依赖性诱导SMMC-7721细胞发生G0/G1期阻滞和凋亡,下调SMMC-7721细胞PCNA蛋白和Bcl-2蛋白,上调Bax蛋白的表达(均P<0.05)。结论:淫羊藿苷可抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡。     

转铁蛋白受体介导的Survivin对U251细胞生长的抑制作用

目的 构建Survivin短发夹状RNA(shBNA)序列的表达载体并观察其对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用.方法 针对Survivin基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用转铁蛋白.多聚乙烯亚胺(Tf-PEI)介导的转染方法 将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测Survivin inRNA和蛋白表达;采用MTF法测定细胞增殖.结果 编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点.转染Survivin shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05.U251细胞在48、72和96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的Survivin shRNA可特异性地抑制U251细胞生长.     

MS-275阻断STAT3信号通路诱导U251细胞凋亡

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对脑胶质瘤细胞株U251细胞增殖的影响及促凋亡机制.方法 以不同药物浓度梯度和U251细胞分别共培养24、48、72 h后,应用CCK-8法检测肿瘤细胞增殖,瑞氏-姬姆萨染色法观察细胞形态变化,PI单染法检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI法经流式检测细胞凋亡率,免疫印迹检测STAT3蛋白和PARP蛋白表达.结果 MS-275能显著抑制U251细胞的增殖,药物浓度40 nmol/ml,培养72 h,抑制率为(79.0±1.7)%;经药物作用后,细胞呈现凋亡形态,胞质和胞核浓缩或碎裂;G0/G1期细胞由(66.320±0.456)%降至(38.288±1.242)%(P＜0.01),G2/M期细胞由(19.940±0.580)%升高至(35.650±0.507)%,而后降至(22.343±1.224)%(P＜0.01),亚G0凋亡峰由(0.230±0.035)%增高至(18.393±1.449)%(P＜0.01);总凋亡率由(2.133±0.416)%增高至(29.000±2.307)%(P＜0.01);免疫印迹检测提示磷酸化STAT3表达水平降低,PARP被剪切.结论 MS-275对胶质瘤细胞的增殖抑制作用具有浓度和时间依赖性,它通过阻断STAT3磷酸化,诱导激活Caspase-3凋亡途径.

Abstract：

Objective To investigate the effect of MS-275 on the proliferation of brain glioma cells. Methods U251 cells were respectively cultured for 24, 48, 72 h, with different concentrations of MS-275. CCK-8 assay was used to assess the proliferation of U251 cells. The morphological changes of U251 cells were observed by Wright-Giemsa staining. The cell cycle was analyzed by PI dyeing. The apoptosis rate was assayed by flow cytometry using annexin V-FITC/PI. The protein expression of STAT3 and PARP was detected by Western blotting. Results MS-275 could significantly inhibited proliferation of U251 cells. After treatment with MS-275, apoptosis of U251 cells was seen; The ratio of G0/G1 was decreased from ( 66.320 ± 0.456 ) % to ( 38. 288 ± 1. 242 ) % ( P ＜ 0. 01 ), the percentage of G2/M cells was increased from ( 19. 940 ± 0. 580 ) % to ( 35.650 ± 0. 507 ) %, then decreased to ( 22. 343 ± 1. 224 ) %(P＜0.01), and ratio of sub-G0 was increased from (0.230 ±0.035)% to (18.393 ±1.449)% (P＜0. 01 ); Total apoptosis rate was increased from ( 2. 133 ± 0.416 ) % to ( 29. 000 ± 2. 307 ) % ( P ＜ 0. 01 );The expression level of phosphorylated STAT3 was significantly downregulated, and the cleavage of PARP was detected by Western blotting. Conclusion MS-275 inhibites proliferation of brain glioma cells in a time- and dose-dependent manner, which is achieved by inducing apoptosis.