DNA印迹法和实时定量PCR法在端粒长度测定中的应用比较

目的：分析并比较测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法在细胞衰老实际研究中的性能。方法：从不同代数（population doublings,PDs）的正常人成纤维细胞（2BS）中提取基因组DNA作为测试样本;对测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法进行优化,以点杂交的方式分析地高辛配基标记检测系统的特异性和灵敏度;分别用两种方法反复测定同一样本的平行样或不同样本并分析比较两种方法测量端粒的分辨率和精确度。结果：实际测量端粒时,地高辛配基标记检测系统虽可检测出小于1 μg的基因组DNA,但最优样本量为4~5 μg;DNA印迹法的分辨率约为150 bp,实时定量PCR法的分辨率约为300~400 bp,前者可分辨代龄相差少至2 PDs的2BS细胞端粒长度的差异,而后者只能分辨代龄相差5 PDs以上的端粒差异;实时定量PCR法重复测量误差超过10%,远大于DNA印迹法的2.5%（P<0.001）。结论：地高辛配基标记的DNA印迹检测系统完全适用于测量端粒长度,且性能优于实时定量PCR法,但后者方便快捷,可高通量处理样本,所以在细胞衰老研究中,应根据具体情况合理选择相应方法。     

DNA印迹法和实时定量PCR法在端粒长度测定中的应用比较

目的:分析并比较测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法在细胞衰老实际研究中的性能。方法:从不同代数(population doublings,PDs)的正常人成纤维细胞(2BS)中提取基因组DNA作为测试样本;对测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法进行优化,以点杂交的方式分析地高辛配基标记检测系统的特异性和灵敏度;分别用两种方法反复测定同一样本的平行样或不同样本并分析比较两种方法测量端粒的分辨率和精确度。结果:实际测量端粒时,地高辛配基标记检测系统虽可检测出小于1μg的基因组DNA,但最优样本量为4～5μg;DNA印迹法的分辨率约为150 bp,实时定量PCR法的分辨率约为300～400 bp,前者可分辨代龄相差少至2 PDs的2BS细胞端粒长度的差异,而后者只能分辨代龄相差5 PDs以上的端粒差异;实时定量PCR法重复测量误差超过10%,远大于DNA印迹法的2.5%(P<0.001)。结论:地高辛配基标记的DNA印迹检测系统完全适用于测量端粒长度,且性能优于实时定量PCR法,但后者方便快捷,可高通量处理样本,所以在细胞衰老研究中,应根据具体情况合理选择相应方法。     

电泳印迹和分子杂交技术在肝内HBV DNA研究中的应用

应用DNA电泳转移、生物素探针Southern杂交及不同探针重复杂交等3项新技术研究肝炎肝癌的肝内HBV DNA分子状态。经过方法学比较以电泳印迹取代毛细渗吸法对65例肝炎肝癌病人的101份肝内组织DNA进行尼龙膜快速转移和HBV DNA杂交,结果检出HBV DNA分子状态里整合型15份、游离型31份、整合型合并游离型30份。其中12例乙型肝炎标本为经生物素探针杂交检测,结果全部检出游离型HBV DNA。还有3例乙型肝炎标本和2例其它肝炎标本为经重复杂交检测,即先用~(32)P探针杂交继去探针再用生物素探针杂交,结果乙型肝炎标本两次杂交HBV DNA都阳性,其它肝炎标本两次均阴性。阳性者表现为3.2kb和2.3kb电泳位置呈现杂交带,代表HBV之松弛环状和超螺旋状结构。由于两种探针各含不同序列,故结果可对待检基因进行初步序列分析。本实验表明,上述3项技术对临床医学研究有广泛的应用价值。     

一种生物素探针杂交技术

生物素标记的DNA探针由于其稳定、便宜及非放射性特点而日益受到重视。为提高生物素探针灵敏度,Gregersen等和chan等均做了较多工作。本文综合两者之所长,并作部分修改,建立了一套生物素探针标记、杂交及检测方法。 1 材料与方法     

生物素-链霉抗生物素蛋白硷性磷酸酶体系标记检测DNA探针

本室采用近年发展的生物素—链霉抗生物素蛋白体系检测特异互补的核酸序列,先经缺口翻译制备生物素DNA探针,分子杂交后,再与链霉抗生物素蛋白—生物素—硷性磷酸酶复合物反应和显色,检测限度约50pg靶DNA,并将其结果与~(35)S标记相同的探针进行了比较。     

DNA的生物素标记

非放射性标记探针的应用,对于推广基因诊断技术有重要意义。本文研究酶促和光促两法进行生物素标记DNA。以碱性磷酸酶偶联体系检测两法得到的生物素探针及其分子杂交产物,显色灵敏度近1pg,杂交灵敏度达5pg,而5～10×10~5倍的无关DNA没有或痕量非特异性显色。表明此两种生物素标记探针以及所使用的分子杂交和显色体系皆可用于病毒或真核基因的分析和检测。     

聚合酶链反应结合DNA探针杂交在结核杆菌检测中的应用

应用PCR和Southern转移、光敏生物素标记DNA探针杂交技术进行了结核杆菌检测的应用研究。实验结果表明PCR结合探针杂交可将PCR敏感性提高100倍,但不影响其特异性。106例结核性痰标本PCR检测阳性率为46.2％,结合探针杂交达76.4％,涂片阴性的标本差异尤为明显,因而显著提高了结核阳性诊断变率。21例非结核性痰标本PCR和探针杂交未发现假阳性。对临床可疑而PCR阴性标本有必要合用DNA探针杂交。     

生物素标记DNA探针的研制(简报)

目前国内外应用核酸分子杂交技术检测外源基因以诊断病毒等微生物的感染,探测内源基因的多态性和缺陷以诊断遗传病和研究肿瘤。其中基因探针(即DNA探针)是关键,常用~32P放射性同位素标记DNA作探针。由于~32P脱氧核苷三磷酸半衰期短、价钱昂贵、主要依靠进口、以及保存和防护运输等原因,使基因诊断技术不能广泛应用。本文参考国外经验,用生物素标记的DNA作探针巳获得成功. 生物素标记的DNA是已知片断,例如作者用生物素标记HBV-DNA及Y染色体特异的DNA等.标记方法既采用传统的缺口平移法,以Bio-ll-duTP(BRL公司产品)为标记底物,标记双链DNA还     

光敏生物素和~(32)P标记DNA打点杂交检测钩端螺旋体

应用光敏生物素和~(32)P标记黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体DNA(简称017DNA)作为探针,打点杂交检测问号状钩体。结果表明:两种探针均能检测不同群、型的问号状钩体DNA,最小检测量分别为5pg和1pg;与双曲钩体patoc型PatocⅠ株、细螺旋体属illini型3055株及其他致病菌和正常人血清未发现明显杂交信号。提示光敏生物素制备的017DNA探针可以用于检测钩体,也可应用于钩体病的早期诊断和流行病学调查。     

应用探针微孔板杂交技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

寻找一种检测孕妇血浆中胎儿DNA新方法.采用SRY探针微孔板杂交法,通过PCR产物与SRY探针杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值.结果发现探针微孔板杂交检测法的灵敏性和特异性均高于电泳检测方法.提示探针微孔板杂交检测技术的灵敏性和特异性较高,更适用于临床应用.     

再生障碍性贫血患者端粒及端粒酶活性的变化

目的观察再生障碍性贫血（aplasticanemia,从）患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）端粒长度及端粒酶活性的变化,探讨AA的发病机制及治疗的新靶点。方法选取2010—09／2013—03月5所医院血液科确诊的71例AA患者,男性36例,女性35例,年龄12-82（39．48±18．78）岁,根据2009年英国再生障碍性贫血诊疗指南分组,其中非重型再生障碍性贫血（non-severeaplasticanemia,NSAA）组35例,重型再生障碍性贫血（severeaplasticanemia,SAA）组26例,极重型再生障碍性贫血（verysevereaplasiaanemia,VSAA）组10例。同时选取性别、年龄与之匹配的34例门诊健康体检者作为正常对照组,其中男性17例,女性17例,年龄10-73（40．68±19．00）岁。于初诊时留取外周血标本3ml。分别采用流式荧光原位杂交法（flow-fluorescenceinsituhybridization,Flow-FISH）检测PBMC端粒长度,端粒重复序列扩增技术（telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP）一多聚酶链式反应（poly—merasechainreaction,PCR）-酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）法检测其端粒酶活性。结果①不同性别者外周血端粒长度无明显差别（t=0．548,P=0．585）。②外周血端粒长度与年龄呈负相关（b=-0．387,P=0．001）,不同组间比较,正常对照组端粒长度随年龄增长下降幅度要稍大于NSAA和SAA＋VSAA组,NSAA、SAA＋VSAA组端粒随年龄的变化趋势一致。③控制年龄对外周血端粒长度的影响,多重比较发现NSAA、SAA＋VSAA组外周血端粒长度均显著短于正常对照组（P均〈0．001）。④随机选取NSAA组23例,SAA＋VsAA组28例,性别年龄与之匹配的34例正常对照组检测端粒酶活性,34例正常对照组中阳性6例（17．6％）,23例NSAA组中阳性11例（47．8％）,28例SAA＋VSAA组中阳性21例（75．O％）。3诊断组外周血酶活性阳性率有统计学差别（x^2=20．555,P〈O．001）。⑤各诊断组年龄和性别对端粒酶活性无明显影响,多重比较示SAA＋VSAA组（P〈0．001）、NSAA组（P=0．002）端粒酶活性均显著高于正常对照组。结论再生障碍性贫血患者PBMC端粒长度缩短,端粒酶活性增高,端粒及端粒酶可能成为再障治疗的新靶点。     

阿尔茨海默病患者体内端粒长度与氧化应激关系

目的探讨阿尔茨海默病（Alzheimers′disease,AD）患者与脂质过氧化应激相关的端粒长度变化。方法 40名AD患者,59名年龄相当的正常对照。分别测定所有受试者尿液中8-异前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2alpha,8-iso-PGF2α）的浓度,外周血单核细胞端粒长度,包括端粒平均长度与端粒长度分布。结果 AD患者尿8-iso-PGF2α的水平明显高于对照组,（71.68±2.60）ng/mmol vs（46.90±1.88）ng/mmol creatinine（P〈0.001）,端粒平均长度差异无统计学意义,但稍长端粒（4.4-9.4kb）比例明显增加,短端粒（〈4.4kb）比例减少。结论 AD患者体内氧化应激较对照组增高;端粒长度分布呈现氧化应激相关的变化,最短端粒对氧化应激更敏感。     

三种超声途径测宫颈长度预测早产的对比分析

目的：探讨超声测宫颈长度预测早产的临床意义,并对经腹、经阴道与经会阴三种超声途径测宫颈长度预测早产进行比较。方法对2012年1月至2013年12月有先兆早产征象来本院就诊的孕妇（840例）行超声测宫颈长度预测早产,按不同测量宫颈长度途径分为3组,每组280例,经腹测量宫颈长度（Ⅰ组）、经阴道测量宫颈长度（Ⅱ组）、经会阴测量宫颈长度（Ⅲ组）,记录宫颈长度（ CL ）,追踪妊娠结局,并对三种测量方法进行比较。结果Ⅰ组孕妇接受率为100％（280/280）,宫颈实现率为85.0％（238/280）,CL＜3 cm组早产率为48.6％（18/37）,CL≥3 cm组早产率为17.9％（36/201）,CL＜3 cm预测早产敏感性为33.3％（18/54）;Ⅱ组孕妇接受率为81.8％（229/280）,宫颈实现率为98.7％（226/229）,CL＜3 cm组早产率为37.8％（28/74）,CL≥3 cm组早产率为13.2％（20/152）,CL＜3 cm预测早产敏感性为58.3％（28/48）;Ⅲ组孕妇接受率为99.3％（278/280）,宫颈实现率为98.2％（273/278）,CL＜3 cm组早产率为37.1％（33/89）,CL≥3 cm组早产率为13.6％（25/184）,CL＜3 cm预测早产敏感性为56.9％（33/58）。三组CL＜3 cm组早产率（48.6％,37.8％,37.1％）均明显高于CL≥3 cm组早产率（17.9％,13.2％,13.6％）,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。Ⅱ组孕妇接受率（81.8％）明显低于Ⅰ组（100％）和Ⅲ组（99.3％）,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。Ⅰ组宫颈实现率85％明显低于Ⅱ组98.7％和Ⅲ组98.2％,差异有统计学意义（ P ＜0.05）;Ⅰ组CL＜3 cm预测早产敏感性33.3％,明显低于Ⅱ组（58.3％）和Ⅲ组（56.9％）,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。结论超声测宫颈长度预测早产有较大临床意义,相比之下经会阴途径更具优势,值得推广。     

宫颈上皮内瘤变石蜡标本 hTERC 基因检测与高危型人乳头瘤病毒分型测定的临床意义

目的：探讨宫颈上皮内瘤变石蜡标本中人染色体端粒酶基因（ hTERC）表达情况及其与高危型人乳头瘤病毒测定的临床意义。方法收集2009年10月至2012年10月湖北民族学院附属民大医院及暨南大学附属第一医院148例宫颈石蜡组织标本,其中对照组20例（正常宫颈）,研究组128例（ CINⅠ级30例,CINⅡ级53例,CINⅢ级45例）。应用荧光原位杂交（ FISH）技术检测其hTERC基因的表达并采用凯普HPV－DNA分型测定上述受试者高危型人乳头瘤病毒感染情况。结果（1）随着宫颈病变级别增高,hTERC基因阳性表达率增加。不同级别宫颈上皮内瘤变hTERC基因扩增率与正常对照组比较,差异有显著统计学意义（χ^2＝63．707,P ＜0．05）; CINⅡ级及以上病变的hTERC基因扩增率明显高于CINⅠ级,差异有显著统计学意义（χ^2＝36．973,P＜0．05）。（2）受试者中高危型HPV感染阳性率为74．3％（110／148）,高危型HPV感染阳性组hTERC基因扩增率和阴性组相比较,差异具有统计学意义（χ^2＝26．9,P＜0．05）。结论宫颈上皮内瘤变组织中hTERC基因扩增与HPV感染具有一定相关性。     

异氟烷对血管性痴呆老年大鼠学习记忆的影响

目的研究不同浓度异氟烷麻醉后对血管性痴呆（vascular dementia,VaD）老年大鼠学习记忆的影响。方法采用四血管法（4-VO）制作VaD老年大鼠模型,60只SD老年大鼠,雌雄各半。根据模型大鼠吸入异氟烷后开始实验的天数（1天和7天）和吸入浓度（0、1．5％、2．0％）分为6组,即：1天未吸入异氟烷组（Ⅰ1,0）,1天1．5％异氟烷组（Ⅰ1,1.5%）,1天2％异氟烷组（Ⅰ1,2%）,7天未吸入异氟烷组（Ⅰ7,0）,7天1．5％异氟烷组（Ⅰ7,1.5%）,7天2％异氟烷组（Ⅰ7,2%）。吸入异氟烷后在第1天和第7天分别进行Morris水迷宫测试,每天8次,连续5天。以定位航行实验中到达平台的潜伏期作为学习成绩,以空间探索实验中在1min内通过平台位置的次数作为记忆成绩。结果吸入1．5％和2％异氟烷1天后痴呆模型大鼠的定位航行实验和空间探索实验的成绩均明显低于未吸入异氟烷组大鼠,其中吸入2％异氟烷大鼠的成绩最差（P〈0．05）。吸入不同浓度的异氟烷7天后,各组大鼠定位航行实验和空间探索实验的成绩没有明显差异（P〉0．05）。结论异氟烷可以使VaD老年大鼠学习记忆能力进一步下降,但这种作用是短期的。     

首参颗粒对动脉粥样硬化大鼠血管细胞与外周血白细胞端粒和端粒酶的影响

目的：观察补肾中药复方首参颗粒对动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）模型大鼠血管细胞与外周血白细胞端粒、端粒酶以及动脉壁病变、血脂的影响,探讨其作用机制。 方法：40只Sprague-Dawley大鼠,随机分为正常组、模型组、中药组和西药组;采用一次性腹腔注射维生素D3及连续饲喂高脂饮食的方法建立AS模型。模型组大鼠用双蒸水灌胃,中药组以首参颗粒灌胃,西药组以普伐他汀灌胃。12周后,苏木精和伊红染色观察腹主动脉髂动脉病理变化,生物化学比色法检测血清总胆固醇（total cholesterol, TC）、三酰甘油（triacylglycerol, TAG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）水平,荧光定量聚合酶链反应法检测外周血白细胞及血管细胞的端粒长度及端粒酶活性。 结果：与模型组比较,中药组大鼠动脉壁的粥样硬化病变明显改善,血清TC、LDL-C水平及TC/HDL-C比值显著降低（P〈0.01）,血管细胞与外周血白细胞的端粒酶活性明显提高（P〈0.05或P〈0.01）,血管细胞与外周血白细胞的端粒长度延长,与正常组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。 结论：补肾中药复方首参颗粒具有改善大鼠AS的作用,其机制可能与调控血管细胞端粒长度及端粒酶活性,改善血管细胞老化相关。     

简便的生物素标记探针与石蜡组织切片DNA－DNA原位杂交技术

以生物素标记的ＥＢ病毒Ｗ片段为探针，亲和素为检测手段，探索了在常规石蜡切片标本中检测ＥＢ病毒ＤＮＡ的原位分子杂交技术。通过简化标本杂交前的处理过程，较好地保持了细胞的形态，增加了信号定位的准确性。针对生物素检测系统存在非特异性信号的缺点，提出并强调了设立相邻切片无探针对照的必要性。     

脐血瘦素、脂联素及IGF-Ⅰ与胎儿生长发育的初步研究

目的旨在揭示脐血脂联素、瘦素及胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）与胎儿生长发育的关系,探讨其在胎儿生长发育方面的相互作用及临床意义。方法采用放射免疫法测定86例新生儿脐血脂联素、瘦素、IGF-Ⅰ水平,根据胎龄及出生体质量百分位数的关系分为：SGA组16例,AGA组41例及LGA组29例,同时测量新生儿的出生体质量、身长、头围、足长、胎盘重量并计算体重指数（BMI）。结果脐血瘦素、脂联素及IGF-Ⅰ水平均LGA组〉AGA组〉SGA组。脐血脂联素水平与出生体质量、胎盘重量、BMI水平均呈正相关（P均〈0．05）。脐血瘦素及IGF-Ⅰ水平分别与新生儿出生体质量、身长、头围、足长、BMI及胎盘重量呈显著正相关（P〈0．01）,脐血瘦素与脂联素、IGF-Ⅰ水平亦呈显著正相关（P〈0．01）。脐血瘦素、脂联素水平与新生儿性别及分娩方式间均差异无统计学意义（P〉0．05）;脐血IGF-Ⅰ水平与新生儿性别差异无统计学意义（P〉0．05）,与新生儿分娩方式差异有统计学意义（P〈O．05）。结论脐血瘦素、脂联素、IGF-Ⅰ在调节胎儿生长发育方面起着重要作用,参与胎儿的生长发育过程,可作为评价胎儿生长发育及营养状态的临床指标之一。脐血瘦素、IGF-Ⅰ水平异常可能是引起胎儿宫内生长迟缓和巨大儿发生的原因之一。     

雌激素受体2基因多态性与青年胃腺癌的关联分析

目的探讨雌激素受体2基因（ESR2）多态性与盐城地区青年胃腺癌的关联。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术,对盐城地区100例青年胃腺癌患者（胃腺癌组）和100名青年胃溃疡患者（对照组）ESR2第5外显子RsaⅠ酶切多态和第8外显子AluⅠ酶切多态进行分析。结果（1）ESR2第8外显子AluⅠ酶切多态分析表明,胃腺癌组A等位基因频率明显高于对照组（P〈0.05,OR=1.975）,胃腺癌组含等位基因A的Aa＋AA基因型频率也明显高于对照组（P〈0.05,OR=2.144）;（2）两组ESR2第5外显子RsaⅠ酶切多态基因型rr、Rr、RR频率和等位基因r、R频率的比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论ESR2第8外显子AluⅠ多态可能与盐城地区青年胃腺癌易感性有关,含等位基因A的Aa和AA基因型可能增加青年胃腺癌发病风险;而ESR2第5外显子RsaⅠ多态与盐城地区青年胃腺癌发病风险无关联。     

FISH技术检测宫颈上皮细胞中hTERC基因扩增的临床研究

目的：应用荧光原位杂交技术（FISH）检测人类染色体末端酶hTERC在宫颈上皮脱落细胞中的扩增,研究hTERC基因在不同程度宫颈病变的表达及临床意义。方法：采用TCT低渗制片法,FISH检测15例宫颈良性病变、27例宫颈上皮内瘤变（CINⅠ14例、CINⅡ8例、CINⅢ5例）、37例浸润性子宫颈鳞癌（SC）、4例子宫颈腺癌以及13例人乳头瘤病毒（HPV）阳性妇女的宫颈脱落细胞中hTERC基因的表达。结果：FISH检测宫颈上皮脱落细胞hTERC基因异常扩增率43.62%（41/94）;在宫颈良性病变、宫颈上皮内瘤变、SC、宫颈腺癌以及HPV阳性各组中发生hTERC基因异常扩增的百分比例分别为6.67%、11.11%、83.78%、100%、15.38%;CIN组hTERC基因异常中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ（包括原位癌）分别占7.69%、12.5%、20.0%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：hTERC基因扩增随宫颈疾病程度加重递增,CIN组中随级别增高其阳性表达率亦明显增加;FISH检测hTERC基因异常扩增可能有助于早期宫颈疾病的筛查,并有望对宫颈病变的进展及评估预后等提供新方法。